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1、(10)授权公告号 CN 102827837 B (45)授权公告日 2014.03.12 CN 102827837 B (21)申请号 201210298883.X (22)申请日 2012.08.21 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 顾兴芳 张圣平 苗晗 王烨 董邵云 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 张涛 张圣平等 . 黄瓜果实苦味基因 Bt 的初步定 位 .园艺学报 .2011,。
2、 第 38 卷 ( 第 4 期 ), 第 709716 页 . 任毅 . 黄瓜高密度 SSR 遗传图谱构建及其应 用 .中国优秀硕士论文全文数据库 农业科技 辑 .2009,( 第 10 期 ),D48-63. Harry et al.The Genes of Pumpkin and Squash.HORTSCIENCE .2005, 第 40 卷 ( 第 6 期 ), 第 1620-1630 页 . (54) 发明名称 黄瓜嫩果白色果皮基因 w 连锁的 SSR 标记及 其应用 (57) 摘要 本发明 “黄瓜嫩果白色果皮基因w连锁的SSR 标记及其应用” ， 涉及生物技术辅助育种领域。黄 瓜嫩。
3、果白色果皮 w 紧密连锁的 SSR 标记， 序列如 下 ： SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAAC TCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG。其扩增的特 征条带如 Seq ID No.1 所示 （219bp）和 Seq ID No.2 所示 （243bp） ； 采用本发明获得的 SSR 标记， 可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行嫩果白 色果皮材料的筛选， 具有高效、 限制少的优点， 为 选育白色果皮黄瓜提高了效率， 缩短了育种周期。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马骞 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2。
4、 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102827837 B CN 102827837 B 1/1 页 2 1. 黄瓜嫩果白色果皮基因 w 连锁的 SSR 标记， 所述 SSR 标记的引物的核苷酸序列如下 所示 ： SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG， 所述 引物扩增的特征条带的核苷酸序列如 Seq ID No.4 所示。 2.权利要求1所述的SSR标记在筛选具有嫩果白色果皮基因w。
5、的黄瓜种质资源中的应 用， 其步骤如下 ： （1） 采用所述 SSR 标记的引物对待选黄瓜品种的基因组 DNA 分别进行 PCR 扩增 ； （2） 对扩增结果进行凝胶电泳检测 ； （3） 从检测结果中筛选扩增出如 SEQ ID No.4 所示核苷酸序列的片段的材料。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 所述 PCR 反应体系为 :7.5ng DNA， 正向和反向引物各 50ng， 5L Go Green Master Mix， 加双蒸水至 10ul。 4.根据权利要求2所述的应用， 所述PCR扩增程序为 ： 94预变性4分钟 ； 94变性15 秒， 55退火 15 秒， 72延伸 30 秒，。
6、 35 个循环 ； 72保温 5 分钟， 16保存。 5. 根据权利要求 2 4 任一所述的应用 ： 所述凝胶电泳检测指采用 6的非变性聚丙 烯酰胺凝胶， 于 160V 恒功率电泳分离， 最后银染显色。 权 利 要 求 书 CN 102827837 B 2 1/5 页 3 黄瓜嫩果白色果皮基因 w 连锁的 SSR 标记及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术辅助育种， 特别是黄瓜嫩果白色果皮基因 w 连锁的 SSR 标记 及其在黄瓜种资选择中的应用。 背景技术 0002 黄瓜 （Cucumis sativus L.） 是世界十大蔬菜之一， 因其风味清香、 口感脆爽， 深受 各国消费者的。
7、喜爱。随着消费水平的提高， 人们对黄瓜品质的重视程度与日俱增。品质育 种也已成为黄瓜育种的重点之一。黄瓜果实品质包括外观品质和内在品质。通常说的品质 性状主要指商品性即外观品质， 包括瓜色、 瓜长、 果刺、 果瘤、 果色均匀度、 光泽度等。 嫩果果 皮颜色作为重要的商品性状， 对商品销售影响很大。研究黄瓜嫩果果皮颜色的遗传规律及 分子标记具有重要的现实意义。 0003 有关控制黄瓜嫩果果皮颜色的基因， 已报道有 w（白色果皮） 、 DG（深绿色果皮） 、 dg（绿色果皮） 、 黄绿色果皮 （yg） 、 D（暗色果皮） （Pierce and Wehner,1990;Wehner and Sta。
8、ub,1997; 顾兴芳等， 2005） 。前人对于嫩果果皮颜色的遗传规律进行了多项研究。 Cochran（1938） 报道嫩果果皮白色 （w） 隐性于绿色。Youngner（1952） 认为嫩果黄绿色果 皮性状由 yg 控制， yg 对控制果皮呈深绿色的基因表现为隐性， 对控制果皮颜色呈浅绿色的 基因表现为上位性。孙晓丹等 （2011） 研究表明， 控制嫩果白色果皮的基因 （w） 对控制嫩果 果皮绿色的基因 （yg） 为隐性， 且w与其它修饰基因存在互作， 互作类型为隐性上位。 孙晓丹 等 （2011） 同时还研究了 w 与其它性状之间的遗传关系， 发现 yg， w， Tu（果瘤） 及 Se。
9、（shape of fruit end， 暂命名） 之间的遗传关系为独立遗传。 0004 对于黄瓜果皮颜色分子水平的研究不多， 李亚利 （2008）以 WD3B-2-2 构建了 F2 群体， 采用 BSA 法结合 SRAP 分子标记技术， 找到黄瓜果皮绿色性状相关的分子标记 ME9EM1-309 和 ME8EM14-425， 遗传距离分别为 6cM 和 8.3cM。也有研究者用 AFLP 分子标记 研究黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律， 找到了与w连锁的2个AFLP标记， E43M61和E34M59， 遗传距离分别为 5.2cM 和 5.6cM（孙晓丹， 2011） 。 0005 本试验以嫩果绿色。
10、果皮自交系 04796（P1） 和嫩果白色果皮自交系白叶三 （P2） 为 亲本构建 F2 和回交群体， 通过对 6 世代群体的表型鉴定， 对黄瓜嫩果果皮白色基因 w 进行 了遗传规律分析。以 F2 群体为作图群体， 利用 BSA 法和 SSR 技术， 实现 w 基因的染色体定 位， 并获得紧密连锁标记。本试验不仅为黄瓜嫩果果皮白色基因 w 的精细定位和分子克隆 奠定基础， 同时也为利用分子标记辅助选育白色果皮黄瓜新品种提供理论依据。 发明内容 0006 本发明基于上述领域的空白， 提供了与嫩果白色果皮基因w连锁的SSR标记， 并提 供了其在选择有白色果皮黄瓜种质资源上的应用， 为黄瓜嫩果白色果。
11、皮基因 w 的精细定位 和分子克隆奠定基础， 可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行白色果皮的筛选， 具有高 效、 限制少、 准确的优点， 为利用分子标记辅助选育黄瓜白色果皮品种提供实用、 高效的途 说 明 书 CN 102827837 B 3 2/5 页 4 径。 0007 黄瓜嫩果白色果皮 w 紧密连锁的 SSR 标记， 序列如下 ： 0008 SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG 其扩增的特征条带如 Seq ID No.1 所示 （219bp） 和 Seq ID No.2 所示 （243bp。
12、） ； 0009 与果实嫩果绿色果皮 W 连锁的片段如 SEQ ID No.1 所示 ：（219bp） 0010 TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGGTTAGTTATTCTTCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCT TTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTACCTTTACCTTTATACTTCATCTTTGGTTTAAAAAGTATCCATTG CAATATTATTCTTACCGTTCATAAGTATTTGTAAACTACCATTTGGAGTAGAACTCAGGACAACCAAACACCA 0011 与果实嫩果白色果皮 w 连锁的片。
13、段如 SEQ ID No.2 所示 ：（243bp） 0012 TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGGTTAGTTATTCTTCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCT TTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTACCTTTACCTTTATACTTCAT CTTTGGTTTAAAAAGTATCCATTGCAATATTATTCTTACCGTTCATAAGTATTTGTAAACTACCATTTGGAGTAGAA CTCAGGACAACCAAACACCA 0013 上述 SSR 标记在筛选具有嫩果。
14、白色果皮基因 w 的黄瓜种质资源中的应用， 其步骤 如下 ： 0014 （1） 采用上述 SSR 标记为引物对待选黄瓜品种的基因组 DNA 分别进行 PCR 扩增， 0015 （2） 对扩增结果进行凝胶电泳检测 ； 0016 （3） 从检测结果中筛选扩增出如 SEQ ID No.2 所示的片段的材料。 0017 所述 PCR 反应体系为 :7.5ng DNA， 正向和反向引物各 50ng， 5L GoGreen MasterMix， 加双蒸水至 10ul。 0018 所述PCR扩增程序为 ： 94预变性4分钟 ； 94变性15秒， 55退火15秒， 72延 伸 30 秒， 35 个循环 ； 7。
15、2保温 5 分钟， 16保存。 0019 所述凝胶电泳检测 ： 指采用 6的非变性聚丙烯酰胺凝胶， 于 160V 恒功率电泳分 离， 最后银染显色。 0020 本试验以黄瓜嫩果果皮绿色自交系 04796（P1） 和嫩果果皮白色自交系白叶三 （P2） 为亲本构建 F2和回交群体， 通过对 6 世代群体的表型鉴定， 对嫩果果皮白色基因 w 进 行了遗传规律分析。 再以F2群体为作图群体， 利用BSA法筛选到与w连锁的标记SSR06791， 与 w 的遗传距离为 8.6cM。 0021 通过用用不同遗传背景的其它 30 份材料验证， 标记的准确率达 80%。 0022 本试验不仅为黄瓜嫩果果皮白色基。
16、因 w 的精细定位和分子克隆奠定基础， 同时也 为利用分子标记辅助选育白色果皮黄瓜新品种提供理论依据。 附图说明 0023 图 1. 是 SSR 标记 SSR06791 对黄瓜亲本材料 04796， 白叶三， F1 世代单株及 F2群 体随机单株的检测结果 ； 0024 其中 ： P1:04796（果皮绿色） ； P2: 白叶三 （果皮白色） 。 具体实施方式 0025 材料与方法 说 明 书 CN 102827837 B 4 3/5 页 5 0026 本研究所用的试验材料为 04796 （P1） 、白叶三 （P2） 。 0027 04796 是由优良杂交种津优 1 号多代自交定向选育而成的高。
17、代自交系， 果皮深 绿色， 刺瘤密， 刺白色， 果瘤小。现有已知品种， 在顾兴芳等在 中国蔬菜 2008 年第 6 期发 表的文章 耐热黄瓜新品种中农 106 号的选育 一文中也有记载， 本实验室有保存， 保证自 申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。 0028 白叶三 是国内优良地方品种白叶三中筛选出的纯系， 果皮白色， 刺瘤稀少， 刺白 色， 果瘤较大。现有已知品种， 在张占军在 甘肃农业科技 2008 年第 12 期发表的文章 9 个白皮黄瓜品种在陇东的引种对比试验结果 一文中也有记载， 本实验室有保存， 保证自申 请日起二十年内向公众发放用于验证实验。 0029 SSR 引物来自国际。
18、黄瓜基因组计划 （CUGI） ， 共 2112 对 （Ren et al.， 2009） 。详细 结果可以参见Ren等在PloS One 2009年第4期在线发表的文章 An Integrated Genetic and Cytogenetic map of the cucumber Genome 。 PCR实验使用Shang hai Promega公司 的 GoTaq Green Master Mix ； 凝胶电泳使用盈信阳光公司的 40% 非变性聚丙烯酰胺， 将其 稀释至 6% 后使用。 0030 实施例 1. 黄瓜果果皮白色基因 w 连锁 SSR 标记的筛选 0031 步骤 1. 黄瓜果。
19、皮颜色性状鉴定 0032 试验于 2008-2009 年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地进行， 以 04796 （P1） 和白叶三 （P2） 为父母本进行正反交、 自交、 回交， 获得 F1、 F2及 BC1P1、 BC1P2群体。 0033 2009 年春季在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验大棚中种植 P1、 P2和 F1、 F1 各 10 株， F2189 株， BC1P178 株， BC1P280 株。株距 25cm， 行距 55cm， 按常规田间管理。 0034 在开花结果期， 调查六世代群体各单株上商品瓜 （开花后 710d） 的果皮颜色。 0035 在种植的六世代群体中， 调。
20、查果皮颜色的性状表现， 计算分离比， 使用 Microsoft Excel2003 软件进行数据统计分析， 使用 SAS8.0 对结果进行卡方测验。 0036 结果显示 ： 无论正反交后代 F1果皮均表现为绿色 ； 在 F2群体中， 绿色果皮与白色 果皮植株的分离比例经卡方测验符合3:1以04796为回交亲本的回交群体全部表现为果皮 绿色， 而与另一亲本白叶三回交获得的回交群体中， 果皮绿色与果皮白色的比例为 1:1。由 此可知， 嫩果果皮白色性状是由 1 对核基因控制的， 并将该基因命名为 w， 果皮绿色 （W） 对果 皮白色 （w） 为显性。 0037 步骤 2.DNA 提取和 SSR 分。
21、析 0038 取黄瓜植株的嫩叶， 用改良的 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵） 法提取亲本及群体 各单株的基因组 DNA。 0039 PCR 反应体系为 : 总反应体系 10L,3L DNA（2.5ng L-1） ， 正向和反向引物 （50ngL-1） 各 1L， 5L GoGreen Master Mix（Promega 公司产品） 。引物使 用黄瓜全基因测序开发的 SSR 引物 （Ren et al.， 2009 ； Cavagnaro et al.， 2010） 。PCR 扩 增程序为 ： 94预变性 4min ； 94变性 15s， 55退火 15s， 72延伸 30s， 35 个循环 。
22、； 72 保温 5min， 16 forever。扩增产物用 6.0% 非变性聚丙烯酰胺凝胶分离， 电泳缓冲液为 0.5TBE， 150V 恒功率电泳分离 1.5h， 电泳后银染显色， 统计带型。 0040 步骤 3.SSR 标记筛选、 数据统计及连锁图构建 0041 主要包括 4 步 ：（1） 筛选在父母本间表现多态的 SSR 标记 ；（2） 在 F2 群体中选取 说 明 书 CN 102827837 B 5 4/5 页 6 果皮绿色、 果皮白色单株的 DNA 各 7 个， 根据 BSA 法构建果皮绿色， 白色 2 个近等基因池， 用池筛选多态性引物 ；（3） 利用获得的多态性引物分析 F2。
23、 群体各单株基因型 ；（4） 利用 JoinMap4.0 软件进行连锁图的绘制。 0042 共显性标记的统计方法 ： 与母本 （04796） 一致的带型记为 a， 与父本 （白叶三） 一致 的带型记为b， 杂合的带型记为h。 显性标记的统计方法 ： 若母本为显性标记， 则分离群体中 和母本带型一致的单株记为 d， 和父本带型一致的记为 b ； 若父本为显性标记， 则分离群体 中和母本带型一致的单株记为 a， 和父本带型一致的记为 c， 未扩增出的或模糊不清的记为 u。 0043 结果显示 ： 0044 用 2112 对 SSR 引物对 P1(04796) 和 P2( 白叶三 ) 进行筛选， 其。
24、中在两个亲本间表 现多态的引物有 211 对， 多态率 10%。 0045 结合 BSA 法建池， 进一步筛选得到了 16 个 SSR 多态性标记。 0046 利用筛选出的多态性标记对04796白叶三组合的F2群体进行分析， 结合调查性 状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。 结果14个标记和w被定位在同一连锁群上 （LOD=10） ， 得到与 w 连锁的标记 SSR06791, 遗传距离为 8.6cM。将本试验得到的连锁图与已发表的黄 瓜遗传图谱 （Ren et al.， 2009 ； Miao et al， 2011） 比较， 发现本连锁群与第 3 染色体上共 有 12 个共有标记， 。
25、据此将 w 基因定位在第 3 染色体上。 0047 步骤 4. 标记 SSR06791PCR 扩增的差异条带的回收纯化及测序 0048 (1) 目的片段的回收 0049 采用煮沸法。具体操作为 ： 先从胶上将标记 SSR06791PCR 扩增的差异条带 2 条挖 下来装入 1.5mL 的 Eppendorf 管内， 向管内加入 100L 超纯水， 加水量视胶带颜色深浅而 定 ； 常温下浸泡 24h， 转入 95水浴锅 ( 或 PCR 仪 ) 中煮 30min 后， 5000rpm 离心 3min。产 物即可取上清 3L 做模板进行 PCR 扩增， 剩余产物置 -20保存备用。 0050 (2)。
26、 目的片段的纯化 0051 用 PCR 产物直接纯化方法。在 PCR 产物中加入 2 倍体积的无水乙醇， -20过夜放 置， 1,2000rpm 离心 5min 就可以得到纯化产物。 0052 (3) 目的片段与载体的连接 0053 反应体系为 10L ： PMD18-T Vector1.0L ； Ligation buffer 5.0L ； 目的片 段 4.0L。 0054 在超净工作台上加样， 混匀反应物， 暂短离心， 16连接约 1h， 过夜也不影响连接 效率。 0055 (4) 连接产物的转化 0056 1） 取出感受态细胞， SolutionA， SolutionB， 置于冰上融化 。
27、； 0057 2） 感受态 (50L)+5L SolutionA+4L SolutionB+46L 预冷去离子水 ； 0058 3） 用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到 1.5mL 离心管， 每管加入 105L， 再加 入 5L 的目的 DNA， 轻旋混匀 ； 0059 4） 42水浴热激 90s， 注意不要晃动离心管 ； 0060 5） 快速将管转移到冰浴中， 使细胞冷却 35min ； 0061 6） 加入 500L LB 液体培养基。在 37， 150rpm 摇床上预培养 1h ； 说 明 书 CN 102827837 B 6 5/5 页 7 0062 7） 将菌液涂布到含有 100g 。
28、mL-1Amp、 25g mL-1IPTG 和 40g mL-1X-GAL 的 LB 固体培养基上， 用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开， 置于室温直至液体被吸收 ； 0063 8） 倒置平板， 37培养 1216h。 0064 (5) 重组质粒的蓝白斑筛选 0065 经 37培养后， 在涂布 X-Gal/IPTG 的 LB 平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色 菌落， 其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的 LB 液体培养基中， 37， 150rpm 过夜培养。 0066 (6) 菌落 PCR 的检测 0067 吸取 1L 菌液作为模板进行 PCR 扩增。取 4L PCR。
29、 产物， 经 1.5% 琼脂糖凝胶电 泳检测， 与 PCR Marker 标准分子量相比较检测插入片段的大小， 与插入目的片段大小一致 的克隆即为阳性克隆。 0068 (7) 克隆后载体的测序与分析 0069 取 3 个阳性克隆菌液在甘油 （330L 甘油中加入 1000L 菌液） 中各保存两份， 一 份 -20保藏， 一份送去测序。测序结果如 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示。 0070 实施例 2.w 基因侧翼标记的验证 0071 利用 30 份不同果皮颜色类型的黄瓜材料对实施例 1 获得的与 w 基因连锁的侧翼 标记SSR06791进行验证， 以确定标记用于分子标。
30、记辅助选择的准确性 ： 这30份材料中有绿 色果皮材料 28 份， 白色果皮材料 2 份。经和所选材料的田间表现型相比， 标记在 30 份材料 中共有 24 份材料的带型反映的表型数据与田间调查结果一致， 经计算正确率为 80%。其中 2 份白色果皮材料均扩增出白色果皮特征条带。 0072 本研究中构建了黄瓜嫩果白色果皮基因的 SSR 连锁图， 所获得的 SSR 标记 （SSR06791） 与 w 的遗传距离 8.6cM， 这个与黄瓜白色果皮基因连锁的 SSR 标记为分子标记 辅助选择育种筛选黄瓜白色果皮新品种奠定了良好的基础。 为建立一套快速准确鉴定黄瓜 嫩果白色果皮的方法提供了理论依据。 说 明 书 CN 102827837 B 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102827837 B 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 102827837 B 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102827837 B 10 。