技术领域
本发明属于肿瘤学和干细胞学研究领域，涉及一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基及方法。
背景技术
淋巴转移是肿瘤转移的重要途径之一，也是肿瘤分期的重要内容和预后的重要因素，大量临床证据表明：头颈部鳞状上皮细胞癌最终通过多循淋巴通道转移，但迄今为止，关于瘤细胞如何进入淋巴管的确切机制尚不清楚。
目前有几种分子可以作为淋巴内皮细胞的标记物：①血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)，也称作fins样酪氨酸激酶4(flt4)；②淋巴内皮透明质酸受体一1(LYVE-1)，与CD44同源，除肝细胞表达外，被作为正常或肿瘤组织淋巴管内皮特异性标记物；③podoplanin除表达于淋巴管内皮及良、恶性血管源性肿瘤细胞，其他一些非上皮细胞也有表达；④Prox-1是同源异型盒转录因子基因产物，它与胚胎淋巴管芽的生长、延伸及淋巴管内皮细胞的表型改变密切相关。目前多单独或者联合应用VEGFR-3、LYVE-1标记淋巴管。
早期研究认为，肿瘤组织内无淋巴管存在，恶性肿瘤主要是通过肿瘤边缘正常组织内的毛细淋巴管进入淋巴系统，从而造成淋巴转移。后期的研究逐步证明了在肿瘤的内部是有淋巴管的，尤其是早期即发生淋巴转移的肿瘤。头颈部鳞状上皮细胞癌是容易发生早期淋巴结转移的典型疾病，80%的患者在确诊时已经发生了转移。因此头颈部鳞状上皮细胞癌是研究淋巴转移的最佳模型。
恶性肿瘤及其转移瘤难以根治的原因在于肿瘤细胞群体的生物学异质性。异质性是指肿瘤中的不同细胞亚群，在化疗的敏感性、生长速度、对细胞因子刺激的反应、转移能力等方面存在的差异。近年的研究结果表明，肿瘤组织存在肿瘤干细胞 (Cancer Stem Cells, CSC)。CSC是具有自我更新，自我复制能力的细胞，CSC对化疗药物和放射线治疗具有很强的耐受性，并且可以分化出不同表型的肿瘤细胞和间质细胞，重建肿瘤组织的异质性。多数头颈部SCC患者在发病的早期就有淋巴结转移，推测这种肿瘤组织中的毛细淋巴管应该不是来源于患者本身的淋巴管，因为在发病早期宿主淋巴管尚未迁移至肿瘤。因此，肿瘤组织中的毛细淋巴管很有可能源自具有分化能力的CSC。CSC在微环境的协同下分化为毛细淋巴管，为肿瘤的早期淋巴转移创造条件。
为了进行CSC向淋巴管分化实验，本发明提供了一种高效的、模拟体内环境的分化诱导方法和无血清分化诱导培养液，为深入研究肿瘤的淋巴转移提供有力的支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基。
本发明的另一目的在于提供一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的方法。
本发明还提供了诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基的制备方法。
本发明所采用的解决方案为：
一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，所述无血清培养基含有基础培养基、添加物，所述添加物含有的组分和用量为：
转铁蛋白 3.6～5.8mg/L、
β-巯基乙醇 0.52～0.88mg/L、
胰岛素 1.6～12.8mg/L、
牛血清白蛋白 450～600mg/L、
肝素钠 50～200μg/L、
血管内皮细胞生长因子C 20～100μg/L、
谷丙氨酸二肽400～460mg/L、
L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐9.5～12.5mg/L、
氨基乙醇0.48～1.1mg/L、
亚硒酸钠0.0017～0.002mg/L、
油酸88～126mg/L，
所述基础培养基含有的组分和用量为：
胸苷0.315～0.385mg/L、
葡萄糖 3000～3300mg/L、
次黄嘌呤1.88～2.2mg/L、
酚红钠 8.18～8.98mg/L、
所述基础培养基还含有如下组分和用量中的至少一种氨基酸：
谷丙氨酸二肽400～460mg/L、丙氨酸4～5mg/L、精氨酸134～155mg/L、天冬酰胺6.5～8.2mg/L、天冬氨酸6.5～7.5mg/L、半胱氨酸16.1～18.3mg/L、胱氨酸30～35mg/L、谷氨酸7.0～8.0mg/L、谷氨酰胺335～450mg/L、甘氨酸16～19mg/L、组氨酸31～33mg/L、异亮氨酸52.3～56.6mg/L、亮氨酸55.5～60mg/L、赖氨酸90.8～96.5mg/L、甲硫氨酸16.5～18.5mg/L、苯丙氨酸33.25～37 .75mg/L、脯氨酸16.5～18.5mg/L、丝氨酸24.8～27.6mg/L、苏氨酸51.25～55.45mg/L、色氨酸8.5～9.6mg/L、酪氨酸54.35～57.25mg/L、缬氨酸50.55～55.75mg/L，
所述基础培养基还含有如下组分和用量中的至少一种维生素：
生物素0.003～0.004mg/L、氯化胆碱7.8～9.5mg/L、叶酸2.2～2.76mg/L、肌醇11.28～13.46mg/L、腐胺0.078～0.082mg/L、泛酸钙1.9～2.3mg/L、盐酸吡哆醛1.9～2.2mg/L、盐酸吡多醇 0.03～0.033mg/L、核黄素0.2～0.25mg/L、盐酸硫胺1.9～2.3mg/L、维生素B12 0.6～0.72mg/L、烟酰胺1.9～2.1mg/L，
所述基础培养基还含有如下组分和用量中的至少一种盐类：
氯化钙110～120mg/L、氯化钠6800～7000mg/L、氯化钾280～320mg/L、磷酸二氢钠50.5～55.5mg/L、磷酸氢二钠70～75mg/L、丙酮酸钠200～230mg/L，
所述基础培养基还含有如下组分和用量中的至少一种微量元素：
硫酸铜0.001～0.0015mg/L、硝酸铁0.045～0.065mg/L、硫酸亚铁0.38～0.42mg/L、氯化镁58.2～62.8mg/L、硫酸镁48～51mg/L、硫酸锌0.4～0.5mg/L，
所述基础培养基还含有如下组分和用量中的至少一种脂类：
亚油酸0.038～0.044mg/L、硫辛酸0.098～0.146mg/L，
所述基础培养基还含有如下组分和用量中的至少一种缓冲液：
碳酸氢钠1900～2300mg/L、HEPES 4553.6～4868.2mg/L。
优选的，诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，其组分和用量为：
转铁蛋白 3.6～5.8mg/L、
β-巯基乙醇 0.52～0.88mg/L、
胰岛素 1.6～12.8mg/L、
牛血清白蛋白 450～600mg/L、
肝素钠 50～200μg/L、
血管内皮细胞生长因子C 20～100μg/L、
谷丙氨酸二肽400～460mg/L、
L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐9.5～12.5mg/L、
氨基乙醇0.48～1.1mg/L、
亚硒酸钠0.0017～0.002mg/L、
油酸88～126mg/L、
胸苷0.315～0.385mg/L、
葡萄糖 3000～3300mg/L、
次黄嘌呤1.88～2.2mg/L、
酚红钠 8.18～8.98mg/L，
所述无血清培养基还含有如下组分和用量的氨基酸：
丙氨酸4～5mg/L、精氨酸134～155mg/L、天冬酰胺6.5～8.2mg/L、天冬氨酸6.5～7.5mg/L、半胱氨酸16.1～18.3mg/L、胱氨酸30～35mg/L、谷氨酸7.0～8.0mg/L、谷氨酰胺335～450mg/L、甘氨酸16～19mg/L、组氨酸31～33mg/L、异亮氨酸52.3～56.6mg/L、亮氨酸55.5～60mg/L、赖氨酸90.8～96.5mg/L、甲硫氨酸16.5～18.5mg/L、苯丙氨酸33.25～37 .75mg/L、脯氨酸16.5～18.5mg/L、丝氨酸24.8～27.6mg/L、苏氨酸51.25～55.45mg/L、色氨酸8.5～9.6mg/L、酪氨酸54.35～57.25mg/L、缬氨酸50.55～55.75mg/L，
所述无血清培养基还含有如下组分和用量的维生素：
生物素0.003～0.004mg/L、氯化胆碱7.8～9.5mg/L、叶酸2.2～2.76mg/L、肌醇11.28～13.46mg/L、腐胺0.078～0.082mg/L、泛酸钙1.9～2.3mg/L、盐酸吡哆醛1.9～2.2mg/L、盐酸吡多醇0.03～0.033mg/L、核黄素0.2～0.25mg/L、盐酸硫胺1.9～2.3mg/L、维生素B12 0.6～0.72mg/L，烟酰胺1.9～2.1mg/L，
所述无血清培养基还含有如下组分和用量的盐类：
氯化钙110～120mg/L、氯化钠6800～7000mg/L、氯化钾280～320mg/L、磷酸二氢钠50.5～55.5mg/L、磷酸氢二钠70～75mg/L、丙酮酸钠200～230mg/L，
所述无血清培养基还含有如下组分和用量的微量元素：
硫酸铜0.001～0.0015mg/L、硝酸铁0.045～0.065mg/L、硫酸亚铁0.38～0.42mg/L、氯化镁58.2～62.8mg/L、硫酸镁48～51mg/L、硫酸锌0.4～0.5mg/L，
所述无血清培养基还含有如下组分和用量的脂类：
亚油酸0.038～0.044mg/L、硫辛酸0.098～0.146mg/L，
所述无血清培养基还含有如下组分和用量的缓冲液：
碳酸氢钠1900～2300mg/L、HEPES 4553.6～4868.2mg/L。
优选的，上述的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：
1) 将基础培养基组分溶于水中，混匀，pH调至 7.0～7.2，过滤，得基础培养基；
2) 将氨基乙醇、亚硒酸钠、β-巯基乙醇溶于PBS中，混匀，得添加物A；
3) 将牛血清白蛋白、油酸溶于PBS中，混匀，得添加物B；
4) 向基础培养基中加入添加物A和添加物B，混匀，得培养液C；
5) 向培养液C中添加胰岛素、转铁蛋白、肝素钠、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐，混匀，得培养液D；
6) 向培养液D中添加血管内皮细胞生长因子C（简称VEGF-C）、谷丙氨酸二肽，混匀，无血清培养基。
诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的方法，包括如下步骤：
1) 收集肿瘤干细胞，制成细胞悬液；
2) 将细胞悬液与基底膜提取物（BME）混合，添加上述的无血清培养基，在37℃，5%CO2环境下培养15～30天。
优选的，细胞悬液与基底膜提取物（BME）以1：3的体积比混合，其中，细胞悬液的细胞浓度为1×105～5×105个/mL，基底膜提取物（BME）的浓度为12～18mg/mL。
优选的，肿瘤干细胞为鳞状上皮细胞癌（Squamous Cell Carcinoma, SCC）干细胞。
优选的，肿瘤干细胞为头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞。
优选的，培养过程中，每隔2～4天换一次无血清培养基。
本发明所述的基础培养基是指含有细胞生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，可供大多数细胞生长。将基本营养物质溶解于无热源超纯水中（电阻率为18.2Ω），并将酸碱度调至 7.0～7.2，经过滤灭菌处理后，即为基础培养基。
本发明的无血清分化诱导培养液中添加有谷丙氨酸二肽。干细胞在分化过程中对能量的需求较高，谷丙氨酸二肽在培养液中比L-谷氨酰胺稳定，不仅可以持续为干细胞提供能量，而且可以避免因自然代谢而造成的有毒代谢物的积累。
本发明的无血清培养液中添加的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐是一种比维生素C更稳定的抗氧化剂，它在培养液中可以长时间保持活性，大大延缓肿瘤干细胞衰老的速度，且有助于为细胞提供一个稳定的微环境。
本发明的无血清培养液还添加了肝素钠，以促进细胞内细胞因子（如VEGF）的信号转导。
本发明的无血清培养液添加VEGF-C。VEGF-C在胚胎发育过程中发挥着重要作用，诱导淋巴新生并调控淋巴系统的形成。但目前尚没有关于肿瘤中是否存在淋巴新生的研究报道。VEGF-C可以在体外诱导肿瘤干细胞转分化为淋巴管为本发明关键。淋巴管诱导的创新主要体现在使用肿瘤干细胞，添加因子和支撑基质上，不同的因子以及浓度处理能得出不同的结果，同样支撑基质也是培养的关键。
本发明所述基底膜提取物（BME）是由Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)肿瘤经过纯化得到的可溶性基底膜蛋白产品，它能够在体外37℃条件下胶化重新形成基底膜。使用本发明的诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞转分化的方法，肿瘤干细胞培养后即可分化成为淋巴管样结构。
本发明的有益效果：
本发明的培养基不含血清，实验体系清晰、成份确定，有利于定向分化诱导，避免了不可知成份对干细胞所造成的随机分化。
本发明的无血清分化诱导培养液中添加了VEGF-C， 特定浓度和作用时间对诱导肿瘤干细胞向淋巴管的发育和形成过程中起着决定性作用。
本发明的诱导分化方法操作简便，不需对细胞进行复杂的处理，不会对细胞造成物理的、化学的损伤，适用范围广，尤其适用于鳞状上皮细胞癌干细胞向淋巴管内皮细胞诱导分化。
本发明的诱导分化方法能最大程度的诱导肿瘤干细胞向淋巴管分化，效率高，且不需使用N2或B27等商品化干细胞培养产品，降低价格成本。
本发明的诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化需要15～30天的时间， 避免了干细胞的衰老。
本发明的诱导分化方法中使用基底膜提取物（BME），BME可以为细胞提供立体生长的空间，同时可以模拟体内的微环境，具有促进细胞粘附生长和分化的作用。
附图说明
图1是实施例1诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图2是实施例2诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图3是实施例3诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图4是实施例4诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图5是实施例5诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图6为对比例1诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图7为对比例2诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图8为对比例3诱导SCC干细胞分化的镜下明场图像；
图9为实施例1诱导SCC干细胞分化的淋巴管标志物LYVE-1的免疫组化表达图；
图10为实施例2诱导SCC干细胞分化的淋巴管标志物LYVE-1以及鳞状上皮细胞标志物CK8/18的免疫荧光表达图；
图11为SCC细胞（左图）和SCC干细胞（右图）的对比图；
图12为SCC细胞和SCC干细胞的人胚胎干细胞标志基因的表达图；
图13为SCC细胞和SCC干细胞的克隆形成对比图；
图14为SCC细胞和SCC干细胞的脂肪细胞分化潜能对比图。
具体实施方式
一种用于诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，含有基础培养基、添加物，所述添加物包括转铁蛋白、β-巯基乙醇、胰岛素、牛血清白蛋白、肝素钠、生长因子VEGF-C、谷丙氨酸二肽、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、氨基乙醇、亚硒酸钠和油酸。
一种用于诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：
1) 将基础培养基组分溶于无热源纯水中，混匀，pH调至 7.0～7.2，过滤，得基础培养基；
2) 将氨基乙醇、亚硒酸钠、β-巯基乙醇溶于无热源PBS(磷酸盐缓冲液)中，混匀，PBS的加入量以恰好能溶解氨基乙醇、亚硒酸钠、β-巯基乙醇为宜，添加物A；
3) 将牛血清白蛋白、油酸溶于无热源PBS中，混匀，PBS的加入量以恰好能溶解牛血清白蛋白、油酸为宜，得添加物B；
4) 向基础培养基中加入添加物A和添加物B，混匀，得培养液C；
5) 向培养液C中添加胰岛素、转铁蛋白、肝素钠、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐，混匀，得培养液D；
6) 向培养液D中添加VEGF-C、谷丙氨酸二肽，混匀，得无血清培养基。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
头颈部鳞状上皮细胞癌细胞系购自ATCC，ATCC编号为： CRL-1628，细胞名称为SCC25；
基底膜提取物（BME）购自美国R&D Systems公司，商品名：Basement Membrane Extract，型号：Cultrex? BME *PathClear?，Catalog #:3432-005-02， BME的浓度为12～18mg/mL。
实施例1
一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，其各组分和用量如下表1：
诱导鳞状上皮细胞癌干细胞（SCC干细胞）向淋巴管内皮细胞分化的方法，包括如下步骤：
1) 收集头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞，用培养头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的培养液重悬制成细胞浓度为2×105～3×105个/mL的悬液；
2) 将头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞悬液与BME以1:3体积比混合，接种到96孔板中，每孔100μL，待BME凝固后，即与细胞的混合液由液态变成固态，添加实施例1的无血清培养基，在37℃，5%CO2环境下培养21天，每2～4天换一次无血清培养基。
实施例2
一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，其各组分和用量如下表2：
诱导鳞状上皮细胞癌干细胞（SCC干细胞）向淋巴管内皮细胞分化的方法，包括如下步骤：
1) 收集头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞，用培养头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的培养液重悬制成细胞浓度为1×105～2×105个/mL的悬液；
2) 将头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞悬液与BME以1:3体积比混合，接种到96孔板中，每孔100μL，待BME凝固后，即与细胞的混合液由液态变成固态，添加实施例1的无血清培养基，在37℃，5%CO2环境下培养30天，每2～4天换一次无血清培养基。
实施例3
一种诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，其各组分和用量如下表3：
诱导鳞状上皮细胞癌干细胞（SCC干细胞）向淋巴管内皮细胞分化的方法，包括如下步骤：
1) 收集头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞，用培养头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的培养液重悬制成细胞浓度为4×105～5×105个/mL的悬液；
2) 将头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞悬液与BME以1:3体积比混合，接种到96孔板中，每孔100μL，待BME凝固后，即与细胞的混合液由液态变成固态，添加实施例1的无血清培养基，在37℃，5%CO2环境下培养15天，每2～4天换一次无血清培养基。
实施例4
一种诱导SCC细胞系的肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，所述培养基由基础培养基DMEM/F12和添加物组成，所述添加物的各组分和用量如下表4：
诱导鳞状上皮细胞癌干细胞（SCC干细胞）向淋巴管内皮细胞分化的方法，包括如下步骤：
1) 收集头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞，用培养头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的培养液重悬制成细胞浓度为3×105～4×105个/mL的悬液；
2) 将头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞悬液与BME以1:3体积比混合，接种到96孔板中，每孔100μL，待BME凝固后，即与细胞的混合液由液态变成固态，添加实施例1的无血清培养基，在37℃，5%CO2环境下培养25天，每2～4天换一次无血清培养基。
实施例5
一种将患者组织中培养出的SCC细胞的肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的无血清培养基，所述培养基由基础培养基DMEM/F12和添加物组成，所述添加物的各组分和用量如下表5：
诱导鳞状上皮细胞癌干细胞（SCC干细胞）向淋巴管内皮细胞分化的方法，包括如下步骤：
1) 收集头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞，用培养头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的培养液重悬制成细胞浓度为3×105～4×105个/mL的悬液；
2) 将头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞悬液与BME以1:3体积比混合，接种到96孔板中，每孔100μL，待BME凝固后，即与细胞的混合液由液态变成固态，添加实施例1的无血清培养基，在37℃，5%CO2环境下培养20天，每2～4天换一次无血清培养基。
对比例1
无血清培养基，其各组分及用量同实施例1基本相同，将实施例1的无血清培养基中的人VEGF-C组分去掉，其余组分及用量同实施例1完全相同。诱导鳞状上皮细胞癌干细胞向淋巴管内皮细胞分化的方法，同实施例1。
对比例2
无血清培养基，其各组分及用量同实施例1基本相同，将实施例1的无血清培养基中的人VEGF-C组分替换为人VEGF-A，用量不变，其余组分及用量同实施例1完全相同。诱导鳞状上皮细胞癌干细胞向淋巴管内皮细胞分化的方法，同实施例1。
对比例3
无血清培养基，其各组分及用量同实施例1基本相同，将实施例1的无血清培养基中的人VEGF-C组分替换为人成纤维细胞生长因子2（简称FGF2），用量不变，其余组分及用量同实施例1完全相同。诱导鳞状上皮细胞癌干细胞向淋巴管内皮细胞分化的方法，同实施例1。
分别在电子显微镜下观察实施例1～5及对比例1～3培养的SCC干细胞，实施例1～5的镜下明场图像分别见图1～5，由图清晰可见培养的SCC干细胞诱导分化成为淋巴管样结构；对比例1～3的镜下明场图像见图6～8，由图可见SCC干细胞无法形成管状结构。可见本发明诱导肿瘤干细胞向淋巴管内皮细胞分化的方法可行，而对比例的肿瘤干细胞均无法形成淋巴管结构。由图1～5与图6～8对比可知，本发明的无血清培养基中添加的VEGF-C组分至关重要，VEGF-A、FGF2均不能替代VEGF-C起到的作用。
采用免疫组化的方法，检测实施例1中无血清培养液诱导分化出的淋巴管样结构对LYVE-1的表达，实验结果见图9。图9中的左图为实施例1的检测图，右图为体积比为1：1的DMEM/F12培养基替代实施例1无血清培养基的阴性对照，两图对比可知，本发明的无血清细胞培养液诱导培养的头颈部SCC干细胞，经过分化诱导后表达了淋巴内皮细胞的标志性分子LYVE-1。
采用免疫荧光染色法，检测实施例2的无血清细胞培养液诱导分化出的淋巴管样结构对LYVE-1和CK8/18的表达，实验结果见图10。图10中的左上角图片为LYVE-1表达情况，左下角图片为标志性分子CK 8/18（Cytokeratin 8/18）表达情况，右上角图片表示细胞核染色情况，右下角图片表示荧光叠加结果，显示细胞的整体情况。由图可见，本发明的无血清细胞培养液诱导培养的头颈部SCC干细胞，经过分化诱导后表达了淋巴内皮细胞的标志性分子LYVE-1，同时也表达了SCC细胞的标志性分子CK 8/18。
实施例所用头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的制备方法：用无血清培养液培养头颈部鳞状上皮细胞癌细胞系，培养条件为：在37℃，5%CO2环境下悬浮培养7天，每2～4天换一次无血清培养基。
头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞的制备过程中所用无血清培养液为CN 201010552225.X 适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液专利说明书中实施例1的无血清培养基，无血清培养基制备方法按CN 201010552225.X专利所述。
头颈部鳞状上皮细胞癌细胞（简称SCC细胞）悬浮培养7天，即可富集到头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞（简称SCC干细胞），SCC贴壁细胞光镜图和悬浮培养7天后SCC干细胞光镜图见图11，图中左图为光镜下贴壁的SCC细胞，右图为光镜下SCC干细胞，由图可知，培养7天后从SCC细胞中富集了球囊结构的SCC干细胞。
利用流式分别检测SCC细胞和培养7天后SCC干细胞中人胚胎干细胞标志基因Sox2和SSEA-1的表达，见图12，左图为Sox2的表达，绿色实线代表SCC干细胞，黑色虚线代表SCC细胞，右图为SSEA-1的表达，红色实线代表SCC干细胞，黑色虚线代表SCC细胞，从图中可见，制备得到的头颈部鳞状上皮细胞癌干细胞表达人胚胎干细胞标志基因：Sox2，SSEA-1。
采用软琼脂克隆形成试验分别对SCC细胞和上述培养的SCC干细胞进行克隆实验，14天后两细胞的克隆形成对比图见图13，图中左图为SCC细胞，右图为SCC干细胞，由图可知，SCC干细胞克隆形成数高于 SCC细胞，可见通过无血清干细胞培养液可以得到自我更新能力强的SCC干细胞。
利用体外成脂诱导分别检测SCC细胞和上述培养的SCC干细胞的分化能力，采用脂肪诱导液分别定向诱导两种细胞向脂肪细胞分化，诱导分化30天后的分化图见图14，左图为SCC细胞，右图为SCC干细胞，由图可知，可见通过无血清干细胞培养液可以得到分化能力强的SCC干细胞。