探针组、探针固定载体和基因检查方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN200610164184.0	申请日：	2006.12.08
公开号：	CN1978669A	公开日：	2007.06.13
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68(2006.01)	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	佳能株式会社;
发明人：	福井寿文; 户松宣博
地址：	日本东京
优先权：	2005.12.09 JP 2005－355977
专利代理机构：	中国国际贸易促进委员会专利商标事务所	代理人：	陈昕
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内容摘要

针对通过真菌的种进行分类的目的，提供了下述探针和引物，它们能以集体方式探测同一种的微生物，同时区分开其它种的微生物。用于探测传染病原性微生物基因的寡核苷酸探针包括至少一种碱基序列，所述序列选自属于下述一至九组中一组的碱基序列。一至九组的碱基序列是：第一组(SEQ ID NOS：1至5)；第二组(SEQ ID NOS：6至10)；第三组(SEQ ID NOS：11至15)；第四组(SEQ ID NOS：16至21)；第五组(SEQ ID NOS：22至26)；第六组(SEQ ID NOS：27至31)；第七组(SEQ ID NOS：32至36)；第八组(SEQ ID NOS：37至41)；第九组(SEQ ID NOS：42至46)。

权利要求书

1.  用于探测传染病原性微生物基因的探针组：
(1)包含：属于选自下述一至九组的组的第一种探针，以及属于下述组的第二种探针，所述第二种探针的组选自下述一至九组，但不同于所述第一种探针的组；或
(2)包含：具有与所述第一种探针互补的碱基序列的第三种探针，以及具有与所属第二种探针互补的碱基序列的第四种探针。
第一组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：acgatacagggcccttttgggt(SEQ ID NO：1)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atctttttcgatgcgtactggaccag(SEQ ID NO：2)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gccatttatggcgaaccaggactt(SEQ ID NO：3)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aggacgttatggttctattgtgttggtt(SEQ ID NO：4)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggactatcgactccaagtcgatgga(SEQ ID NO：5)
第二组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggtccgattttttcgtgtactgga(SEQ ID NO：6)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaccccaagtccttgtggcttg(SEQ ID NO：7)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tggaataatggaataggacgtttggttct(SEQ ID NO：8)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttttagtgacccactcggcacct(SEQ ID NO：9)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gctagcatttgctggttgtccact(SEQ ID NO：10)
第三组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gatacagggccctttcgggtct(SEQ ID NO：11)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttttggcgagtactggacccaac(SEQ ID NO：12)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctaaccattcgcccttgtggtgtt(SEQ ID NO：13)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atcgggtgttgttctttttttgacgc(SEQ ID NO：14)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaatagtgctgctagcttttgctggt(SEQ ID NO：15)
第四组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atataacgatacagggcctttggtcttg(SEQ ID NO：16)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggcggacggtctacctatggtaa(SEQ ID NO：17)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：accaggacgattactttgaggaaattaga(SEQ ID NO：18)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggtggtgctactttgcccactc(SEQ ID NO：19)；
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：agacttctcttgatcttacgggtggt(SEQ ID NO：20)；和
(6)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaatagggctgcgagcatctgc(SEQ ID NO：21)
第五组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gccggtccatcttttttgatgcgta(SEQ ID NO：22)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tctggctagcctttttggcgaac(SEQ ID NO：23)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc(SEQ ID NO：24)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tgttgttcttttattgacgcaatcggc(SEQ ID NO：25)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tgctgctagcatttgctggtatagtc(SEQ ID NO：26)
第六组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：acaatacagggctcttttgggcc(SEQ ID NO：27)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctggtggtcctgtatgctctttactg(SEQ ID NO：28)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttgacggaagaccaacaactgcg(SEQ ID NO：29)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gatcggcccacgtcaatctctg(SEQ ID NO：30)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggcgtctagtcgacggaagtt(SEQ ID NO：31)
第七组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gaggaacggtctgccttacggta(SEQ ID NO：32)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttcattgagtgtgcggtggaacc(SEQ ID NO：33)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cttagatttacggaagactaacaactgcg(SEQ ID NO：34)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tcggtccacgttattttctgactgga(SEQ ID NO：35)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggactaacagcgtttagctgttggaa(SEQ ID NO：36)
第八组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttctggggaacctcatggcctt(SEQ ID NO：37)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atagggatagtcgggggcgtca(SEQ ID NO：38)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaagcattcgccaaggatgttttcattaa(SEQ ID NO：39)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggtgtttctatgatgacccgctc(SEQ ID NO：40)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cttcttagggggactatcggctca(SEQ ID NO：41)
第九组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggggctcttttgggtctcgtaatt(SEQ ID NO：42)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctggggaatctcatggccttcac(SEQ ID NO：43)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggatagtcgggggcgtcagtatt(SEQ ID NO：44)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gtgtttctattatgacccgttcggca(SEQ ID NO：45)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：agacctcggcccttaaatagccc(SEQ ID NO：46)

2.  探针固定载体，其中，组成权利要求1所述的探针组的多个探针被以彼此相离的方式放置于载体的固相上。

3.  一种方法，用于使用探针固定载体在试样中探测传染病原性微生物基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)用权利要求2的探针固定载体与所述试样反应；以及
(ii)探测已与所述试样中核酸发生反应的寡核苷酸的反应强度。

4.  如权利要求3的探测方法，在步骤(i)之前还包含如下步骤：在试样上进行扩增处理，其中使用下述引物组，所述引物组具有包含gccctatcaactttcgatggtaggatag(SEQ ID NO：47)的碱基序列的引物和下述两种引物中的至少一种：
(1)包含aatgctctatccccagcacgac(SEQ ID NO：48)的引物；和
(2)包含tcggcaccttacgagaaatcaaagt(SEQ ID NO：49)的引物。

5.  引物组，在使用权利要求2的探针固定载体探测传染病原性微生物的过程中，用于预先扩增试样中的核酸，所述引物组具有包含gccctatcaactttcgatggtaggatag(SEQ ID NO：47)的碱基序列的引物和下述两种引物中的至少一种：
(1)包含aatgctctatccccagcacgac(SEQ ID NO：48)的引物；和
(2)包含tcggcaccttacgagaaatcaaagt(SEQ ID NO：49)的引物。

6.  用于探测传染病原性微生物的试剂盒，所述试剂盒包含，权利要求1的探针组或权利要求2的探针固定载体以及权利要求5的引物组。

说明书

探针组、探针固定载体和基因检查方法
技术领域
本发明涉及从传染病原性微生物获得的探针组，其可用于探测和鉴定传染病的致病微生物，本发明还涉及在其上固定有探针的探针固定载体。本发明还涉及使用所述探针组探测传染病原性微生物基因的方法。此外，本发明还涉及引物组，以在用于探测方法的试样中预先有效扩增核酸。
背景技术
相关领域的描述
传统上，已提出了用于在试样中迅速且可靠地探测病原真菌的试剂和方法。例如，日本专利申请公开H08-089254公开了一种寡核苷酸，其包含可用作为探针和引物以探测念珠菌病和曲霉病的病原性微生物的特定碱基序列，还公开了用于使用上述寡核苷酸探测目标微生物的方法。此外，同一专利文献还公开了用于通过PCR同时扩增大量目标微生物的引物组。此外，其公开了：使用该引物组，通过PCR扩增试样中的大量目标真菌，然后使用对每种真菌特异的探针，通过杂交试验探测对每种真菌来说特异的序列部分，以鉴定试样中真菌的物种。
另一方面，作为用于同时探测包含大量不同碱基序列的寡核苷酸的方法，已知下述方法，其中探针阵列，其中，具有与各条碱基序列互补的序列的探针被彼此相离地固定于固相上(日本专利申请公开2004-313181)。
发明内容
但是，一直不易设置下述探针，其能通过使用探针阵列等来同时探测大量真菌，同时还能减轻对于特异性以及互相之间存在信息的影响(交叉污染)。实践中，没有别的选择，只能针对将被同时探测的大量目标真菌个别地设置探针。在这些情况下，本发明的发明人已经研究了一种探针，其可以优选地用于同时探测下述九种真菌，同时还能降低交叉污染的水平。
1)白色假丝酵母Candida albicans
2)光滑假丝酵母Candida glabrata
3)吉利蒙假丝酵母Candida guilliermondii
4)克鲁斯假丝酵母Candida krusei
5)近平滑假丝酵母Candida parapsilosis
6)新型隐球菌Cryptococcus neoformans
7)白色毛孢子菌Trichosporon beigelii
8)烟曲霉Aspergillus fumigatus
9)黑曲霉Aspergillus niger
本发明的第一个目的是提供下述探针组，其能用于同时并且更可靠地鉴定选自上述九种真菌的至少两种真菌。此外，本发明的另一目的是提供下述探针固定载体，其能用于同时并且更可靠地鉴定选自上述九种真菌的至少两种真菌。此外，本发明的另一目的是提供下述引物组，通过形成上述探针组的寡核苷酸，其能选择性地扩增上述九种真菌至可探测的水平。此外，本发明的另一目的是提供用于探测传染病原性微生物的试剂盒，在试样中含有选自上述九种真菌的至少两种真菌的情况下，其能更为迅速和准确地探测上述九种真菌。
本发明的用于探测传染病原性微生物的探针组，
(1)包含：属于选自下述一至九组的组的第一种探针，以及属于下述组的第二种探针，第二种探针的组选自下述一至九组，但不同于第一种探针的组；或
(2)包含：具有与第一种探针互补的碱基序列的第三种探针，以及具有与第二种探针互补的碱基序列的第四种探针。
第一组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：acgatacagggcccttttgggt(SEQ ID NO：1)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atctttttcgatgcgtactggaccag(SEQ ID NO：2)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gccatttatggcgaaccaggactt(SEQ ID NO：3)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aggacgttatggttctattgtgttggtt(SEQ ID NO：4)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggactatcgactccaagtcgatgga(SEQ ID NO：5)
第二组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggtccgattttttcgtgtactgga(SEQ ID NO：6)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaccccaagtccttgtggcttg(SEQ ID NO：7)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tggaataatggaataggacgtttggttct(SEQ ID NO：8)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttttagtgacccactcggcacct(SEQ ID NO：9)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gctagcatttgctggttgtccact(SEQ ID NO：10)
第三组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gatacagggccctttcgggtct(SEQ ID NO：11)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttttggcgagtactggacccaac(SEQ ID NO：12)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctaaccattcgcccttgtggtgtt(SEQ ID NO：13)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atcgggtgttgttctttttttgacgc(SEQ ID NO：14)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaatagtgctgctagcttttgctggt(SEQ ID NO：15)
第四组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atataacgatacagggcctttggtcttg(SEQ ID NO：16)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggcggacggtctacctatggtaa(SEQ ID NO：17)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：accaggacgattactttgaggaaattaga(SEQ ID NO：18)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggtggtgctactttgcccactc(SEQ ID NO：19)；
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：agacttctcttgatcttacgggtggt(SEQ ID NO：20)；和
(6)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaatagggctgcgagcatctgc(SEQ ID NO：21)
第五组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gccggtccatcttttttgatgcgta(SEQ ID NO：22)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tctggctagcctttttggcgaac(SEQ ID NO：23)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc(SEQ ID NO：24)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tgttgttcttttattgacgcaatcggc(SEQ ID NO：25)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tgctgctagcatttgctggtatagtc(SEQ ID NO：26)
第六组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：acaatacagggctcttttgggcc(SEQ ID NO：27)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctggtggtcctgtatgctctttactg(SEQ ID NO：28)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttgacggaagaccaacaactgcg(SEQ ID NO：29)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gatcggcccacgtcaatctctg(SEQ ID NO：30)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggcgtctagtcgacggaagtt(SEQ ID NO：31)
第七组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gaggaacggtctgccttacggta(SEQ ID NO：32)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttcattgagtgtgcggtggaacc(SEQ ID NO：33)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cttagatttacggaagactaacaactgcg(SEQ ID NO：34)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tcggtccacgttattttctgactgga(SEQ ID NO：35)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggactaacagcgtttagctgttggaa(SEQ ID NO：36)
第八组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttctggggaacctcatggcctt(SEQ ID NO：37)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atagggatagtcgggggcgtca(SEQ ID NO：38)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaagcattcgccaaggatgttttcattaa(SEQ ID NO：39)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggtgtttctatgatgacccgctc(SEQ ID NO：40)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cttcttagggggactatcggctca(SEQ ID NO：41)
第九组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggggctcttttgggtctcgtaatt(SEQ ID NO：42)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctggggaatctcatggccttcac(SEQ ID NO：43)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggatagtcgggggcgtcagtatt(SEQ ID NO：44)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gtgtttctattatgacccgttcggca(SEQ ID NO：45)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：agacctcggcccttaaatagccc(SEQ ID NO：46)
本发明的探针固定载体特征在于，组成上述探针组的多个探针被以彼此相离地放置于载体的固相上。
本发明的、使用探针固定载体在试样中探测传染病原性微生物基因的方法包括如下步骤：
(i)用上述探针固定载体与试样反应；以及
(ii)探测已与试样中核酸发生反应的寡核苷酸的反应强度。
本发明的引物组用于：在使用具有上述结构的探针固定载体探测传染病原性微生物的过程中，在试样中预先扩增核酸。引物组具有包含gccctatcaactttcgatggtaggatag(SEQ ID NO：47)的碱基序列的引物和下述两种引物中的至少一种：
(1)包含aatgctctatccccagcacgac(SEQ ID NO：48)的引物；和
(2)包含tcggcaccttacgagaaatcaaagt(SEQ ID NO：49)的引物。
根据本发明，如果试样已被选自上述九种传染病致病微生物中的至少两种微生物合并感染，那么可从试样中同时探测到该两种或多种微生物。因此，对试样是否感染有多种真菌的确定，以及在合并感染的情况下，对致病微生物的确定，都可迅速且准确地进行。此外，在通过本发明的探针组来检查怀疑合并感染的试样的过程中，可使用本发明的引物组对上述九种传染病原性微生物进行选择性地扩增，而不会损失构成探针组的探针的特异性。因此，使用本发明的引物组用于对试样进行扩增，通过本发明的探针组或探针固定载体对试样的检查可更为迅捷、准确地进行。
参考附图，对下述示例性实施方式的描述将使本发明的其它特征明显呈现。
附图说明
图1是展示PCR条件的图。
图2是展示PCR条件的图。
具体实施方式
下文中，将对本发明的优选实施方式加以详细描述。
在下述实施方式中，显示了用于鉴定传染病原性微生物的寡核苷酸探针组(下文中简称为探针)。使用该探针组，可以探测通过其感染导致炎症的下述九种真菌之一或多种。
1)白色假丝酵母Candida albicans
2)光滑假丝酵母Candida glabrata
3)吉利蒙假丝酵母Candida guilliermondii
4)克鲁斯假丝酵母Candida krusei
5)近平滑假丝酵母Candida parapsilosis
6)新型隐球菌Cryptococcus neoformans
7)白色毛孢子菌Trichosporon beigelii
8)烟曲霉Aspergillus fumigatus
9)黑曲霉Aspergillus niger
即，公开的核酸探针组，是用于探测上述九种传染病原性微生物基因中的18S rRNA基因序列，而且没有过度或不足。
根据本发明，用于下述探针组的探针可选自下述一至九组中至少两组的每组，所述探针组自身与试样(用于检查的溶液)反应，所述试样含有传染病原性微生物的基因本身或具有特异于微生物基因的碱基序列的核酸。
第一组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：acgatacagggcccttttgggt(SEQ ID NO：1)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atctttttcgatgcgtactggaccag(SEQ ID NO：2)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gccatttatggcgaaccaggactt(SEQ ID NO：3)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aggacgttatggttctattgtgttggtt(SEQ ID NO：4)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggactatcgactccaagtcgatgga(SEQ ID NO：5)
第二组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggtccgattttttcgtgtactgga(SEQ ID NO：6)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaccccaagtccttgtggcttg(SEQ ID NO：7)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tggaataatggaataggacgtttggttct(SEQ ID NO：8)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttttagtgacccactcggcacct(SEQ ID NO：9)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gctagcatttgctggttgtccact(SEQ ID NO：10)
第三组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gatacagggccctttcgggtct(SEQ ID NO：11)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttttggcgagtactggacccaac(SEQ ID NO：12)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctaaccattcgcccttgtggtgtt(SEQ ID NO：13)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atcgggtgttgttctttttttgacgc(SEQ ID NO：14)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaatagtgctgctagcttttgctggt(SEQ ID NO：15)
第四组：
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atataacgatacagggcctttggtcttg(SEQ ID NO：16)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggcggacggtctacctatggtaa(SEQ ID NO：17)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：accaggacgattactttgaggaaattaga(SEQ ID NO：18)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggtggtgctactttgcccactc(SEQ ID NO：19)；
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：agacttctcttgatcttacgggtggt(SEQ ID NO：20)；和
(6)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaatagggctgcgagcatctgc(SEQ ID NO：21)
第五组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gccggtccatcttttttgatgcgta(SEQ ID NO：22)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tctggctagcctttttggcgaac(SEQ ID NO：23)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc(SEQ ID NO：24)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tgttgttcttttattgacgcaatcggc(SEQ ID NO：25)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tgctgctagcatttgctggtatagtc(SEQ ID NO：26)
第六组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：acaatacagggctcttttgggcc(SEQ ID NO：27)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctggtggtcctgtatgctctttactg(SEQ ID NO：28)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttgacggaagaccaacaactgcg(SEQ ID NO：29)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gatcggcccacgtcaatctctg(SEQ ID NO：30)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggcgtctagtcgacggaagtt(SEQ ID NO：31)
第七组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gaggaacggtctgccttacggta(SEQ ID NO：32)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttcattgagtgtgcggtggaacc(SEQ ID NO：33)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cttagatttacggaagactaacaactgcg(SEQ ID NO：34)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：tcggtccacgttattttctgactgga(SEQ ID NO：35)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggactaacagcgtttagctgttggaa(SEQ ID NO：36)
第八组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ttctggggaacctcatggcctt(SEQ ID NO：37)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：atagggatagtcgggggcgtca(SEQ ID NO：38)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：aaagcattcgccaaggatgttttcattaa(SEQ ID NO：39)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cggtgtttctatgatgacccgctc(SEQ ID NO：40)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：cttcttagggggactatcggctca(SEQ ID NO：41)
第九组
(1)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggggctcttttgggtctcgtaatt(SEQ ID NO：42)；
(2)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ctggggaatctcatggccttcac(SEQ ID NO：43)；
(3)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：ggatagtcgggggcgtcagtatt(SEQ ID NO：44)；
(4)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：gtgtttctattatgacccgttcggca(SEQ ID NO：45)；和
(5)具有下述碱基序列的探针，所述序列包含：agacctcggcccttaaatagccc(SEQ ID NO：46)
上述每组都具有至少五种探针，使用来自选自一至九组中的至少两组中的每组的至少一种探针，可以形成探针组。因此，本实施方式的探针组可以含有最少两种探针，最多46种探针。
本文中，每组具有如下探测功能。
第一组：探测Candida albicans
第二组：探测Candida glabrata
第三组：探测Candida guilliermondii
第四组：探测Candida krusei
第五组：探测Candida parapsilosis
第六组：探测Cryptococcus neoformans
第七组：探测Trichosporon beigelii
第八组：探测Aspergillus fumigatus
第九组：探测Aspergillus niger
与上述探针序列互补的序列也具有同样功能，因此它们也可用作为探针序列。具有这些互补序列的探针也可用于形成探针组。
即，探针组被构成为：
(1)包含：属于选自上述一至九组的组的第一种探针，以及属于下述组的第二种探针，第二种探针的组选自上述一至九组，但不同于第一种探针的组；或
(2)包含：具有与第一种探针互补的碱基序列的第三种探针，以及具有与第二种探针互补的碱基序列的第四种探针。
用于各种微生物的探针是从编码18S rRNA的基因设计而来的，使得它们与对应的微生物具有非常高的特异性，可期待探针碱基序列间没有变化的足够的杂交特异性。
这些寡核苷酸探针被设计为：使得通过试样和结合在载体上的两种或多种探针之间的杂交形成稳定的杂交体，以及可以获得令人满意的结果。
此外，具有固定在其上的、本发明的针对传染病原性微生物的探针的探针固定载体(例如DNA芯片)可通过下述方法获得：提供构成本发明实施方式的探针组的探针，将它们每种都固定于载体的预定位置上。为向载体提供探针，可以使用多种方法。例如，下述方法可以是优选使用的：将探针制备为使其能通过化学键结合(共价键)固定于载体上，以及通过液体输送方法(即，喷墨方法)将含有探针的液体提供给载体的预定位置。这能使得探针较少从载体脱落，因此，作为附加效果，敏感性增加。当通过被称为Stanford方法的印模(stamp)方法来制备DNA芯片时，该芯片具有如下缺点：施加的DNA容易脱落。此外，作为制造DNA芯片的方法，可通过DNA合成将探针放置于载体表面。在向载体上合成探针的方法中，每种探针的合成量都是不同的，因此，固定探针的量相当大地不同，这取决于每种探针的固定区域(点)。当被固定的探针的量上存在此类变化时，使用此类载体，有可能不能对获得的探测结果做出可靠的评价。从这些观点来看，使用上述喷墨方法来制备本发明的探针固定载体，因为在下述方面其是优选的：探针难于脱落，并且稳定固定于载体上；并且能有效提供用于高敏感性和准确性的探测的探针固定载体。
下文中，将对本发明的优选实施方式加以详细描述。
作为检查目标用于本实施方式探针固定载体的DNA芯片的试样包括其中可能存在微生物的任何试样，例如，来自动物(例如，人和牲畜)的体液，包括血液、脊髓液、痰、胃液、阴道分泌物以及口腔内粘液，以及排泄物，例如，尿和粪便。此外，可能被微生物污染的所有媒介也可成为检查目标，包括可能导致食物中毒或者可能被污染的食物和环境中的水，例如，饮用水和温泉水，过滤器，例如，空气过滤器。在进口和出口时要检疫的动物和植物也可以是作为试样的检查目标。
当上述试样不经处理就可用于采用DNA芯片的反应时，其与DNA反应，结果被加以分析。此外，当试样不经处理不能与DNA芯片反应时，根据必要，对试样进行处理，例如，对目标物质进行抽提和纯化，令得到的样品与DNA芯片反应。例如，当试样中含有目标核酸时，从试样中制备出被假设为含有目标核酸的抽提片断，如果必要的话，进行进一步的处理，例如洗涤或稀释。然后，令制备得到的样品溶液与DNA芯片反应。此外，当试样中含有目标核酸时，可以使用多种扩增处理，包括PCR扩增处理，以扩增目标核酸，由此获得将与DNA芯片反应的样品。此类扩增得到的核酸样品的例子包括：通过多种方法制备的试样，例如通过使用PCR反应引物(设计来探测18S rRNA基因的)制备的扩增试样；PCR扩增产物的通过进行PCR反应等制备的试样等；通过不是PCR的扩增方法制备的试样；通过用于可视化的多种标记方法标记的试样。
用于本实施方式的DNA芯片的载体包括：能满足载体特征的所有基板种类的载体，包括：平板基板(例如玻璃基板，塑料基板以及硅晶片)，具有三维图案的三维结构，球形体(例如，珠粒)以及杆形、绳索形和螺纹形的结构。载体还包括表面经过处理使得可以固定探针DNA的基板。特别地，从再现性的角度来看，通过将功能基团引入到其表面发生可能的化学反应来制备的载体具有优选的形式，因为探针可以在杂交反应过程中稳定结合。
作为本发明中使用的固定方法的例子，使用马来酰亚胺基团和硫醇(-SH)基团的组合。更具体地，硫醇(-SH)基团结合到核酸探针的末端，对载体表面(固相)进行处理，使其具有马来酰亚胺基团。因此，提供给固体表面的核酸探针的硫醇基团与固体表面的马来酰亚胺基团发生反应，从而固定住核酸探针。
为引入马来酰亚胺基团，首先，氨基硅烷偶联剂被用于在玻璃基板上反应。然后，通过氨基基团和EMCS试剂(N-(6-马来酰亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺：Dojin制造的)之间的反应引入马来酰亚胺基团。当DNA是通过自动DNA合成仪合成的时候，可以通过使用5’-硫醇-ModifierC6(Glen Research)来向DNA引入SH基团。
还可以使用例如环氧基基团(在固相上)和氨基基团(核酸探针末端)的组合，来代替上述硫醇基团和马来酰亚胺基团的组合，用作为用于固定的功能基团的组合。使用多种硅烷偶联剂的表面处理也是有用的。可以使用下述寡核苷酸，其中引入了下述功能基团，所述功能基团可与硅烷偶联剂引入的功能基团反应。还可以使用下述方法：应用具有功能基团的树脂。
使用本发明的探针固定载体对传染病原性微生物基因的探测可通过一种探测传染病源性微生物基因的方法来进行。所述方法包含如下步骤：用具有上述结构的探针固定载体与试样反应；探测探针固定载体上探针与试样中核酸的反应(例如，探测反应的存在)；以及当它们之间的反应被探测到时，具体指出与试样中核酸发生反应的探针，以及与探针的碱基序列，鉴定出试样中含有的传染病原性微生物基因。
如上所述，当试样中含有的18S rRNA基因序列被PCR扩增，并且得到的产物被用作为将与探针载体反应的样品时，可以使用用于探测传染病原性微生物的引物组。含有作为引物的下述寡核苷酸的引物组是优选的引物组。
(1)包含下述碱基序列的寡核苷酸：5’gccctatcaactttcgatggtaggatag3’
(2)包含下述碱基序列的寡核苷酸：5’aatgctctatccccagcacgac3’
实施例
下面，将参考实施例来详细描述本发明，其中使用针对传染病原性微生物用于探测真菌的探针。
(实施例1)
在下述实施例中，将描述使用2步PCR法对微生物进行的探测。
(1.制备探针DNA)
表1中展示的核酸序列被设计并合成为用于探测Candidaalbicans的探针。更具体地，从编码Candida albicans的18S rRNA基因选出下述探针碱基序列。这些探针碱基序列被设计为：使得它们能具有针对对应真菌的非常高的特异性，以及可以期待足够杂交敏感性，并且探针碱基序列间不发生变化。将使用的探针碱基序列不被限制为：与表1所示的那些完全一致的序列，但是具有大约20-30的碱基长度并且包括所述探针碱基序列的探针碱基序列也被包括于表1所示的探针碱基序列中。
表1

微生物名称探针编号SEQ ID NO 序列CandidaalbicansCA-11 5’acgatacagggcccttttgggt3’CA-22 5’atctttttcgatgcgtactggaccag3’CA-33 5’gccatttatggcgaaccaggactt3’CA-44 5’aggacgttatggttctattgtgttggtt3’CA-55 5’ggactatcgactccaagtcgatgga3’

对表1显示的每种探针而言，按照常规方法进行合成之后，硫醇基团作为将探针固定到DNA微阵列上的官能团，被引入到核酸的5’末端。引入官能团之后，进行纯化和冻干。将用作为内标的冻干探针贮藏于-30℃ 冰箱中。
(2.制备PCR引物)
(2-1.制备试样扩增PCR引物)
设计出表2所示的核酸序列，它们作为探测病原性微生物的18SrRNA基因(目标基因)扩增PCR引物。更具体地，设计出能特异性扩增编码18S rNA基因的基因组部分的引物组，这是下述引物：其特定熔点在碱基长度为大约1700的18S rRNA基因编码序列的两个末端部分被制为尽可能的一致。为同时扩增不同真菌菌株，从真菌的共有区域来设计引物。
表2
引物编号SEQ ID NO序列正向引物F-1475’gccctatcaactttcgatggtaggatag3’反向引物R-1485’aatgctctatccccagcacgac3’

在合成之后，通过高效液相色谱(HPLC)来纯化表2所示的引物，每种引物被溶解于TE缓冲液中，使其具有10pmol/μl的最终浓度。
(2-2.制备标记PCR引物)
以与上述试样扩增引物同样的手段，设计用于标记的引物，如表3所示。
引物编号SEQ ID NO序列Cy3-标记引物R-2495’tcggcaccttacgagaaatcaaagt3’

使用Cy3用作为荧光染料，对表所示的引物进行标记。
合成之后，通过HPLC对引物进行纯化，引物被溶解于TE缓冲液中，使其具有10pmol/μl的最终浓度。
(3.抽提Candida albicans的基因组DNA(模型试样))
(3-1.微生物培养和基因组DNA抽提)
首先，按照传统方法来培养Candida albicans的典型菌株(ATCC18804)。从微生物培养液抽提基因组DNA，用核酸纯化试剂盒(Funakoshi Co.，Ltd.制造的FastPrep FP100A·FastDNA试剂盒)来对其进行纯化。
(3-2.对收集的基因组DNA进行检验)
按照常规方法，在收集的微生物(Candida albicans)基因组DNA上，进行琼脂糖电泳以及260/280-nm的吸光度测定，从而对质量(低分子量核酸的污染量和降解程度)和收集量加以分析。在此实施例中，收集到了大约10μg的基因组DNA，没有观察到基因组DNA的降解和rRNA的污染。将收集到的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，使其具有50ng/μl的最终浓度，将其用于下述实施例。
(4.制备DNA微阵列)
(4-1.清洁玻璃基板)
将通过合成二氧化硅制得的玻璃基板(大小：25mm×75mm×1mm，Iiyama Tokushu Glass制造的)放到耐热耐碱的架子中，浸泡于用于超声波清洁的清洁溶液中，所述溶液被制为预定的浓度。将玻璃基板保持浸泡于清洁溶液中过夜，然后通过超声波清洗，对其进行20分钟的清洁。拿出基板，用纯水轻轻漂洗，在超纯水中通过超声波清洁对其进行20分钟的清洁。然后，将基板浸泡于加热至80℃ 的1N氢氧化钠水溶液中，浸泡10分钟。再进行纯水清洁和超纯水清洁。由此制得用于DNA芯片的二氧化硅玻璃基板。
(4-2.表面处理)
将硅烷偶联剂KBM-603(Shinetsu Silicone制得的)以1重量％的浓度溶解于纯水中，在室温下搅拌2小时。然后，在室温下将经过清洁的玻璃基板浸于硅烷偶联剂的水溶液中，令其保持20分钟。取出玻璃基板。用纯水对其表面进行轻轻地漂洗，通过向基板的两个表面喷氮气来使其干燥。在烘箱中，于120℃对经过干燥的基板进行1小时的烘烤，以使偶联剂的处理完全，由此向基板表面引入氨基基团。接着，将N-(6-马来酰亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺(下文中被缩写为EMCS)溶解于二甲基亚砜和乙醇(体积比＝1∶1)的溶剂混合物中，使其具有0.3mg/ml的最终浓度，由此制备EMCS溶液。EMCS是DojindoLaboratories制造的N-(6-马来酰亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺。
令经过烘烤的玻璃基板冷却，将其在室温下浸于制备得到的EMCS溶液中。这种处理允许通过硅烷偶联剂引入到表面的氨基基团与EMCS中的琥珀亚酰胺基团反应，使得马来亚酰胺基团被引入到玻璃基板的表面。通过使用上述溶剂混合物(其中溶解有EMCS)来清洁从EMCS溶液中取出的玻璃基板。通过乙醇进一步清洁玻璃基板，将其在氮气氛中干燥。
(4-3.探针DNA)
将实施例1中(1.制备探针DNA)制备的微生物探测探针溶解于纯水中。溶液被配制为：使得最终浓度(油墨溶液中)达到10μM。然后，冻干溶液，以除去水。
(4-4.通过BJ打印机进行DNA排出以及与基板结合)
制备下述水溶液，其中含有7.5wt％甘油、7.5wt％硫二甘醇、7.5wt％的尿素和1.0wt％的乙酰烯醇(acetylenol)EH(Kawaken FineChemicals制造)。将预先制备的5种探针的每种溶解于上述溶剂混合物中，使其具有正常浓度。将获得的DNA溶液装入到气泡喷墨打印机(Canon制造，商品名为BJF-850)的墨水槽中，该槽与打印头连接。
预先对此处使用的气泡喷墨打印机加以改造以使其能在平板上进行打印。此外，根据预定的文档制造方法向该气泡喷墨打印机输入打印图案，使得大约5皮升的DNA溶液以大约120μm的点距被点上去。
然后，将该经过改造的气泡喷墨打印机用于在一块玻璃基板上进行打印操作，由此制备阵列。确定可靠地获得打印之后，令玻璃基板在润湿的腔中保持30分钟，以使玻璃基板表面上的马来亚酰胺基团与核酸探针末端的硫醇基团反应。
(4-5.清洗)
30分钟的反应之后，用含有100mM NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)去清洗表面残留的DNA溶液，由此获得具有固定在玻璃基板表面上的单链DNA的DNA微阵列。
(5.对试样进行扩增和标记)
(5-1.扩增试样：第一次PCR)
对作为试样的微生物基因的扩增(第一次PCR)和标记(第二次PCR)反应将显示于表4中。
表4
AmpliTaq Gold(5U/μL)     0.5μL
模板基因组DNA               可变
dNTP混合物(2.5mM/每种)      4.0μL
x10 PCR缓冲液               5.0μL
25mM MgCl₂                  7.0μL
正向引物                    0.25μL
反向引物                    0.25μL
H₂O                         可变

总共                        50μl
通过商业途径可获得的热循环仪，按照图1所示的方案，用具有上述组合物的反应溶液进行扩增反应。
反应结束之后，使用纯化柱(QIAGEN制造的QIAquick PCRPurification Kit)进行纯化，然后对扩增产物加以分析。
(5-2.标记反应：第二次PCR)
通过商业途径可获得的热循环仪，按照图2所示的方案，用具有表5的组合物的反应溶液进行扩增反应。
表5
Premix PCR试剂(TAKARA ExTaq)     25μL
模板DNA(第一次PCR的产物)         可变(30ng/管)
Cy3标记的反向引物                5μL
H₂O                              可变

总共                             50μL
反应结束之后，使用纯化柱(QIAGEN制造的QIAquick PCRPurification Kit)进行纯化，以获得经过标记的试样。
(6.杂交)
通过使用上述过程(4.制备DNA微阵列)中制备的DNA微阵列和上述过程(5.对试样进行扩增和标记)中制备的经标记试样来进行探测反应。
(6-1.封闭DNA微阵列)
将BSA(牛血清清蛋白，Sigma制造的片段V)溶解于100mM NaCl/10mM磷酸盐缓冲液中，使其具有1wt％的浓度。然后，将过程(4.制备DNA微阵列)中制备的DNA微阵列在室温下浸于该溶液中，浸2小时，用于封闭。封闭结束之后，用下述清洗溶液去洗芯片，用纯水进行漂洗，并通过旋转式干燥仪进行脱水。
清洗溶液：
2×SSC溶液(NaCl 300mM，柠檬酸钠(脱水柠檬酸三钠，C₆H₅Na₃·2H₂O)30mM，pH7.0)，含有0.1wt％SDS(十二烷基硫酸钠)
(6-2.杂交)
在杂交装置(Genomic Solutions Inc.制造的HybridizationStation)中放置脱水的DNA微阵列，在下面显示的条件下，使用杂交溶液来进行杂交反应。
(6-3.杂交溶液)
6×SSPE/10％甲酰胺/目标物(所有第二次PCR的产物)/0.05wt％SDS
(6×SSPE：NaCl 900mM，NaH₂PO₄·H₂O 50mM，EDTA 6mM，pH7.4)
(6-4.杂交条件)
65℃ 3分钟→92℃ 2分钟→45℃ 3小时→在25℃用2×SSC/0.1％SDS洗→在20℃用2×SSC洗→(用H2O漂洗：手动)→旋转干燥。
(7.微生物探测(荧光测量))
使用DNA微阵列荧光探测仪(Axon制造的GenePix 4000B)对杂交反应结束之后的DNA微阵列进行荧光测量。结果，以高再现性通过足够的信号探测到的Candida albicans。没有探测到来自其它微生物的探针的明确杂交体。
(8.探测其它微生物)
设计并制备出用于探测下文列出的每种微生物的探针组，用与上文相同的手段来进行检查(杂交反应)。在表6至14中，通过SEQ IDNO显示了用于探针组的探针序列。
1)Candida glabrata
2)Candida guilliermondii
3)Candida krusei
4)Candida parapsilosis
5)Cryptococcus neoformans
6)Trichosporon beigelii
7)Aspergillus fumigatus
8)Aspergillus niger
结果显示于表6至14中。根据从实验中获得的强度值的SN比，使用下述标记。当SN比大于3时，使用“+++”。对于大于2且不大于3、大于1且不大于2、以及不大于1的SN比分别使用“++”、“+”和“-  。
表6
Candida albicans
微生物名称SEQ IDNO：1SEQ IDNO：2 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：5Candida albicans++++++ +++ +++ +++Candida glabrata-- - - -Candidaguilliermondii++- + + ++Candida krusei++- + + -Candida parapsilosis++++ ++ ++ ++Cryptococcusneoformans-- - - -Trichosporonbeigelii-- - - -Aspergillusfumigatus-- + - -Aspergillus niger-- + - -人18S rRNA-- - - -

表7
Candida glabrata
微生物名称SEQ ID NO：6 SEQ ID NO： 7 SEQ ID NO： 8 SEQ ID NO： 9 SEQ ID NO： 10Candida albicans- - + - +Candida glabrata+++ +++ +++ +++ +++Candidaguilliermondii- - ++ + -Candida krusei- - - + -Candida parapsilosis- - ++ - +Cryptococcusneoformans- - - - -Trichosporonbeigelii- - + - -Aspergillusfumigatus- - ++ - -Aspergillus niger- - ++ - -人18S rRNA- - - - -

表8
Candida guilliermondii
微生物名称SEQ IDNO：11 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：15 Candida albicans- + - - ++ Candida glabrata+ - - - - Candida guilliermondii+++ +++ +++ +++ +++ Candida krusei+ - - - - Candida parapsilosis+++ + - - ++ Cryptococcus neoformans- - - - - Trichosporon beigelii- - - - - Aspergillus fumigatus- + - - - Aspergillus niger- + - - - 人18S rRNA- - - - -

表9
Candida krusei
微生物名称 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19 SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21 Candida albicans + - - - - - Candida glabrata - - - - - - Candida guilliermondii + - - - - - Candida krusei +++ +++ +++ +++ +++ +++ Candida parapsilosis + - - - - - Cryptococcus neoformans - - - - - - Trichosporon beigelii - - - - - - Aspergillus fumigatus - - - - - - Aspergillus niger - - - - - - 人18S rRNA - - - - - -

表10
Candida parapsilosis
微生物名称 SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：26Candida albicans ++ - + ++ ++Candida glabrata - - - - +Candida guilliermondii - + ++ ++ ++Candida krusei - + ++ - -Candida parapsilosis +++ +++ +++ +++ +++Cryptococcus neoformans - - - - -Trichosporon beigelii - - - - -Aspergillus fumigatus - - + - -Aspergillus niger - - + - -人18S rRNA - - - - -

表11
Cryptococcus neoformans
微生物名称 SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：28 SEQ ID NO：29 SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：31 Candida albicans - - - - - Candida glabrata - - - - - Candida guilliermondii - - - - - Candida krusei - - - - - Candida parapsilosis - - - - - Cryptococcus neoformans +++ +++ +++ +++ +++ Trichosporon beigelii - - - - - Aspergillus fumigatus + - - - - Aspergillus niger + - - - - 人18S rRNA - - - - -

表12
Trichosporon beigelii
微生物名称 SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：34 SEQ ID NO：35 SEQ ID NO：36 Candida albicans - - - - - Candida glabrata - - - - - Candida guilliermondii - - ++ - - Candida krusei - - - - - Candida parapsilosis - - - - - Cryptococcus neoformans - - - - - Trichosporon beigelii +++ +++ +++ +++ +++ Aspergillus fumigatus - - - - - Aspergillus niger - - - - - 人18S rRNA - - - - -

表13
Aspergillus fumigatus
微生物名称 SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：39 SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 Candida albicans - - + - - Candida glabrata - - ++ - + Candida guilliermondii - - ++ - - Candida krusei + - ++ - - Candida parapsilosis - - + - - Cryptococcus neoformans - - - - - Triehosporon beigelii - - - - - Aspergillus fumigatus +++ +++ +++ +++ +++ Aspergillus niger ++ +++ +++ + +++ 人18S rRNA - - ++ - -

表14
Aspergillus niger
微生物名称 SEQ ID NO：42 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：45 SEQ ID NO：46 Candida albicans + - - - - Candida glabrata - - - - - Candida guilliermondii - - - - - Candida krusei - + - - - Candida parapsilosis - - - - - Cryptococcus neoformans + - - - - Trichosporon beigelii - - - - - Aspergillus fumigatus +++ ++ +++ - ++ Aspergillus niger +++ +++ +++ +++ +++ 人18S rRNA - - - - -

如上所述，制备DNA微阵列，其上按照上述实施例固定有能探测表6至表14的9种微生物的探针组。此外，使用该DNA微阵列能鉴定传染病原性微生物，由此解决从微生物获得的DNA探针上存在的问题。即，可以/大量整体化学合成寡核苷酸探针，对纯化和浓度的控制是可能的。此外，针对通过真菌的种来分类的目的，可以提供下述探针组，所述探针组能整体探测同一种的微生物，同时会区分开其它种的微生物。
根据上述实施方式，对传染病原性微生物的18S rRNA基因序列进行不过度也无不足的探测，由此可以以良好的效率和高的准确率来确定传染病原性微生物的存在。
此外，如上述实施例所示，使用，例如，来自同一组的两种或多种探针，优选地，三种或更多，更优选地，全部五种，对象对于获得的每种信号的信号比例的分析使得能进行高度准确的测定。
(实施例2)
下述实施例中，将解释对实施例1中使用的九种微生物的扩增。
(1.制备试样扩增PCR引物)
设计出表2所示的核酸序列，作为用于试样扩增的18S rRNA基因(目标基因)扩增PCR引物。
更具体地，设计出能特异性扩增编码18S rNA基因的引物组，这是下述引物：其特定熔点在碱基长度为大约1700的18S rRNA基因编码序列的两个末端部分被制为尽可能的一致。引物被设计为能同时扩增变异株或基因组上存在的多个18S rRNA基因编码区域。
此外，甚至在其中特别混合有人类基因组和真菌基因组的实验系统中，引物被设计为能选择性仅扩增真菌基因组。
表15
引物编号SEQ ID NO 序列正向引物F-147 5’gccctatcaactttcgatggtaggatag3’反向引物R-148 5’aatgctctatccccagcacgac3’R-249 5’tcggcaccttacgagaaatcaaagt3’

在合成之后，通过高效液相色谱(HPLC)来纯化表15所示的引物，将正向引物和两种反向引物全部互相混合起来。同时，将它们溶解于TE缓冲液中，使得每种引物具有10pmol/μl的最终浓度。在该实施例中，使用两种反向引物，但是可以使用它们中的任何一种。
(2.抽提Candida albicans的基因组DNA(模型试样))
(2-1.微生物培养和基因组DNA抽提)
首先，按照常规方法来培养Candida albicans(ATCC18804)的标准菌株。从微生物培养液抽提基因组DNA，用核酸纯化试剂盒(Funakoshi Co.，Ltd.制造的FastPrep FP100A·FastDNA试剂盒)来对其进行纯化。
(2-2.对收集的基因组DNA进行检验)
按照常规方法，在收集的微生物(Candida albicans)基因组DNA上，进行琼脂糖电泳以及260/280-nm的吸光度测定，从而对质量(低分子量核酸的污染量和降解程度)和收集量加以分析。在该实施例中，收集到了大约10μg的基因组DNA，没有观察到基因组DNA的降解和rRNA的污染。将收集到的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，使其具有50ng/l的最终浓度，按照下文所述来使用。
使用上述DNA，制备表16所示的反应溶液。
表16
Premix PCR试剂(TAKARA ExTaq)    25μl
模板基因组DNA                   2μl(100ng)
正向引物                        2μl
反向引物                        2μl(每种20pmol/管)
Cy3 dUTP                        2μL(2nmol/管)
H₂O                             17μL

总共                            50μL
通过商业途径可获得的热循环仪，按照图1所示的方案，用具有上述组合物的反应溶液进行扩增反应。反应结束之后，使用纯化柱(QIAGEN制造的QIAquick PCR Purification Kit)进行纯化，用扩增产物进行凝胶电泳。结果，在来自全部九种微生物的1700个碱基对的区域附近探测到了一条条带，这验证了PCR反应在很好地工作。
(实施例3)
下述实施例描述了：人类基因组中编码18S rRNA的部分不能用实施例2中所用的引物扩增出来。
用人类基因组作为PCR反应的模板来进行PCR反应，其中使用与实施例2中所用的同样的引物组。结果，没有探测到PCR扩增到的任何条带，这验证了人类基因组的扩增不能用实施例2中表15的引物组来进行。这表明，本发明的引物组可以从临床试样(可能具有混合在其中的人类基因组和真菌基因组)选择性地仅扩增来自微生物基因组的18S rRNA基因。
(实施例4)
下述实施例描述了：当试样中包括两种微生物时，可以同时探测两种微生物。
(1.制备试样模型)
根据实施例1的(3-1.微生物培养和基因组DNA抽提)中描述的方法，培养Candida krusei和Aspergillus gumigatus，进行基因组DNA抽提和纯化。
(2.制备DNA微阵列)
按照实施例1(4.制备DNA微阵列)所描述的方法，制备DNA微阵列。本实施例的目的是，可以同时探测Candida krusei和Aspergillus gumigatus，因此制备在其上仅固定有表17所示的探针的DNA微阵列。
表17
SEQ ID NO 目标微生物的种类 SEQ ID NO：5 Candida albicans SEQ ID NO：6 Candida glabrata SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：13 Candida guilliermondii SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：17 Candida krusei SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19 SEQ ID NO：22 Candida parapsilosis SEQ ID NO：27 Cryptococcus neoformans SEQ ID NO：28 SEQ ID NO：32 Trichosporon beigelii SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：39 Aspergillus fumigatus SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：45 Aspergillus niger

(3.对试样进行扩增和标记)
混合(1.制备试样模式)中抽提和纯化的Candida krusei和Aspergillus gumigatus的基因组DNA，获得模板DNA。按照实施例1(5.对试样进行扩增和标记)所述的方法，对模板DNA进行扩增和标记。
(4.杂交)
使用上述(2.对试样进行扩增和标记)中制备的经标记试样和实施例1(4.制备DNA微阵列)中制备的基因芯片，来进行实施例1(6.杂交)所述的探测反应。
(5.微生物探测(荧光探测))
使用基因芯片荧光探测仪(Axon制造的GenePix 4000B)对杂交反应结束之后的基因芯片进行荧光测量。同样的实验进行两次，对获得的强度进行标准化。下表18中显示了经过标准化的结果。
根据从实验中获得的强度值的SN比，使用下述标记。当SN比大于3时，使用“+++”。对于大于2且不大于3、大于1且不大于2、以及不大于1的SN比分别使用“++”、“+”和“-”。
表18
SEQ ID NO 第一次实验第二次实验 SEQ ID NO 5 ++ ++ SEQ ID NO 6 - - SEQ ID NO 7 - - SEQ ID NO 10 - - SEQ ID NO 13 - - SEQ ID NO 14 + + SEQ ID NO 17 +++ +++ SEQ ID NO 18 +++ +++ SEQ ID NO 19 +++ +++ SEQ ID NO 22 - - SEQ ID NO 27 - - SEQ ID NO 28 - - SEQ ID NO 32 - - SEQ ID NO 33 - - SEQ ID NO 39 +++ +++ SEQ ID NO 4O +++ +++ SEQ ID NO 41 +++ +++

虽然第一次实验和第二次实验的强度绝对值之间存在差异，但是我们发现，作为标准化的结果，SEQ ID NOS：17、18、19、39、40和41的强度明显展现出了高强度。这些SEQ ID NOS的探针是测定Candidakrusei和Aspergillus fumigatus的探针，如表17所示。考虑到上述结果，即使试样含有两种微生物的基因组，本实施例的DNA芯片可以测定每种微生物的存在。
本发明并不局限于上述实施方式，在本发明的宗旨和范围内可以进行多种变化和改动。因此，为向公众告知本发明的范围，产生了下述权利要求。
虽然参考示例性的实施方式对本发明的进行了描述，但是应当理解，本发明并不局限于公开的示例性实施方式。下述权利要求的范围应与最宽广的解释一致，从而包括进所有此类改动和等同结构及功能。
序列表
<110>佳能株式会社
<120>探针组，探针固定载体和基因检查方法
<130>IIC062757
<140>
<141>
<150>JP2005-355977
<151>2005-12-9
<160>49
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida albicans的探针
<400>1
acgatacagg gcccttttgg gt                22
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida albicans的探针
<400>2
atctttttcg atgcgtactg gaccag            26
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida albicans的探针
<400>3
gccatttatg gcgaaccagg actt                24
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida albicans的探针
<400>4
aggacgttat ggttctattg tgttggtt            28
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida albicans的探针
<400>5
ggactatcga ctccaagtcg atgga               25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida glabrata的探针
<400>6
cggtccgatt ttttcgtgta ctgga               25
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida glabrata的探针
<400>7
aaccccaagt ccttgtggct tg               22
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida glabrata的探针
<400>8
tggaataatg gaataggacg tttggttct        29
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida glabrata的探针
<400>9
ttttagtgac ccactcggca cct              23
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida glabrata的探针
<400>10
gctagcattt gctggttgtc cact                24
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida guilliermondii的探针
<400>11
gatacagggc cctttcgggt ct                  22
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida guilliermondii的探针
<400>12
ttttggcgag tactggaccc aac                 23
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida guilliermondii的探针
<400>13
ctaaccattc gcccttgtgg tgtt                24
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida guilliermondii的探针
<400>14
atcgggtgtt gttctttttt tgacgc              26
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida guilliermondii的探针
<400>15
aaatagtgct gctagctttt gctggt              26
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida krusei的探针
<400>16
atataacgat acagggcctt tggtcttg            28
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida krusei的探针
<400>17
ggcggacggt ctacctatgg taa                 23
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida krusei的探针
<400>18
accaggacga ttactttgag gaaattaga            29
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida krusei的探针
<400>19
ggtggtgcta ctttgcccac tc                   22
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida krusei的探针
<400>20
agacttctct tgatcttacg ggtggt               26
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Candida krusei的探针
<400>21
aaatagggct gcgagcatct gc                   22
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>22
gccggtccat cttttttgat gcgta                25
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>23
tctggctagc ctttttggcg aac                  23
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>24
tcagtattca gtagtcagag gcgaaattc            29
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>25
tgttgttctt ttattgacgc aatcggc              27
<210>26
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>26
tgctgctagc atttgctggt atagtc               26
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>27
acaatacagg gctcttttgg gcc                  23
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>28
ctggtggtcc tgtatgctct ttactg               26
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>29
ttgacggaag accaacaact gcg                   23
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>30
gatcggccca cgtcaatctc tg                    22
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Cryptococcus neoformans的探针
<400>31
cggcgtctag tcgacggaag tt                    22
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Trichosporon beigelii的探针
<400>32
gaggaacggt ctgccttacg gta                        23
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Trichosporon beigelii的探针
<400>33
ttcattgagt gtgcggtgga acc                        23
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>PCR的引物
<400>34
cttagattta cggaagacta acaactgcg                  29
<210>35
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Trichosporon beigelii的探针
<400>35
tcggtccacg ttattttctg actgga                     26
<210>36
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Trichosporon beigelii的探针
<400>36
ggactaacag cgtttagctg ttggaa                 26
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus fumigatus的探针
<400>37
ttctggggaa cctcatggcc tt                     22
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus fumigatus的探针
<400>38
atagggatag tcgggggcgt ca                     22
<210>39
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus fumigatus的探针
<400>39
aaagcattcg ccaaggatgt tttcattaa              29
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus fumigatus的探针
<400>40
cggtgtttct atgatgaccc gctc                    24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus fumigatus的探针
<400>41
cttcttaggg ggactatcgg ctca                    24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus niger的探针
<400>42
ggggctcttt tgggtctcgt aatt                    24
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus niger的探针
<400>43
ctggggaatc tcatggcctt cac                    23
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus niger的探针
<400>44
ggatagtcgg gggcgtcagt att                    23
<210>45
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus niger的探针
<400>45
gtgtttctat tatgacccgt tcggca                 26
<210>46
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>用于Aspergillus niger的探针
<400>46
agacctcggc ccttaaatag ccc                    23
<210>47
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>PCR的引物
<400>47
gccctatcaa ctttcgatgg taggatag              28
<210>48
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>PCR的引物
<400>48
aatgctctat ccccagcacg ac                    22
<210>49
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>PCR的引物
<400>49
tcggcacctt acgagaaatc aaagt                 25