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1、(10)申请公布号 CN 102757914 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757914 A *CN102757914A* (21)申请号 201210225605.1 (22)申请日 2012.06.29 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 张梁 石贵阳 王宝顺 丁重阳 顾正华 (74)专利代理机构 无锡华源专利事务所 32228 代理人 冯智文 (54) 发明名称 一株解木聚糖类芽孢。
2、杆菌及用其制备木葡聚 糖酶的方法 (57) 摘要 本发明提供一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其 制备木葡聚糖酶的方法。用解木聚糖类芽孢杆菌 B20 CCTCC M 2012194 作为发酵菌株进行液体发 酵， 制备木葡聚糖酶， 其制备方法包括在斜面培养 基上进行菌种活化， 于液体种子培养基中进行种 子培养， 于发酵培养基中进行液态发酵， 最后得到 含木葡聚糖酶的发酵液。本发明以解木聚糖类芽 孢杆菌 B20 CCTCC M 2012194 发酵制备木葡聚糖 酶， 具有发酵时间短、 生产条件易于控制、 产物易 于分离纯化、 产酶量高的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序。
3、列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 一株解木聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticus） B20， 生物保藏信息为 ： CCTCC No.M 2012149。 2. 一种制备木葡聚糖酶的方法， 其特征在于用权利要求 1 所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20， CCTCC No.M 2012149 作为发酵菌株进行液体发酵， 制备木葡聚糖酶。 3. 根据权利要求 2 所述制备木葡聚糖酶的方法， 其特征在于具体步骤如下 ： （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖。
4、类芽孢杆菌 B20， CCTCC No.M2012149 划线接种于 斜面培养基上， 于2832培养2436h， 所述斜面培养基成份按克/升计为 ： 蛋白胨8 12， 酵母膏 4 6， NaCl 8 12， 琼脂 18 22， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.5 7.0 ； （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的菌种刮下， 接种于置于摇床的液体 种子培养基中， 摇床转速 100 300r/min， 于 28 32振荡培养 12 18h， 所述液体种子 培养基成份按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8 12， 酵母膏 4 6， NaCl 8 12， 木糖 2 5， 其余成 。
5、分为水， 调节 pH 值至 6.0 7.0 ； （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 5 10的接 种量， 接种于置于摇床的发酵培养基中， 摇床转速 150 200r/min， 于 28 32振荡培养 30 40h， 停止发酵， 得到发酵液， 所述发酵培养基成份按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8 12， 酵母 膏 20 24， NaCl 5 7， 木糖 1 3.5， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.5 8.0。 权 利 要 求 书 CN 102757914 A 2 1/6 页 3 一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法 技术领域 0001 。
6、本发明涉及微生物及其制酶技术领域， 尤其涉及一株解木聚糖类芽孢杆菌及其制 酶方法。 背景技术 0002 木葡聚糖酶 (xyloglucanase， XEG)( 编号 EC3.2.1.151) 是水解木葡聚糖主链中 -1， 4- 糖苷键的一类木葡聚糖特异性内切酶， 为一种胞外酶， 在 GH5， GH12， GH16， GH44 和 GH74 家族中均发现其存在。木葡聚糖酶属于纤维素酶系中的一种小组分酶， 对以 -1， 4- 糖苷键为主链结构的多聚糖， 尤其是木葡聚糖具有特异性降解能力， 因此可以降解木葡 聚糖来生产低聚糖。木葡聚糖酶特别是细菌来源的木葡聚糖酶普遍具有较好的热稳定性， 并且在碱性条。
7、件下具有较高活性， 因此可被广泛应用于各行各业中。 在植物生产中， 木葡 聚糖酶是调节植物生长的一种重要酶类， 可用于定向改造出利于酶解的纤维质原料 ； 在 生物乙醇行业中， 木葡聚糖酶可协同纤维素酶降解纤维质原料， 生产生物乙醇 ； 在食品行 业中， 木葡聚糖酶可以使果汁中的浑浊变澄清， 改善果汁质量 ； 在洗涤剂中， 由于木葡聚 糖酶在洗涤剂中表现出稳定的酶活力， 可用作洗衣粉和洗衣液中的酶添加剂。木葡聚糖酶 在其他领域也具有应用潜力， 如木聚糖酶有利于药物传递， 还可用作新型表面活性剂。 0003 利用微生物发酵的方法可生产酶， 但是， 现有技术所报道的产生木葡聚糖酶的微 生物较少， 且。
8、存在发酵时间长、 生产条件不易控制、 产物不易分离纯化、 产酶水平低等缺点。 发明内容 0004 针对现有技术制备木葡聚糖酶存在的上述缺陷， 本发明的目的在于提供一株解木 聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法， 用所述菌株发酵制备木葡聚糖酶， 发酵时 间短， 产酶量高。 0005 本发明的技术方案如下 ： 0006 一株解木聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticus） B20， 生物保藏信息 为 ： CCTCC No.M 2012149。 0007 一种制备木葡聚糖酶的方法， 用上述解木聚糖类芽孢杆菌 B20， CCTCC No.M 2012149 作为发酵菌。
9、株进行液体发酵， 具体步骤如下 ： 0008 （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20， CCTCC No.M2012149 划线接 种于斜面培养基上， 于 28 32培养 24 36h， 所述斜面培养基成份按克 / 升计为 ： 蛋白 胨 8 12， 酵母膏 4 6， NaCl 8 12， 琼脂 18 22， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.5 7.0 ； 0009 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的菌种刮下， 接种于置于摇床的 液体种子培养基中， 摇床转速 100 300r/min， 于 28 32振荡培养 12 18h， 所述液体 种子培养。
10、基成份按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8 12， 酵母膏 4 6， NaCl 8 12， 木糖 2 5， 其 余成分为水， 调节 pH 值至 6.0 7.0 ； 说 明 书 CN 102757914 A 3 2/6 页 4 0010 （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 5 10 的接种量， 接种于置于摇床的发酵培养基中， 摇床转速 150 200r/min， 于 28 32振荡 培养 30 40h， 停止发酵， 得到发酵液， 所述发酵培养基成份按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8 12， 酵母膏 20 24， NaCl 5 7， 木糖 1 3.5， 其余成分。
11、为水， 调节 pH 值至 6.5 8.0。 0011 所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20 是通过如下步骤筛选分离得到 ： 0012 （1） 于 2010 年 3 月自我国江苏省无锡市雪浪山下稻田泥中采集土壤样品 ； 0013 （2） 按照常规技术手段从南瓜中提取粗木葡聚糖 ： 将南瓜切碎烘干， 磨成粉末， 于 65.2水中浸泡 8h， 对浸泡液进行离心分离， 收集沉淀， 将所得沉淀烘干后浸入 0.1M NaOH 溶液中， 浸泡 4h 后收集提取液， 并对该提取液进行离心， 收集残渣， 再将所得残渣浸入 2.7M NaOH 溶液中， 浸泡 12.6h， 收集提取液， 用冰醋酸调节其 pH 值至 5.。
12、0， 离心后收集上清液， 对 该上清液进行透析、 浓缩， 经过冻干得到粗木葡聚糖 ； 最后用所得粗木葡聚糖配制初筛培养 基， 所述初筛培养基成分按重量百分数计为 ： 0.1粗木葡聚糖， 0.2 (NH4)2SO4， 0.05 MgSO47H2O， 0.1 KH2PO4， 0.05 NaCl， 1.5琼脂粉， 其余成分为水 （pH7.0） 。 0014 （3） 富集培养 ： 取 1g 步骤 （1） 所采集的土壤样品混悬于 50mL 生理盐水中， 加入玻 璃珠打散混匀 30min， 取 1mL 打散后的菌悬液加入 50mL LB 液体培养基中振荡培养 14h， 并 将 0.1mL 培养后的菌悬液稀。
13、释 106 倍， 涂布到步骤 （2） 所配制的初筛培养基中， 于 30在 培养箱中培养过夜， 对生长出的菌落进行平板划线分离培养， 获得单菌落， 于 4保存， 所述 LB 液体培养基成分按重量百分数计为 ： 1酵母膏， 0.5蛋白胨， 1 NaCl， 其余成分为水。 0015 （4） 挑取步骤 （3） 所得单菌落点种于经雷马素亮蓝 (Remazol Brilliant Blue) 染 色的木葡聚糖 (AZO-Xyloglucan) 质量百分比为 0.1的复筛培养基平板上， 于 30在培 养箱中培养过夜， 挑取能够产生透明圈的菌株， 于 4保存。所述复筛培养基成分按重量百 分数计为 ： 0.1 。
14、AZO-xyloglucan， 0.2 (NH4)2SO4， 0.05 MgSO47H2O， 0.1 KH2PO4， 0.05 NaCl， 1.5琼脂粉， 其余成分为水 （pH7.0） 。 0016 （5）将步骤 （4）所保存的菌株接种于液体发酵培养基中， 培养 40h 后测定木葡 聚糖酶活力， 有酶活力的即为产酶菌株， 从上述产酶菌株中筛选出一株木葡聚糖酶产量 最高的菌株， 命名为解木聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticus） B20。所述液 体发酵培养基成分按重量百分数计为 ： 0.1 AZO-xyloglucan， 0.2 (NH4)2SO4， 0.05 。
15、MgSO47H2O， 0.1 KH2PO4， 0.05 NaCl， 1.5琼脂粉， 其余成分为水 （pH7.0） 。 0017 本发明所提供的解木聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticus） B20， 已于 2012 年 4 月 27 日保藏于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 保藏编号 ： CCTCC M 2012149， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学。 该菌株以下简称 ： 解木聚糖类芽孢杆菌B20CCTCC M 2012149。 0018 所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012194 菌株具有下述微生物学特征 ： 0019 1形态。
16、特征 0020 解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012194 菌株在 LB 平板培养基上生长 18h， 形 成的菌落较大， 菌落直径 5 8mm， 表面略有褶皱， 边缘不整齐， 可扩散生长， 呈微黄色， 不透 明， 在油镜下观察呈短杆状。 0021 2生理生化特征 0022 依据 伯杰氏手册 （R.E. 布坎南， N.E. 基本斯等编， 科学出版社， 1984） 所述鉴定 方法， 对解木聚糖类芽孢杆菌B20 CCTCC M 2012194菌株进行生理生化鉴定， 其主要生理生 说 明 书 CN 102757914 A 4 3/6 页 5 化特征见表 1。 0023 表 1 0024 。
17、0025 注 ：“-” 表示阴性 ；“+” 表示阳性 ；“ （+） ” 表示弱阳性反应。 0026 3遗传学特征 0027 采用 16S rDNA 测序进行分类学分子鉴定。菌种基因组 DNA 提取过程如下 ： 利用丙 酮破坏细菌细胞壁膜脂质结构， 用裂解液破除细菌细胞膜以释放胞内核酸， 经酚/氯仿/异 戊醇去除蛋白质及多糖， 并用无水乙醇沉淀 DNA， 最后用 TE 缓冲液溶解 DNA。利用 PCR 技术 扩增该菌株的 16S rDNA， 其中， 上游引物 ： 5 -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ， 下游引物 ： 0028 5 -TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3。
18、 。PCR 扩增产物经纯化后交由上海华大基因科技 有限公司进行序列测定， 通过测序分析得到该菌株的 16S rDNA 的碱基序列， 如 SEQ ID NO ： 1 所示。将该序列提交 GeneBank 进行序列比对和同源性分析， 证明该菌株的 16S rDNA 碱 基序列与解木聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticu） 标准株 （Genbank 登录号 ： AB727983.1） 之间具有 99的同源性。 0029 上述内容说明， 本发明菌株在形态特征以及生理生化特征上与解木聚糖类芽孢 杆菌 （Paenibacillus xylanilyticu）相吻合， 与解木。
19、聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticu） 标准菌株相比， 在 16S rDNA 碱基序列方面具有 99的同源性， 因此， 可判断 本发明菌株为解木聚糖类芽孢杆菌 （Paenibacillus xylanilyticu） 。 0030 上述木葡聚糖酶活力的测定方法如下 ： 配制质量百分比浓度为 0.2的木葡聚糖 溶液， 用 pH 5.0 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液溶解， 于 50在水浴恒温振荡器中振荡 4h， 取 100L 发酵液， 加入 900L 上述木葡聚糖溶液中， 混匀， 于 50水浴中反应 5min， 然后于 沸水浴中煮沸 10min（灭酶反应） ， 以。
20、达到灭酶的目的， 加入 1mL DNS 溶液， 于沸水浴中煮沸 说 明 书 CN 102757914 A 5 4/6 页 6 5min， 快速冷却后定容至 10mL， 用紫外分光光度计于 540nm 处测定其吸光度值， 对照溶液为 100L 预先经过 10min 灭酶反应的发酵液， 将所测吸光度值代入葡萄糖标准曲线方程 （以 标准葡萄糖溶液建立标准工作曲线， 以吸光值为横坐标， 以葡萄糖的量为纵坐标） ， 求得酶 活力测定体系中所含还原糖的量， 并根据酶活力单位定义计算出酶活力。所述酶活力单位 （U） 定义为 ： 在 pH 5.0， 温度 50的条件下， 每分钟将底物转化为相当于 1mol 葡。
21、萄糖量 的还原糖量所需要的酶量即为一个酶活力单位。 0031 本发明有益的技术效果为 ： 0032 本发明涉及一种解木聚糖类芽孢杆菌 B20 CCTCC M 2012149， 用所述解木聚糖类 芽孢杆菌作为发酵菌株进行液体发酵培养， 不仅具备细菌发酵产酶的一般性优点， 发酵时 间短、 生产条件易于控制、 产物易于分离纯化， 此外， 该菌株产酶水平高， 在最佳发酵工艺条 件下， 产酶量最高可达 10.88U/mL， 适合大规模工业化生产。 具体实施方式 0033 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述， 以下实施例便于更好 地理解本发明， 但并不限定本发明。 0034 实施例 1 0。
22、035 利用解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 制备木葡聚糖酶的具体步骤如 下 ： 0036 （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 划线接种于 斜面培养基上， 于28下培养24h， 斜面培养基成分按克/升计为 ： 蛋白胨8， 酵母膏4， NaCl 12， 琼脂 22， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.5， 于 115高压灭菌 20min ； 0037 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的 1cm2 面积的菌种刮下， 接种 于液体活化培养基中， 于 28振荡培养 12h， 摇床转速 100r/。
23、min， 液体种子培养基成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8， 酵母膏 4， NaCl 8， 木糖 2， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.0， 于 115高 压灭菌 20min ； 0038 （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 5的接种 量， 接种于发酵培养基中， 发酵培养基装于 250mL 的三角瓶内， 装量为 50mL， 将接种后的发 酵培养基于 32振荡培养 40h， 摇床转速 150r/min， 发酵完毕， 得到发酵液， 发酵培养基成 分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 12， 酵母膏 20， NaCl 7， 木糖 1， 其余成分为水， 调节。
24、 pH 值至 6.5， 于 115高压灭菌 20min。 0039 按照上述木葡聚糖酶活力的测定方法测定所得发酵液中木葡聚糖酶的酶活力， 并 计算出产酶量为 6.08U/mL。 0040 实施例 2 0041 利用解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 制备木葡聚糖酶的具体步骤如 下 ： 0042 （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 划线接种于 斜面培养基上， 于29下培养26h， 斜面培养基成分按克/升计为 ： 蛋白胨9， 酵母膏5， NaCl 11， 琼脂 21， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.6， 于 115。
25、高压灭菌 20min ； 0043 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的 1cm2 面积的菌种刮下， 接种 说 明 书 CN 102757914 A 6 5/6 页 7 于液体活化培养基中， 于 29振荡培养 13h， 摇床转速 150r/min， 液体种子培养基成分按 克 / 升计为 ： 蛋白胨 9， 酵母膏 5， NaCl 9， 木糖 3， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.2， 于 115 高压灭菌 20min ； 0044 （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 6的接种 量， 接种于发酵培养基中， 发酵培养基装于 25。
26、0mL 的三角瓶内， 装量为 50mL， 将接种后的发 酵培养基于 31振荡培养 38h， 摇床转速 160r/min， 发酵完毕， 得到发酵液， 发酵培养基成 分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 11， 酵母膏 21， NaCl 6， 木糖 1.5， 其余成分为水， 调节 pH 值至 7.0， 于 115高压灭菌 20min。 0045 按照上述木葡聚糖酶活力的测定方法测定所得发酵液中木葡聚糖酶的酶活力， 并 计算出产酶量为 8.75U/mL。 0046 实施例 3 0047 利用解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 制备木葡聚糖酶的具体步骤如 下 ： 0048 （1） 斜面。
27、菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 划线接种 于斜面培养基上， 于 30下培养 30h， 斜面培养基成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 10， 酵母膏 6， NaCl 10， 琼脂 20， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.7， 于 115高压灭菌 20min ； 0049 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的 1cm2 面积的菌种刮下， 接种 于液体活化培养基中， 于 30振荡培养 14h， 摇床转速 200r/min， 液体种子培养基成分按 克 / 升计为 ： 蛋白胨 10， 酵母膏 6， NaCl 10， 木糖 4， 其。
28、余成分为水， 调节 pH 值至 6.4， 于 115高压灭菌 20min ； 0050 （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 7的接种 量， 接种于发酵培养基中， 发酵培养基装于 250mL 的三角瓶内， 装量为 50mL， 将接种后的发 酵培养基于 30振荡培养 36h， 摇床转速 170r/min， 发酵完毕， 得到发酵液， 发酵培养基成 分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 10， 酵母膏 22， NaCl 5， 木糖 2.0， 其余成分为水， 调节 pH 值至 7.5， 于 115高压灭菌 20min。 0051 按照上述木葡聚糖酶活力的测定方法测定所。
29、得发酵液中木葡聚糖酶的酶活力， 并 计算出产酶量为 7.36U/mL。 0052 实施例 4 0053 利用解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 制备木葡聚糖酶的具体步骤如 下 ： 0054 （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 划线接种 于斜面培养基上， 于 31下培养 32h， 斜面培养基成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 11， 酵母膏 4， NaCl 9， 琼脂 19， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.8， 于 115高压灭菌 20min ； 0055 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长。
30、的 1cm2 面积的菌种刮下， 接种 于液体活化培养基中， 于 31振荡培养 15h， 摇床转速 250r/min， 液体种子培养基成分按 克 / 升计为 ： 蛋白胨 11， 酵母膏 4， NaCl 11， 木糖 5， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.6， 于 115高压灭菌 20min ； 0056 （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 8的接种 量， 接种于发酵培养基中， 发酵培养基装于 250mL 的三角瓶内， 装量为 50mL， 将接种后的发 说 明 书 CN 102757914 A 7 6/6 页 8 酵培养基于 29振荡培养 34h， 。
31、摇床转速 180r/min， 发酵完毕， 得到发酵液， 发酵培养基成 分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 9， 酵母膏 23， NaCl 7， 木糖 2.5， 其余成分为水， 调节 pH 值至 8.0， 于 115高压灭菌 20min。 0057 按照上述木葡聚糖酶活力的测定方法测定所得发酵液中木葡聚糖酶的酶活力， 并 计算出产酶量为 10.88U/mL。 0058 实施例 5 0059 利用解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 制备木葡聚糖酶的具体步骤如 下 ： 0060 （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 划线接种 于斜。
32、面培养基上， 于 32下培养 34h， 斜面培养基成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 12， 酵母膏 5， NaCl 8， 琼脂 18， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.9， 于 115高压灭菌 20min ； 0061 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的 1cm2 面积的菌种刮下， 接种 于液体活化培养基中， 于 32振荡培养 16h， 摇床转速 300r/min， 液体种子培养基成分按 克 / 升计为 ： 蛋白胨 12， 酵母膏 5， NaCl 12， 木糖 2， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.8， 于 115高压灭菌 20min ； 0062 （3）。
33、 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 9的接种 量， 接种于发酵培养基中， 发酵培养基装于 250mL 的三角瓶内， 装量为 50mL， 将接种后的发 酵培养基于 28振荡培养 32h， 摇床转速 190r/min， 发酵完毕， 得到发酵液， 发酵培养基成 分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8， 酵母膏 24， NaCl 6， 木糖 3， 其余成分为水， 调节 pH 值至 6.5， 于 115高压灭菌 20min。 0063 按照上述木葡聚糖酶活力的测定方法测定所得发酵液中木葡聚糖酶的酶活力， 并 计算出产酶量为 6.26U/mL。 0064 实施例 6 006。
34、5 利用解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 制备木葡聚糖酶的具体步骤如 下 ： 0066 （1） 斜面菌种活化 ： 将所述解木聚糖类芽孢杆菌 B20CCTCC M 2012149 划线接种 于斜面培养基上， 于 32下培养 36h， 斜面培养基成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 12， 酵母膏 6， NaCl 9， 琼脂 19， 其余成分为水， 调节 pH 值至 7.0， 于 115高压灭菌 20min ； 0067 （2） 种子培养 ： 将步骤 （1） 所述斜面培养基上生长的 1cm2 面积的菌种刮下， 接种于 液体活化培养基中， 于 28振荡培养 18h， 摇床转速 3。
35、00r/min， 液体种子培养基成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 8， 酵母膏 6， NaCl 11， 木糖 3， 其余成分为水， 调节 pH 值至 7.0， 于 115高 压灭菌 20min ； 0068 （3） 液体发酵培养 ： 将经过步骤 （2） 培养所得活化种子液按体积百分比 10的接 种量， 接种于发酵培养基中， 发酵培养基装于 250mL 的三角瓶内， 装量为 50mL， 将接种后的 发酵培养基于 30振荡培养 30h， 摇床转速 200r/min， 发酵完毕， 得到发酵液， 发酵培养基 成分按克 / 升计为 ： 蛋白胨 12， 酵母膏 20， NaCl 5， 木糖 3.5， 其余成分为水， 调节 pH 值至 8.0， 于 115高压灭菌 20min。 0069 按照上述木葡聚糖酶活力的测定方法测定所得发酵液中木葡聚糖酶的酶活力， 并 计算出产酶量为 9.14U/mL。 说 明 书 CN 102757914 A 8 1/2 页 9 0001 序 列 表 CN 102757914 A 9 2/2 页 10 0002 序 列 表 CN 102757914 A 10 。