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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410749202.6 (22)申请日 2014.12.09 CCTCC NO ： M 2012432 2012.10.26 C12N 1/20(2006.01) C12P 1/06(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 饶志明 郭静 杨套伟 徐美娟 张显 满在伟 (54) 发明名称 一株新型高产黑色素的菌株 Streptomyces kathirae SC-1 (57) 摘要 本发明成功筛选到一株以酪氨酸为底。
2、物， 生 产黑色素的菌株， 通过 16S rRNA 鉴定， 发现该 菌 株 与 Streptomyces kathirae 相 似 度 最 高， 故将其命名为 Streptomyces kathirae SC-1， 与国内外已报道产黑色素链霉菌 16Sr RNA 进 行对比， 发现其最高相似度仅为 95.37， 说明 Streptomyces kathirae SC-1 是一株新型产黑 色素链霉菌， 该菌株已保藏于中国典型培养物保 藏中心， 保藏编号为 ： CCTCC M 2012432。对该菌 株所产黑色素进行了光谱学鉴定， 证明所产黑色 物质为黑色素， 发现该黑色素可以螯合 Cu2+、 A。
3、l3+、 Fe3+， 并且对 Al3+的螯合作用尤其显著。因此， S.kathirae SC-1为一种新型产黑色素菌株。 在种 子培养基中活化后， 接种于最优培养基中， 28， 200rpm 的摇床上发酵 5d， 该菌株的黑色素产量可 达到 13.7g/L， 达到领先水平。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104403975 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104403975 A 1/1 页 2 1. 一株产黑色素的链霉菌 Strepto。
4、myces kathirae SC-1， 以酪氨酸为底物产黑色素， 由中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为 CCTCC M 2012432。 2. 权利要求 1 所述的链霉菌菌株在生产黑色素的应用， 挑取平板单菌落接种于种子培 养基 g/L ： 葡萄糖 1， 蛋白胨 10， NaCl 5,CaCl2 0.1, 琼脂 20， pH 6.0， 28 ,200rpm 的摇床 培养12h,按照10的接种量转接于最优发酵培养基(g/L) ： 可溶性淀粉4， 酵母膏37， NaCl 5， CaCl2 0.1， CuSO4 1.34110-2， 酪氨酸 4， 抗坏血酸 2， pH 6.0， 28， 20。
5、0rpm 的摇床上发 酵 5d ； 收集发酵液离心取上清液， 按照适当的倍数进行稀释， 以水为空白对照测其在 400nm 下的吸光度， 通过标准曲线算出该菌株的黑色素产量为 13.7g/L。 权 利 要 求 书 CN 104403975 A 2 1/4 页 3 一株新型高产黑色素的菌株Streptomyces kathirae SC-1 技术领域 0001 从土壤中筛选黑色素高产菌株， 属于生物工程中发酵技术领域。 技术背景 0002 随着有关人造黑色素的致癌、 致病的报道不断增多， 人们日益关注人造色素对人 体造成的危害。人们对色素的生物安全性的关注度越来越高。天然的黑色素是非均质多 酚类聚。
6、合体， 以酪氨酸为底物， 由酪氨酸酶催化后生成 L- 多巴、 多巴铬等， 而后经过一系列 非酶催化的氧化反应最终生成黑色素。黑色素广泛存在于动植物和微生物中， 与生物自我 保护机制有关。有研究表明， 天然的黑素色具有紫外吸收、 抗氧化、 清除自由基、 螯合阳离 子 ( 例如有毒的重金属 )、 新型的药物载体、 作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾 病， 例如着色性干皮病、 帕金森氏症、 老年性痴呆症、 亨廷氏舞蹈病等， 有报道指出， 可溶性 的黑色素在体外具有抗 HIV 的活性， 为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主 要为动植物提取和采用化学法以酪氨酸为原料生产， 这两种方法成本。
7、高、 工艺繁琐， 使黑色 素因价格昂贵而限制其大规模的生产与应用。 微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶 催化酪氨酸形成的多巴类黑色素， 是氨基酸的衍生物， 具有无毒、 无害等特点， 而且产黑色 素的微生物种类繁多， 生产工艺简单， 易于操作， 不受时间与地域的限制， 因此用微生物来 生产黑色素具有巨大的优势。 0003 本实验室从土壤中筛选到一株新型高产黑色素的链霉菌， 并且对其进行进行了菌 株鉴定， 确定其为 Streptomyces kathirae SC-1， 与国内外已报道产黑色素链霉菌 16Sr RNA进行对比， 发现其最高相似度仅为95.37， 说明Streptomyces k。
8、athirae SC-1是一株 新型产黑色素链霉菌， 目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 ： CCTCC M 2012432， 对其培养基进行了响应面优化， 培养条件进行了优化， 确定了该菌株产黑色素的 最佳培养基及培养条件， 在三角瓶中该菌的黑色素产量可达 13.7g/L， 达到国内领先水平， 并且初步研究了该菌所产黑色素的理化性质， 为微生物法生产黑色素进行了有益的探索。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一株新型高产黑色素的菌株 Streptomyces kathirae SC-1， 对其所产黑色素进行了理化性质的研究， 并且通过响应面发确定了该菌发酵产黑色 素的。
9、最适培养基， 为该菌发酵产黑色素进行了有益的探索。微生物所产的黑色素是由其体 内的酪氨酸酶催化酪氨酸生成， 是氨基酸的衍生物， 具有无毒、 无害等特点， 而且产黑色素 的微生物种类繁多， 生产工艺简单， 易于操作， 不受时间与地域的限制， 因此用微生物来生 产黑色素具有巨大的优势。 0005 本发明的技术方案 ： 0006 筛选方法 ： 以土壤中筛选的菌株为出发菌株， 通过分光光度法测定发酵液中黑 色素的含量， 筛选到一株能以酪氨酸为底物高产黑色素的菌株， 通过 16S rDNA 鉴定， 通过 NCBI 进行 Blast 对比， 发现该菌株与 Streptomyces kathirae 相似度。
10、最高， 故将其命名为 说 明 书 CN 104403975 A 3 2/4 页 4 Streptomyces kathirae SC-1， 该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 ： 2012432。而后对该菌株所产黑色素进行了光谱学鉴定， 金属螯合研究。并且通过响应面发 确定了该菌发酵产黑色素的最适培养基。 0007 (1) 目的菌株的筛选及鉴定 0008 目的菌株的筛选 ： 采用涂布平板法进行菌株的分离， 将从自然界中采取的土样经 无菌蒸馏水稀释后涂布于初筛培养基 ( 葡萄糖 1， 蛋白胨 10,NaCl 5,CaCl20.1, 酪氨酸 2， 琼脂 20， pH 6.0)， 倒。
11、置于 30培养， 24h 后开始观察， 每日一次， 第 5 天结束。然后分离， 纯 化可以将初筛培养基染黑的菌株 ( 如附图所示 )， 通过复筛后找到黑色素生产迅速且产量 高的菌株。 0009 产黑色素菌株的鉴定 ： 菌株生理生化鉴定按照 链霉菌鉴定手册进行 ； 菌株 16S rDNA 经测序后通过 NCBI 进行 blast 对比， 最终确定该菌分类。 0010 (2) 黑色素的提取、 光谱学鉴定及金属螯合研究 0011 黑色素的提取过程 ： 采用酸化沉淀提取黑色素的方法 . 将发酵液离心 , 去菌体 , 上清液用 6molL-1的 HCl 调 pH 值至 2, 静置过夜 , 使其充分沉淀 。
12、, 离心后得黑色素的粗 提物 ； 粗提物用 1molL-1的 NaOH 溶液充分溶解 , 离心后 , 将上清液再次用 6molL-1的 HCl 调 pH 值至 2, 静置 4h 离心得絮状沉淀物重悬于二次蒸馏水中 , 洗涤至中性后冷冻干 燥 ； 干粉在 6molL-1的 HCl 中酸解 4h 后 , 依次在氯仿、 乙酸乙酯、 乙醇等有机溶剂中进行 抽提 , 最后得到的固体物用二次蒸馏水清洗 3 次后 , 至于 70的烘箱中 24h， 使其充分干 燥， 即为纯化的黑色素。 0012 黑色素的紫外光谱 ： 将少量的黑色素溶解于 0.5molL-1的 NaOH 溶液， 在 200-800nm 的波长。
13、下进行紫外扫描。 0013 黑色素的红外光谱 ： 将1-2mg左右的黑色素与干燥的KBr混匀后充分研磨， 压片后 在谱域为 4000 400cm-1的范围内进行黑色素的红外分光光谱测定。 0014 黑色素的金属螯合 ： 分别配置Na+、 Mg2+、 Al3+、 Fe3+、 Ca2+、 Mn2+、 Cu2+含量为110-3M的 适当浓度的、 pH 8.0的黑色素溶液， 在室温下放置0h、 24h后分别取样， 5000rpm离心10min， 在 OD400下测上清的吸光度。 0015 (3) 黑色素高产菌株的发酵优化 0016 在几种备选的培养基进行该菌株黑色素的发酵， 找到最适合的培养基作为发酵。
14、优 化的初始培养基， 在次培养基的基础上通过 Plack-Burman 实验， 最陡爬坡实验， 中心组合 实验确定最优发酵培养基。 0017 本发明的有益效果 ： 以从土壤中筛选的菌株 Streptomyces kathirae SC-1 作为 出发菌株， 而该种菌株产黑色素的研究还未见报道。在种子培养基中活化后， 接种于最优 培养基中， 28 ,200rpm 的摇床上发酵 5d 后， 通过标准曲线计算该菌株的黑色素产量可达 到 ,13.7g/L， 达到较高水平。此外， 目前还没有利用 S.kathirae 发酵生产黑色素的相关报 道， 因此该菌株是一株新型的黑色素生产菌株。目前国内用微生物法。
15、发酵生产黑色素处于 初级阶段， 本发明为微生物法发酵生产黑色素进行了有益的探索。 附图说明 0018 图 1 菌株在筛选培养基中产黑色素情况 说 明 书 CN 104403975 A 4 3/4 页 5 0019 具体实施方法 0020 实施例 1 ： 菌株的筛选与鉴定 0021 目的菌株的筛选 ： 采用涂布平板法进行菌株的分离， 将1g土样倒入10ml的无菌蒸 馏水中， 置于摇床中 30、 150r/min 摇 30 分钟， 使其充分混匀， 取出 1ml 倒入另外一只 9ml 的无菌蒸馏水中依次作 10 倍系列稀释， 取 200l 10-5和 10-6的稀释液涂布于初筛培养基 ( 葡萄糖 1。
16、， 蛋白胨 10， NaCl 5,CaCl20.1, 酪氨酸 2， pH 6.0)， 每个稀释度涂布的平板为 2 个， 倒置于 30培养， 24h 后开始观察， 每日一次， 第 5 天结束。然后分离， 纯化可以将初筛 培养基染黑的菌株 ( 如附图所示 )， 通过复筛后找到黑色素生产迅速且产量高的菌株。 0022 产黑色素菌株的鉴定 ： 菌株生理生化鉴定按照 链霉菌鉴定手册进行 ； 16S rDNA 鉴定过程为 ： 提取 Streptomyces kathirae SC-1 总 DNA。使用通用引物 ( 引物 1:5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 、 引物 2 ： 5 -GGT。
17、TACCTTGTT ACGACTT-3 ， 上海生物工程公 司)扩增Streptomyces kathirae SC-116S rDNA。 PCR扩增条件 ： 94预变性5min ； 94变 性 50s， 58退火 1.5min， 72延伸 2min， 35 个循环 ； 72延伸 10min。将扩增产物用 0.8 琼脂糖凝胶电泳， Goldview 染色， 在在紫外灯下观测结果， 胶回收后连接 pMD-18T 载体转化 大肠杆菌 E.coli JM109 经过 Amp 平板筛选后交送上海生物工程公司进行测序。在 NCBI 中 与数据库已有序列进行比较分析， 采用 ClustalX1.8 进行多。
18、重序列匹配排列， Mega 4.0 构 建系统发育树。 0023 实施例 2 ： 黑色素的提取、 光谱学鉴定及金属螯合研究 0024 采用酸化沉淀提取黑色素的方法 . 将发酵液离心 , 去菌体 , 上清液用 6molL-1 的 HCl 调 pH 值至 2 3 左右 , 静置过夜 , 使其充分沉淀 , 离心后得黑色素的粗提物 ； 粗 提物用 1molL-1的 NaOH 溶液充分溶解 , 离心后 , 将上清液再次用 6molL-1的 HCl 调 pH 值至 2 3 左右 , 静置 4h 离心得絮状沉淀物重悬于二次蒸馏水中 , 洗涤至中性后冷冻干 燥 ； 干粉在 6molL-1的 HCl 中酸解 4。
19、h 后 , 依次在氯仿、 乙酸乙酯、 乙醇等有机溶剂中进行 抽提 , 最后得到的固体物用二次蒸馏水清洗 3 次后 , 至于 70的烘箱中 24h， 使其充分干 燥， 即为纯化的黑色素。将提取的黑色素用 0.5M 的 NaOH 溶解后配制不同浓度的黑色素碱 溶液， 以黑色素浓度为横坐标， 在 400nm 处的吸光度为纵坐标制作标准曲线。 0025 黑色素的紫外光谱 ： 将少量的黑色素溶解于 0.5molL-1的 NaOH 溶液， 在 200-800nm 的波长下进行紫外扫描。 0026 黑色素的红外光谱 ： 将1-2mg左右的黑色素与干燥的KBr混匀后充分研磨， 压片后 在谱域为 4000 40。
20、0cm-1的范围内进行黑色素的红外分光光谱测定。 0027 黑色素的金属螯合 ： 分别配置Na+、 Mg2+、 Al3+、 Fe3+、 Ca2+、 Mn2+、 Cu2+含量为110-3M的 适当浓度的、 pH 8.0的黑色素溶液， 在室温下放置0h、 24h后分别取样， 5000rpm离心10min， 在 OD400下测上清的吸光度。 0028 实施例 3 ： 黑色素高产菌株的发酵优化 0029 在几种备选的培养基进行该菌株黑色素的发酵， 找到最适合的培养基作为发酵优 化的初始培养基， 在初始培养基的基础上通过 Plack-Burman 实验确定影响黑色素产量最 显著因素为可溶性淀粉、 酵母膏。
21、与硫酸铜， 通过最陡爬坡实验逼近最大相应区域， 中心组合 实验确定最优发酵培养基。挑取平板单菌落接种于种子培养基 ( 葡萄糖 1， 蛋白胨 10， NaCl 5,CaCl20.1,pH 6.0)， 28,200rpm的摇床培养12h,按照10的接种量转接于发酵培养基 说 明 书 CN 104403975 A 5 4/4 页 6 ( 可溶性淀粉 4， 酵母膏 37， NaCl 5， CaCl20.1， CuSO41.34110-2， 酪氨酸 4， 抗坏血酸 2， pH 6.0)， 28 ,200rpm 的摇床上发酵 5d。收集发酵液离心取上清液， 按照适当的倍数进行稀 释， 以水为空白对照测其在 400nm 下的吸光度， 通过标准曲线算出该菌株的黑色素产量为 13.7g/L。 说 明 书 CN 104403975 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 104403975 A 7 。