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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711144593.9 (22)申请日 2017.11.17 (83)生物保藏信息 CCTCC M 2017159 2017.03.31 (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人 应优敏张才学黄禄占扎君 单伟光 (74)专利代理机构 杭州赛科专利代理事务所 (普通合伙) 33230 代理人 冯年群施王蓉 (51)Int.Cl. C07D 491/18(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12N。
2、 1/14(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种石杉碱乙衍生物及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及生物医药领域， 具体地说是利用 蛇足石杉内生真菌BjerkanderaadustaCCTCC M2017159对石杉碱乙进行微生物转化， 获得了 一个结构新颖的石杉碱乙衍生物。 本发明提供的 石杉碱乙衍生物结构如式(1)所示。 本发明提供 的石杉碱乙衍生物制备方法， 是将蛇足石杉内生 真菌接种至发酵培养基， 同时加入石杉碱乙作为 底物， 在25-28、 180rpm条件下发酵培养， 取发 酵液进行分离纯化， 获得所述石杉碱乙衍生物。 本发明所涉及的石杉。
3、碱乙衍生物为新化合物， 结 构新颖； 截至目前， 未见任何天然植物提取法或 化学结构修饰法可制备该衍生物。 本发明的制备 方法具有发酵条件简单、 菌种易培养、 转化率高 等优势， 有助于后续的产业化开发， 权利要求书1页 说明书5页 附图7页 CN 108218884 A 2018.06.29 CN 108218884 A 1.一种式(1)所示的石杉碱乙衍生物， 其特征在于， 所述的化合物为白色无定型粉末， 分子式为C16H20N2O2， 分子中C8和C15之间形成环氧结构， 2.一种权利要求1所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在于， 利用蛇足石杉内生真 菌对石杉碱乙进行生物转化获得； 所。
4、述方法是将蛇足石杉内生真菌接种至发酵培养基， 同 时加入石杉碱乙， 在25-28、 180rpm条件下发酵培养， 取发酵液进行分离纯化， 获得所述石 杉碱乙衍生物； 所述发酵培养基终浓度组成为碳源5-30g/L、 氮源10-25g/L、 无机盐1-5g/L， 溶剂为水， pH值自然。 3.如权利要求2所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在于， 所述碳源为葡萄糖、 甘 露醇、 甘油、 糊精或半乳糖中的一种或任几种。 4.如权利要求2所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在于， 所述氮源为黄豆粉、 蛋 白胨或马铃薯浸出粉中的一种或任几种。 5.如权利要求2所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在。
5、于， 所述无机盐为磷酸氢二 钾或磷酸二氢钾。 6.如权利要求2所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在于， 所述加入发酵培养基的 石杉碱乙事先溶解于无水乙醇， 浓度10mg/mL， 并在无菌条件下经0.22 m微孔滤膜过滤， 其 在发酵液中的终浓度为0.03-0.2mg/mL。 7.如权利要求2所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在于， 蛇足石杉内生真菌发酵 液制备方法为： (1)将蛇足石杉内生真菌接种至斜面培养基， 在25-28培养5-7天， 获得斜 面菌体； 所述斜面培养基终浓度组成为： 葡萄糖10-30g/L， 马铃薯浸出粉5-25g/L， KH2PO4 0.5-2g/L， 琼脂10-。
6、20g/L， 溶剂为水， pH值自然； (2)将斜面菌体接种至种子培养基， 在25-28 、 180rpm、 体积装液量30条件下培养7天， 获得种子液； 所述种子培养基终浓度组成为： 葡萄糖10-50g/L， 马铃薯浸出粉5-25g/L， KH2PO4 0.5-2g/L， 溶剂为水， pH值自然； (3)将种子 液以体积浓度5-10的接种量接种至发酵培养基， 同时在发酵培养基中加入石杉碱乙， 在 25-28、 180rpm、 体积装液量30条件下培养14天， 获得发酵液； 所述发酵培养基终浓度组 成为： 葡萄糖5-30g/L， 马铃薯浸出粉10-25g/L， KH2PO4 1-5g/L， 溶。
7、剂为水， pH值自然。 8.如权利要求2所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 其特征在于， 所述发酵液分离纯化方 法为： (1)将发酵液过滤除去菌丝， 用氨水调节发酵液pH至9-11， 用氯仿萃取3次， 合并有机 层， 减压浓缩至无液体流出， 得氯仿萃取物； (2)将步骤(1)氯仿萃取物经经硅胶柱层析分 离， 依次用体积比40 1、 20 1、 15 1、 8 1、 6 1的氯仿-甲醇溶液洗脱， 每个洗脱液洗脱2个柱 体积， 收集体积比8 1的氯仿-甲醇溶液的流出液； (3)将步骤(2)收集的流出液浓缩至干， 用 ODS C18柱层析进行纯化， 用体积比3 1的甲醇-水溶液洗脱， 薄层层析检测各个流。
8、出液， 合 并含目标组分的流出液， 减压浓缩即得石杉碱乙衍生物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108218884 A 2 一种石杉碱乙衍生物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 尤其涉及一种新的石杉碱乙衍生物以及制备该衍 生物的微生物转化方法。 背景技术 0002 石松生物碱(Lycoodium alkaloids)是从蕨类植物石松及其近缘植物中分得的结 构相似、 具有相同生源的一类天然生物碱。 从结构上看， 多是一类基本骨架由C16N或C16N2组 成的三环或四环的化合物。 目前， 已经报道的石松生物碱类天然产物超过300个， 涵盖多种 新颖骨架。 其中研究最。
9、为深入的是具有C16N2石松定碱骨架的石杉碱甲(huperzine A， hupA) 和石杉碱乙(huperzine B， hupB)， 两者均为高效、 可逆、 高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂， 可用于治疗阿尔茨海默症， 同时对重症肌无力、 记忆障碍、 血管性痴呆具有显著的疗效。 近 年来， 石杉碱甲受到了研究人员的广泛关注， 研究热点主要集中于该化合物的衍生物制备、 活性评价以及构效关系等方面。 相比石杉碱甲， 石杉碱乙的活性相对较弱， 研究相对较少。 然而， 石杉碱乙的治疗指数和作用时间均优于石杉碱甲， 因此仍被认为是极具研究与开发 价值的分子之一。 深入研究石杉碱乙衍生物的结构与AChE抑。
10、制活性， 有望获得新型的AChE 抑制剂， 完善该类型生物碱抑制AChE的构效关系。 0003 目前， 石杉碱乙衍生物的来源主要有两种： 一、 从蛇足石杉植株中提取。 从天然来 源提取是获得天然产物及其衍生物的常用方法之一。 然而， 由于蛇足石杉属于高等蕨类植 物， 生长缓慢(自然生长周期长达1015年)， 孢子萌发率低， 野生资源匮乏， 属于再生困难 的资源， 因此严重限制这一方法的实施与开展。 此外， 蛇足石杉化学成分极其复杂， 存在多 种其他类型的石松生物碱， 这为从植物中提取石杉碱乙类结构造成了另一障碍。 二、 化学法 结构修饰。 利用化学法开展结构修饰是获得天然产物衍生物另一常用方法。
11、。 然而， 由于石杉 碱乙分子结构存在较强的刚性， 对其开展化学法结构修饰难度较大， 目前已经报道的修饰 也主要集中于其结构中的吡啶酮环和游离氨基， 结构修饰位点较单一。 而且， 多数化学合成 路线存在反应条件苛刻、 目标产物收率低、 无法实现工业化生产等技术障碍。 0004 微生物生物转化是获得天然产物衍生物的一种新兴手段， 其本质是利用微生物产 生的酶(系)对外源添加物进行结构修饰的过程， 具有操作简便、 条件温和、 选择性高、 立体 专一性强等优势， 而且可以完成非活化饱和碳链的氧化、 醚键的断裂等化学方法难以进行 的反应。 2010年， Zhang等首次报道了利用未知来源细菌Strep。
12、tomyces griseus CACC 200300开展石杉碱甲生物转化的实验， 获得5个石杉碱甲衍生物， 包括3个新化合物(Zhang XY， Zou JH， Dai JG， Tetrahedron Lett.， 2010， 51， 3840-3842.)； 2014年， 申请人利用蛇足 石杉内生真菌Ceriporia lacerate HS-ZJUT-C13A开展了石杉碱甲生物转化， 获得4个具有 新颖骨架的石杉碱甲衍生物， 但是转化率都较低(Ying YM， Shan WG， Zhan ZJ， J.Nat.Prod.， 2014， 77， 2054-2059.)。 然而， 针对石杉碱乙。
13、的微生物转化研究鲜有报道。 发明内容 说明书 1/5 页 3 CN 108218884 A 3 0005 本发明目的是克服现有石杉碱乙衍生物结构多样性不丰富、 制备工艺繁琐等缺 陷， 提供一种新的石杉碱乙衍生物及其制备方法。 0006 本发明采用的技术方案是： 0007 本发明提供一种式(1)所示的石杉碱乙衍生物， 0008 0009 所述石杉碱乙衍生物为白色无定型粉末， 分子式为C16H20N2O2， 分子中C8和C15之间 形成环氧结构。 0010 本发明还提供一种所述石杉碱乙衍生物的制备方法， 是以蛇足石杉内生真菌 Bjerkandera adusta ZJUT-HS8为发酵菌， 该菌株。
14、已保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏 编号为CCTCC M 2017159， 保藏日期为2017年3月31日， 保藏单位地址为中国， 武汉， 武汉大 学。 0011 在发酵液中添加石杉碱乙作为底物， 按常规方法培养发酵、 提取分离得到， 优选所 述方法是将蛇足石杉内生真菌接种至发酵培养基， 在25-28、 180rpm条件下发酵培养， 取 发酵液进行分离纯化， 获得所述石杉碱乙衍生物； 所述发酵培养基质量终浓度组成为： 碳源 5-30g/L、 氮源10-25g/L、 无机盐1-5g/L， 溶剂为水， pH值自然。 0012 进一步， 所述碳源为： 葡萄糖、 甘露醇、 甘油、 糊精和半乳糖中的。
15、一种或任几种， 优 选葡萄糖。 0013 进一步， 所述氮源为黄豆粉、 蛋白胨或马铃薯浸出粉中的一种或任几种， 优选马铃 薯浸出粉。 0014 进一步， 所述无机盐为磷酸氢二钾或磷酸二氢钾， 优选磷酸氢二钾。 0015 进一步， 所述发酵培养基终浓度组成为： 葡萄糖5-30g/L， 马铃薯浸出粉10-25g/L， KH2PO41-5g/L， 溶剂为水， pH值自然， 更优选所述发酵培养基终浓度组成为： 葡萄糖20g/L， 马 铃薯浸出粉25g/L， KH2PO42g/L， 溶剂为水， pH值自然。 0016 进一步， 蛇足石杉内生真菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8发酵液。
16、制备方法为： (1)将蛇足石杉内生真菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8接种至斜面培养基， 在25-28培 养5-7天， 获得斜面菌体； 所述斜面培养基终浓度组成为： 葡萄糖10-30g/L， 马铃薯浸出粉5- 25g/L， KH2PO40.5-2g/L， 琼脂10-20g/L， 溶剂为水， pH值自然； (2)将斜面菌体接种至种子培 养基， 在25-28、 180rpm、 体积装液量30条件下培养7天， 获得种子液； 所述种子培养基终 浓度组成为： 葡萄糖10-50g/L， 马铃薯浸出粉5-25g/L， KH2PO40.5-2g/L， 溶剂为水， pH值自 然； (3)将。
17、种子液以体积浓度5-10的接种量接种至发酵培养基， 同时在发酵培养基中加入 石杉碱乙(溶解于无水乙醇， 并在无菌条件下经0.22 m微孔滤膜过滤除菌)， 在25-28、 180rpm、 体积装液量30条件下培养14天， 获得发酵液； 所述发酵培养基终浓度组成为： 葡 萄糖5-30g/L， 马铃薯浸出粉10-25g/L， KH2PO41-5g/L， 溶剂为水， pH值自然。 0017 进一步， 所述发酵液分离纯化方法可以采用常规的方法进行提取分离， 比如经过 说明书 2/5 页 4 CN 108218884 A 4 过滤得菌丝体， 菌丝体干燥后可以用浸提、 萃取、 硅胶柱层析等常规方法和常用溶剂。
18、进行提 取分离， 具体优选方法为： (1)将发酵液过滤除去菌丝， 用氨水调节发酵液pH至9-11， 用氯仿 萃取3次， 合并有机层， 减压浓缩至无液体流出， 得氯仿萃取物； (2)将步骤(1)氯仿萃取物经 硅胶柱层析分离， 依次用体积比40 1、 20 1、 15 1、 8 1、 6 1的氯仿-甲醇溶液洗脱， 每个洗脱 液洗脱2个柱体积， 收集体积比8 1的氯仿-甲醇溶液的流出液； (3)将步骤(2)收集的流出液 浓缩至干， 用ODS C18柱层析进行纯化， 用体积比3 1的甲醇-水溶液洗脱， 薄层层析检测各 个流出液， 合并含目标组分的流出液， 减压浓缩即得石杉碱乙衍生物。 0018 与现有。
19、技术相比， 本发明有益效果主要体现在： 本发明所涉及的石杉碱乙衍生物 为新化合物， 结构新颖， 尚未见任何天然植物提取法或化学结构修饰法可制备该衍生物。 本 发明的制备方法具有发酵条件简单、 菌种易培养、 转化率高等优势， 有助于后续的产业化开 发。 附图说明 0019 图1为采用本发明方法制得的石杉碱乙衍生物的1H-NMR谱图。 0020 图2为采用本发明制得的石杉碱乙衍生物的13C-NMR谱图。 0021 图3为采用本发明制得的石杉碱乙衍生物的HSQC谱图 0022 图4为采用本发明制得的石杉碱乙衍生物的1H-1H COSY谱图 0023 图5为采用本发明制得的石杉碱乙衍生物的HMBC谱图。
20、 0024 图6为采用本发明制得的石杉碱乙衍生物的NOESY谱图 0025 图7为采用本发明制得的石杉碱乙衍生物的高分辨质谱 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此： 0027 实施例1利用蛇足石杉内生真菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8转化制备石杉碱 乙衍生物的方法 0028 1、 发酵培养制备Bjerkandera adusta ZJUT-HS8发酵物 0029 1)菌种： 蛇足石杉内生真菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8， 该菌株已保藏于中国 典型培养物保藏中心， 保藏编号为Bjer。
21、kandera adusta ZJUT-HS8， 保藏日期为2017年3月 31日， 保藏单位地址为中国， 武汉， 武汉大学 0030 2)斜面培养及保存 0031 固体培养基： 葡萄糖3g， 马铃薯浸出粉0.5g， KH2PO40.2g， 琼脂1.5g， 加水到100mL， pH值自然。 0032 固体培养方法： 蛇足石杉内生真菌Bjerkandera adusta ZJUT-HS8菌株接种于固 体培养基斜面上， 28培养5-7天。 固体培养结束后， 斜面放置4-10冷藏备用。 30的甘油 冷冻管的制备： 在无菌状态下， 将试管斜面用6ml灭菌的30甘油洗下， 分装至甘油管中 (3ml/支)。
22、， 放置-20冷藏备用。 0033 3)摇瓶种子培养 0034 培养基： 葡萄糖3g， 马铃薯浸出粉1g， KH2PO40.2g， 加水到100mL， pH值自然。 说明书 3/5 页 5 CN 108218884 A 5 0035 装液量： 500mL三角瓶里装150mL培养基 0036 接种量： 30的甘油冷冻菌丝3mL 0037 培养温度： 28 0038 培养时间： 7天 0039 摇床转速： 150rpm 0040 将30的甘油冷冻菌丝按以上接种量接入摇瓶种子培养基中， 培养后， 镜检菌丝 粗壮， 染色深， 无染菌， 菌浓15。 0041 4)摇瓶发酵培养 0042 培养基： 葡萄糖。
23、2g， 马铃薯浸出粉2.5g， KH2PO40.2g， 加水到100mL， pH值自然。 0043 装量： 250mL三角瓶里装100mL培养基， 共使用50个三角瓶。 0044 接种量： 培养基体积的10； 0045 底物溶液(石杉碱乙无水乙醇溶液， 10mg/mL)加入量： 0.3mL 0046 发酵液中底物终浓度： 0.03mg/mL 0047 培养温度： 28； 0048 培养时间： 15天； 0049 摇床转速： 180rpm； 0050 2、 提取分离获得石杉碱乙衍生物 0051 发酵结束后， 将发酵液(5L)过滤除去菌丝， 用氨水调节发酵液pH至9-11， 用等体积 氯仿萃取3次。
24、， 合并有机层， 减压浓缩至无液体流出， 得氯仿萃取物(850mg)； (2)将步骤(1) 氯仿萃取物经硅胶柱层析分离， 依次用体积比40 1、 20 1、 15 1、 8 1、 6 1的氯仿-甲醇溶液 洗脱， 每个洗脱液洗脱2个柱体积， 收集体积比8 1的氯仿-甲醇溶液的流出液； (3)将步骤 (2)收集的流出液浓缩至干， 用ODS C18柱层析进行纯化， 用体积比3 1的甲醇-水溶液洗脱， 以氯仿： 甲醇8 1为展开剂进行薄层层析检测， 合并比移值(Rf值)为0.25左右的部分， 减 压浓缩即得化合物1(35.3mg)， 转化产率约为23.5。 0052 实施例2石杉碱乙衍生物的理化性质及。
25、波谱数据 0053化合物1： 白色无定型粉末； 分子式为C16H20N2O2； 旋光 红外vmax 3371， 2927， 1648， 1610， 1553， 1452， 1381， 916cm-1； 氢谱及碳谱见表1； 高分辨质谱 (ESI)m/z： 273.1606M+H+。 0054 表1石杉碱乙衍生物核磁数据(溶剂为氘代氯仿) 说明书 4/5 页 6 CN 108218884 A 6 0055 说明书 5/5 页 7 CN 108218884 A 7 图1 说明书附图 1/7 页 8 CN 108218884 A 8 图2 说明书附图 2/7 页 9 CN 108218884 A 9 图3 说明书附图 3/7 页 10 CN 108218884 A 10 图4 说明书附图 4/7 页 11 CN 108218884 A 11 图5 说明书附图 5/7 页 12 CN 108218884 A 12 图6 说明书附图 6/7 页 13 CN 108218884 A 13 图7 说明书附图 7/7 页 14 CN 108218884 A 14 。