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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310289934.7 (22)申请日 2013.07.10 CCTCC NO ： M 2013181 2013.05.07 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/26(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (73)专利权人 山东省食品发酵工业研究设计院 地址 250013 山东省济南市历下区解放路 41 号 (72)发明人 赵祥颖 刘建军 张家祥 杨丽萍 田延军 范宜晓 韩延雷 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 彭成 (54) 发明名称 一株产 3- 羟基丁。
2、酮的芽孢杆菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株高产 3- 羟基丁酮的 枯草芽孢杆菌， 命名为枯草芽孢杆菌 SFA-H43 （Bacillus subtilisSFA-H43） ， 该菌株已于 2013 年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏 编号为 CCTCC No ： M2013181。本发明还提供了一 种可以进一步提高SFA-H43菌株3-羟基丁酮产率 的发酵过程控制新工艺， 即菌株 SFA-H43 在发酵 3- 羟基丁酮过程中， 当发酵液中碳源耗尽后继续 培养 8 16 小时， SFA-H43 菌株 3- 羟基丁酮的产 率会再增加 15 20%。 (83)生物保藏信息 (。
3、51)Int.Cl. 审查员 杨晓飞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103333842 B (45)授权公告日 2015.03.04 CN 103333842 B 1/1 页 2 1. 一株产 3- 羟基丁酮的枯草芽孢杆菌， 其特征在于 ： 分类命名为枯草芽孢杆菌 SFA-H43(Bacillus subtilis SFA-H43)， 已于 2013 年 5 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏 中心， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2013181。 2.利用权利要求1所述的产3-羟基丁酮的枯草芽孢。
4、杆菌发酵生产3-羟基丁酮的过程 控制工艺， 其特征在于 ： 以葡萄糖为碳源培养菌株进行 3- 羟基丁酮发酵， 当发酵培养液中 碳源耗尽后， 继续发酵培养， 直至发酵液中 3- 羟基丁酮含量不再增加时结束发酵。 3. 根据权利要求 2 所述的发酵生产 3- 羟基丁酮的过程控制工艺， 其特征在于 ： 通过以 下两种方式之一或它们的组合实现 ： (1) 摇瓶发酵 ： 取 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面， 用接种环取 1 2 环斜面菌种到液体种子培养基中， 37培养 10 16 小时， 以 1 10接种量接种到发酵 培养基中， 180 220rpm、 35 40摇瓶发酵至碳。
5、源耗尽， 继续发酵培养至发酵液中 3- 羟 基丁酮含量不再增加， 结束发酵 ； (2)发酵罐发酵 ： 取3540培养23天菌株SFA-H43的新鲜斜面， 用接种环取1 2 环斜面菌种到液体种子培养基中， 37培养 10 16 小时， 再以 1 10的接种量接种到 发酵培养基中， 3540进行通风搅拌培养， 培养过程中控制pH在57， 保持发酵液中相 对溶氧浓度 5 20， 至碳源耗尽， 继续培养至 3- 羟基丁酮产率不再增加， 结束发酵。 4. 根据权利要求 3 所述的工艺， 其特征在于 ： 所述斜面培养所用的斜面菌种培养基的 组成为 ： 酵母膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 3。
6、g/L， 琼脂 20g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。 5. 根据权利要求 3 所述的工艺， 其特征在于 ： 所述液体种子培养基的组成为 ： 葡萄糖 60 100g/L， 酵母膏 2 10g/L， 玉米浆 8 12g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。 6.根据权利要求3所述的工艺， 其特征在于 ： 所述发酵培养基的组成为 ： 葡萄糖140 160g/L， 酵母浸提物 3 6g/L， 玉米浆 5 10g/L， (NH4)2HPO4 2 3g/L， MgSO4 2g/L， MnSO4 0.2g/L， 其余为水， pH 7.0 7.2。 7. 根据权利要求 3 所述的工艺， 其特征在于。
7、 ： 所述用液体种子培养基培养的时间为 12 16 小时。 8. 根据权利要求 3 所述的工艺， 其特征在于 ： 所述发酵罐发酵的相对溶解氧浓度控制 在 5 20。 9. 根据权利要求 3 所述的工艺， 其特征在于 ： 所述发酵罐发酵的 pH 控制在 5.0 7.0。 权 利 要 求 书 CN 103333842 B 2 1/8 页 3 一株产 3- 羟基丁酮的芽孢杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株产 3- 羟基丁酮的枯草芽孢杆菌， 及其在生产 3- 羟基丁酮中的应 用， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 3- 羟基丁酮 （acetoin） 又名乙偶姻、 乙酰甲基甲醇， 自。
8、然存在于玉米、 葡萄、 可可、 苹果、 香蕉、 干酪、 肉类等许多食品中， 具有特有的奶油香味。 0003 3-羟基丁酮是一种应用广泛、 令人喜爱的食用香料， 是国际上常用的香料品种。 主 要用作奶油、 乳品、 酸奶和草莓型等香料， 中国国家标准 GB2760-86 规定其为允许使用的食 品香料。80% 含量的 3- 羟基丁酮俗称 “醋嗡” ， 是酒类调香中一个重要的品种。3- 羟基丁酮 还是一种重要的化工合成原料和医药中间体。2004 年美国能源部将其列为 30 种优先开发 的平台化合物之一 （黄和等 CN101294143A） 。 0004 3- 羟基丁酮的生产主要是以丁二酮或 2,3- 。
9、丁二醇为原料通过化学法合成 （张晓 舟等， 江苏化工 ,2001,29(2):29-31.） 。化学合成方法生产 3- 羟基丁酮一般都是以丁二酮 或 2,3- 丁二醇为原料。丁二酮或 2,3- 丁二醇这两种化合物也是重要的合成香料， 非大宗 化学品， 要大规模生产 3- 羟基丁酮， 原料来源将会受到限制。同时化学合成方法制备 3- 羟 基丁酮， 反应过程相对复杂， 转化率较低， 产品纯度低， 过程污染较重， 因此， 人们将目光逐 步转向了生物转化生产 3- 羟基丁酮。 0005 生物转化法生产 3- 羟基丁酮具有原料来源丰富、 条件温和、 环境友好等优势， 能从根本上改变 3- 羟基丁酮生产过。
10、程中所面临的资源与环境压力。3- 羟基丁酮是多种 微生物糖代谢的中间产物 （Xiao Z， Xu P.Acetoin metabolism in Bacteria.Criti-cal Reviews in Microbiology， 2007， 33:127-140 ） ， 理论上讲以糖质为原料利用微生物发酵 可以生产 3- 羟基丁酮。早期关于微生物产生 3- 羟基丁酮的文献报道多数是关于 3- 羟 基丁酮代谢途径理论方面的研究 （Lopez et.al.Acetoin Degradation in Bacillus subtilis by Direct Oxidative Cleavage.。
11、Eur.J.Biochem.57,425-430(1975)） ， 微 生物在生长过程中会合成 3- 羟基丁酮， 但在后续生长过程中 3- 羟基丁酮又会被作为 碳源利用， 培养液中 3- 羟基丁酮浓度很低， 3- 羟基丁酮不会过量积累。另外， 3- 羟 基丁酮作为产物积累的研究一般是作为 2,3- 丁二酮和 2,3- 丁二醇发酵的副产物提 及 (Braneni et.al.Diacetyl and Acetoin Production by Lactobacillus casei. Applied Microbiology,1971,(10):517-521 ； Yu et.al.Fed-ba。
12、tch approach to production of2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae grown on high substrate concentration.Appl Environ Microbial,1983,V46:630-635)， 3- 羟基丁酮作为主要目 标产物的研究比较少见。但， 近年来随着化石资源的逐渐枯竭， 利用生物技术生产化学品 成为工业生物技术的研究热点， 有关 3- 羟基丁酮直接作为目标产物的文献报道也在逐 年增多 （李树波等， 微生物生产 3- 羟基丁酮研究进展， 生物加工过程， 2011， 9(6) ： 63-。
13、68 ） 。发明人注意到近年来文献报道的 3- 羟基丁酮产生菌株中， 芽孢杆菌属的菌株 3- 羟 说 明 书 CN 103333842 B 3 2/8 页 4 基丁酮发酵产率普遍较高 ( 许平等， 一株高产 3- 羟基丁酮的短小芽孢杆菌， 中国专利， CN100343385C， 2004 ； 赵祥颖等， 一株产高纯度 3- 羟基丁酮的枯草芽孢杆菌， 中国专利， CN101016530A， 2007 ； 许正宏等， 一株高产 3- 羟基丁酮地衣芽孢杆菌 MEL09 的筛选和应用， 中国专利， CN101899407A， 2010 ； 任潇等， 枯草芽孢杆菌发酵产 3- 羟基丁酮的条件优化， 食 。
14、品科技， 2010,35(8) ： 13-17 ； 范宜晓等， 产 3- 羟基丁酮菌株的筛选及产物分析， 食品发酵工 业， 2012,38(11):42-46)。芽孢杆菌属菌株与其他菌株相比 3- 羟基丁酮产率高、 副产物少， 同时芽孢杆菌属菌株还具有非致病菌、 易培养等特点， 是微生物发酵优先利用的微生物种 类之一 （Michael et.al.Bacillus introduction Encyclopediaof Food Microbiology， 1999:13-119 ） 。因此， 本发明将芽孢杆菌菌株作为生物转化生产 3- 羟基丁酮目的菌株筛 选的主要方向。 0006 要实现生物。
15、发酵 3- 羟基丁酮的高效生产， 除了要获取高产菌株外， 目标菌株发酵 培养基组成及发酵工艺的控制也非常关键， 通常通过培养基优化和工艺控制优化可以显著 提高目标菌株 3- 羟基丁酮的产率， 比如 ： 任潇等以葡萄糖为碳源， 采用枯草芽孢杆菌发酵 产生 3- 羟基丁酮， 通过培养基优化， 菌株 3- 羟基丁酮产率由原来的 30g/L 提高到 40.6g/ L， 生产强度由原来的 0.35g/L h 提高到 0.47g/L h（任潇等， 枯草芽孢杆菌发酵产 3- 羟基 丁酮的条件优化， 食品科技， 2010,35(8) ： 13-17） ； 范宜晓等， 利用响应面法优化 Bacillus sub。
16、tilis SF4-3 产 3- 羟基丁酮发酵培养基， 优化后菌株 3- 羟基丁酮的产率提高了 51% （食 品科技， 2013,38(3):18-21） 。 Liu et.al.通过培养基和发酵条件的优化， 菌株3-羟基丁酮 产率提高 84.86% （Liu et.al.Effi cient production of acetoin by the newly isolated Bacillus licheniformis strainMEL09 Process Biochemistry46(2011)390394） 。工 艺控制方面， Sun 等在 3.7L 发酵罐采用两段控制转速工艺， 。
17、改变发酵过程中氧的供给， 也达 到提高 3- 羟基丁酮产率的目的 （Sun et.al， Enhanced Acetoin Production by Serratia marcescens H32Using Statistical Optimization and a Two-stage Agitation Speed Control Strategy， Biotechnology and Bioprocess Engineering， 2012， 17:598-605） 。 0007 通过以上论述分析可知 ： 利用生物技术生产 3- 羟基丁酮是 3- 羟基丁酮规模化生 产未来的发展方向， 。
18、芽孢杆属菌株是 3- 羟基丁酮高产菌株主要的筛选目标之一， 发酵培养 基和发酵过程的优化控制有利于菌株 3- 羟基丁酮产量的提升。 发明内容 0008 针对利用微生物发酵产 3- 羟基丁酮的现有技术， 本发明提供了一株高产 3- 羟基 丁酮的枯草芽孢杆菌菌株 SFA-H43， 通过优化获得了菌株 SFA-H43 高产 3- 羟基丁酮的发酵 培养基组成和培养条件参数， 并提供了一种利用该菌株进一步提高 3- 羟基丁酮产率的发 酵进程控制新工艺。 0009 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0010 一株产 3- 羟基丁酮的枯草芽孢杆菌， 是从白酒大曲砖中分离筛选到的， 通过菌株 形态观察、 生。
19、理生化实验和 16srDNA 序列测定鉴定为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 命名为枯草芽孢杆菌 SFA-H43（Bacillus subtilis SFA-H43） ， 该菌株已于 2013 年 5 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC No ： M2013181。 0011 所述菌株 SFA-H43 在 LB 培养基平板上 37培养生长迅速， 培养 12 小时即可观察 说 明 书 CN 103333842 B 4 3/8 页 5 到明显的菌落， 培养24h菌落直径约0.2-0.4cm， 菌落基本呈圆形， 边缘不整齐。 菌落为乳白 色， 表。
20、面干燥无光泽， 不透明， 与枯草芽孢杆菌标准菌株类似 ； 在 LB 液体培养基中， 37摇 床培养 12-16 小时， 细胞呈直杆状， 呈单个或短链存在， 革兰氏染色阳性， 继续培养至 20-24 小时， 开始生芽孢， 芽孢中生或偏端生， 椭圆形， 不膨大 ； LB 半固体培养基穿刺培养， 37培 养 24 小时， 可观察到菌体沿着穿刺线成发散雾状生长， 说明菌体可以运动。生理生化实验 表明菌株 SFA-H43 可以利用葡萄糖、 果糖、 甘露糖、 麦芽糖、 蔗糖、 阿拉伯糖、 木糖产酸， 发酵 葡萄糖不产气， 利用柠檬酸盐， 接触酶阳性， 还原硝酸盐 ； 可以水解酪蛋白、 淀粉和明胶， 特 征。
21、与文献记载的枯草芽孢杆菌特征相符。菌株 SFA-H43 16S rDNA 序列通过 NCBI 的 BLAST 程序在 GenBank 数据库中进行对比， 发现菌株 SFA-H43 的 16S rDNA 序列与 GenBank 数据 库中的多株枯草芽孢杆菌的 16S rDNA 序列相似性达到 99-100%。综合上述培养特征、 生 理生化实验特征以及 16S rDNA 序列特征， 鉴定菌株 SFA-H43 为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 。菌株 SFA-H43 16S rDNA 序列已提交 GenBank 的保存， 序列号为 KF318713。 0012 所述菌株 SFA。
22、-H43 通过对其培养基组分 （碳源、 氮源、 无机盐等） 和培养条件 （培养 温度、 pH、 溶解氧等） 的优化后， 其 3- 羟基丁酮产率可达 50g/L 以上， 具有工业开发价值。同 时本发明还提供了一种可以进一步提高菌株 SFA-H43 3- 羟基丁酮产率的发酵进程控制新 工艺， 即菌株 SFA-H43 在发酵 3- 羟基丁酮过程中， 当培养液中的碳源耗尽后， 继续培养 8 16 小时， 其 3- 羟基丁酮的产率会再增加 15 20%。 0013 一种利用菌株 SFA-H43（CCTCC No.2013181） 发酵生产 3- 羟基丁酮的发酵控制新 工艺， 为以下两种方式之一或它们的组。
23、合 ： 0014 （1） 摇瓶发酵 ： 取 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面， 用接种环取 1 2 环斜面菌种， 接种到 50ml 液体种子培养基中， 37培养 10 16 小时， 以 1 10% （体 积百分数） 的接种量接种到摇瓶中， 35 40、 180 220rpm， 发酵至碳源耗尽， 继续培养 12 20 小时至发酵液中 3- 羟基丁酮含量不再增加， 结束发酵。结果显示 ： 碳源耗尽时， 取样测定发酵液中 3- 羟基丁酮含量为 38 45g/L， 继续培养至发酵液中 3- 羟基丁酮含量 不再增加时， 发酵液中 3- 羟基丁酮的含量可达 45 52g/L。可见。
24、， 当发酵液中的碳源耗尽 以后， 继续培养一段时间， 发酵液中 3- 羟基丁酮的含量会增加约 15 20%。附图 2 为菌株 SFA-H43 摇瓶发酵发酵进程曲线。 0015 （2） 发酵罐发酵 ： 在无菌操作的条件下用接种环取 1 2 环 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面菌种， 接种到液体种子培养基中， 37培养 10 16 小时， 再以 1 10%（体积百分数） 的接种量接种到发酵罐中 （65 75% 的装液量） ， 35 40进行通 风搅拌培养， 培养过程中控制 pH 在 5 7， 通过调节搅拌转速和通风比， 保持发酵液中相对 溶解氧浓度 5 20%， 发酵培养。
25、至碳源耗尽， 再继续培养 12 20 小时， 至发酵液中 3- 羟基 丁酮含量不再增加， 结束发酵。结果显示 ： 碳源耗尽时， 取样测定 3- 羟基丁酮含量为 45 52g/L继续培养至发酵液中3-羟基丁酮含量不再增加， 取样测定发酵液中3-羟基丁酮的含 量为5562g/L。 可见， 当发酵液中的碳源耗尽后， 继续培养一段时间， 发酵液中3-羟基丁 酮的含量会增加约 15 20%。图 3 为菌株 SFA-H43 10L 发酵罐发酵发酵进程曲线。 0016 进一步地， 所述斜面培养所用的斜面菌种培养基的组成为 ： 酵母浸提物 5g/L， 蛋 白胨 10g/L， NaCl3g/L， 琼脂 20g/。
26、L， 其余为水， pH7.0 7.2。 0017 进一步地， 所述液体种子培养基的组成为 ： 葡萄糖 60 100g/L， 酵母浸提物 2 说 明 书 CN 103333842 B 5 4/8 页 6 10g/L， 玉米浆 8 12g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。 0018 进一步地， 所述发酵培养基组成为 ： 葡萄糖 140 160g/L， 酵母浸提物 3 6g/L， 玉米浆 5 10g/L， (NH4)2HPO42 3g/L， MgSO42g/L， MnSO40.2g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。 0019 优选的， 所述用液体种子培养基培养的时间为 12 14 小时。。
27、 0020 优选的， 所述摇瓶发酵或发酵罐发酵的培养温度为 36 38。 0021 优选的， 所述发酵罐发酵的 pH 控制在 5.5 6.5。 0022 优选的， 所述发酵罐发酵的溶解氧浓度保持在 10 15%。 0023 本发明提供的产 3- 羟基丁酮芽孢杆菌菌株， 是通过以下方法筛选到的 ： 0024 按常规菌种分离筛选方法， 从市场或生产现场获取白酒大曲样品、 豆瓣酱和纳豆 等发酵食品样品、 以及富含芽孢杆菌的腐殖质土壤样品等， 在无菌操作的条件下， 取上述各 种样品2g， 放入装有30mL无菌水的250mL三角瓶中， 震荡后静置30min， 沸水浴煮沸5min过 滤， 取滤液 1mL 。
28、接种到装有 30mL 富集培养基的 250mL 三角瓶中于 35 40、 180 220rpm 摇床培养 24h， 再将富集液适当稀释涂布到分离平板培养基上， 35 40恒温培养 24 48h， 待长出单菌落后， 挑取类似芽孢杆菌的菌落 （菌落生长速度快、 无光泽或亚光、 易扩散、 边缘不整齐等） 移接斜面， 35 40恒温培养 2 3 天。斜面菌种培养成熟后， 通过涂片、 染色、 显微镜观察， 挑选芽孢杆菌菌株进行下一步筛选。将挑取的芽孢杆菌菌株， 通过一支 接一支的方式接种试管培养基 （150*15 的试管， 装 5ml 培养基） ， 35 40振动培养 2 3 天。取 100*10 的试。
29、管， 分别加入菌株培养液 10ul， 加水 1ml， 加 100ul5% 的甲萘酚 ( 用 10% 的氢氧化钠溶液配制 )， 加 400ul0.1% 的肌酸水溶液， 混合均匀， 37保温显色 5min， 挑选 显色或显色颜色较深的对应菌株作为下一步筛选的目的菌株。通过初筛获得的菌株再通 过一支接三瓶的方式接种摇瓶 （250ml 三角瓶， 装 30ml 培养基） ， 180 220rpm， 35 40 振荡培养 2 3 天。培养液 4000 5000rpm 离心 5 10min， 取上清液适当稀释， 采用比 色法测定 3- 羟基丁酮含量。通过上述筛选过程， 本发明从中国传统白酒大曲砖样品中筛 选。
30、到一株 3- 羟基丁酮高产菌株， 编号为 SFA-H43， 经培养基和培养条件优化后， 以葡萄糖 为碳源摇瓶发酵 72 小时， 菌株 SFA-H433- 羟基丁酮产率达 40-45g/L。气相色谱分析表明 菌株 SFA-H43 发酵液主要产物为 3- 羟基丁酮， 含有少量的 2,3- 丁二醇副产物 （图 1） 。通 过菌株形态观察、 生理生化实验和 16S rDNA 序列测定， 菌株 SFA-H43 鉴定为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 该菌株已于 2013 年 5 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏 编号为 CCTCC No ： M2013181。 00。
31、25 上述所涉及的富集培养基的组成为 ： 葡萄糖 20g/L， 酵母浸提物 5g/L， 蛋白胨 10g/ L， 氯化钠 3g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。 0026 上述所涉及的平板分离培养基的组成为 ： 酵母浸提物 5g/L， 蛋白胨 10g/L， 氯化钠 3g/L， 琼脂 20g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。 0027 进一步地， 所述菌种筛选用发酵培养基组成为 ： 葡萄糖 120g/L， 酵母浸提物 5g/L， (NH4)2SO42g/L， MgSO42g/L， MnSO40.2g/L， K2HPO41g/L， KH2PO42g/L， 其余为水， pH7.0 7.2。。
32、 0028 本发明对菌株 SFA-H43 发酵液中 3- 羟基丁酮的定性检测方法为 ： 0029 发酵液经 4000 5000rpm 离心去菌体 ； 去除菌体后的发酵清液， 加入 0.1 0.3% 活性炭脱色， 脱色清液经阴阳离子交换树脂除离子， 收集离交液采用气相色谱分析， 与标准 3- 羟基丁酮样品比较。气相色谱 (GC) 条件 ： 色谱柱 ： PEG-20M 石英交联毛细管柱 ； 载气 ： 高 说 明 书 CN 103333842 B 6 5/8 页 7 纯氮气 ； 载气流速 ： 0.9mL/min ； 柱头压 ： 0.1Mpa ； 色谱柱控温程序 ： 70保持 3min， 3.5 / 。
33、min 升温至 100， 保持 1min， 从 100以 5 /min 升温速度升温至 220， 保持 20min。进 样口温度 ： 220 ； 进样量 ： 1L ； 检测器类型 ： 氢火焰离子化检测器 （FID） ； 检测器温度 ： 220。 0030 本发明 3- 羟基丁酮的定量检测方法为比色法 ： 0031 3- 羟基丁酮在碱性条件下氧化为 2,3- 丁二酮， 2,3- 丁二酮与带有胍基的肌酸反 应可产生粉红色复合物， 加入甲萘酚可加速此反应， 该复合物在波长 530nm 处有最大吸收 峰， 在吸光值在 0.3 0.9 范围内与 3- 羟基丁酮的浓度呈线性关系。发酵结束后， 收集发 酵液。
34、， 4500r/min 离心 10min， 上清液稀释至 3- 羟基丁酮含量至 1 20g/mL 左右， 取稀释 样品 4ml， 加入 5% 的甲萘酚 ( 用 10% 的氢氧化钠溶液配制） 1ml， 再加入 0.1% 的肌酸水溶液 1ml， 充分振荡混匀， 60显色 15min， 530nm 处测定吸光度， 同时绘制 3- 羟基丁酮的标准曲 线， 根据标准曲线计算 3- 羟基丁酮产量。 0032 本发明对葡萄糖进行检测的方法为 ： 0033 采用 SBA-40D 生物传感分析仪测定葡萄糖含量， 测定原理是固定化葡萄糖氧化酶 膜催化氧化葡萄糖生成过氧化氢， 通过电极的检测电信号， 通过电流法检测。
35、出葡萄糖浓度。 发酵结束后， 收集发酵液， 4500r/min 离心 10min， 上清液稀释至葡萄糖含量约为 1g/L， 进行 测定， 用 1g/L 标准葡萄糖溶液做参比。 0034 本发明的提供的产 3- 羟基丁酮的枯草芽孢杆菌菌株 SFA-H43， 3- 羟基丁酮产量 高， 发酵工艺控制简单， 具有工业开发价值。本发明提供的 3- 羟基丁酮的发酵控制工艺， 可 使 3- 羟基丁酮的发酵终产率再提高 15 20%， 效果突出， 应用价值巨大。 附图说明 0035 本发明提供的产 3- 羟基丁酮的芽孢杆菌 SFA-H43， 分类命名为枯草 （Bacillus subtilis） ， 已于 2。
36、013 年 5 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC No ： M2013181， 保藏地址为 ： 中国湖北省武汉市武汉大学， 邮编 ： 430072。 0036 图1 ： 菌株SFA-H43发酵液气相色谱图， 主峰为3-羟基丁酮， 两个次峰是为2,3-丁 二醇的两种异构体。 （2,3- 丁二醇标样在同一位置也出现两个峰， 参见文献 ： 林清等， 一株 以葡萄糖为底物产 2,3- 丁二醇微生物， 微生物学通报， 2010,37(11):1581-1587） 0037 图 2 ： 菌株 SFA-H43 摇瓶发酵进程。 0038 图 3 ： 菌株 SFA-H43 10L。
37、 发酵罐发酵进程。 具体实施方式 0039 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 0040 实施例 1 菌种筛选 0041 按常规菌种分离筛选方法， 取白酒大曲曲砖样品粉碎， 称取 2g 样品， 放入装有 30mL 无菌水的 250mL 三角瓶中， 震荡 30min， 煮沸 5min， 过滤， 取滤液 1mL 接种到装有 30mL 富集培养基的250mL三角瓶中于37、 180rpm摇床培养24h， 再将富集液稀释涂布到平板培 养基， 37恒温培养 24 48h， 待长出单菌落后， 挑取似芽孢杆菌的菌落移接斜面， 37恒 温培养 2 3 天。斜面菌种培养成熟后， 通过涂片、 单染色、 显微镜。
38、观察， 共得到芽孢杆菌菌 说 明 书 CN 103333842 B 7 6/8 页 8 株 109 株。将挑选的菌株斜面， 通过一支接一支的方式接种试管 （150*15 的试管， 装 5ml 菌 株筛选发酵培养基） ， 37振动培养23天。 取100*10的试管， 分别加入菌株培养液10ul， 加水 1ml， 加 100ul5% 的甲萘酚 ( 用 10% 的氢氧化钠溶液配制 )， 加 400ul0.1% 的肌酸水溶 液， 混合均匀， 37保温显色5min， 共挑选显色颜色较深的菌株12株。 将这12株菌株， 再通 过一支接三支的方式接种摇瓶 （250ml 三角瓶， 装 30ml 菌株筛选发酵培。
39、养基） ， 180rpm， 37 摇瓶培养 72 小时。培养液经 4000rpm 离心 5min， 上清液适当稀释后用比色法测定 3- 羟基 丁酮含量， 获得到一株3-羟基丁酮产率达35.6g/L的菌株， 统一编号为SFA-H43。 该菌株通 过菌株形态观察、 生理生化实验和 16srDNA 序列测定， 鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌， 该菌株 已于 2013 年 5 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC No ： M2013181。 0042 实施例 2 产物定性鉴定 0043 取 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面， 用接种环取 1 2 环斜 。
40、面菌种， 接种到液体种子培养基中， 37培养 14 小时， 5% 的接种量接种发酵培养基， 37 摇瓶发酵培养 72 小时， 发酵液经 4500rpm 离心 10min， 取上清液， 加 0.1% 活性炭， 60保 温脱色 30min， 过滤去除活性炭， 取清液过依次通过阳阴离子交换树脂柱 （阳离子交换柱 ： 30mm*500mm， 装 731 阳离子交换树脂并按要求处理合格 ； 阴离子交换柱 ： 30mm*500mm， 装 D315 阴离子交换树脂并按要求处理合格） ， 收集合格离交液， 进行气相色谱分析， 结果显示 菌株SFA-H43发酵液中的主体成分的出峰时间与标准3-羟基丁酮出峰时间一。
41、致， 进一步确 认菌株 SFA-H43 主体产物为 3- 羟基丁酮， 同时通过 2,3- 丁二酮和 2,3- 丁二醇标准样的出 峰时间比对， 确认菌株 SFA-H43 发酵液中含有少量 2,3- 丁二醇， 没有检测到 2,3- 丁二酮成 分。 0044 实施例 3 发酵培养基优化 0045 本发明对菌株SFA-H43发酵3-羟基丁酮培养基碳源、 氮源等发酵培养基组成进行 了优选。 0046 碳源优选 ： 取 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面， 用接种环取 1 2 环斜面菌种， 接种到 50ml 液体种子培养基中， 37培养 12 小时， 5% 的接种量接种含不同 碳源。
42、的摇瓶发酵培养基 （碳源分别为葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖、 木糖、 糖蜜、 葡萄糖母液、 果糖， 浓度均为 120g/L， 其他组分相同） ， 37摇瓶发酵培养 72 小时， 取发酵液经 4500rpm 离心 15min， 上清液适当稀释用化学显色的方法测定 3- 羟基丁酮的含量， 结果显示菌株 SFA-H43 利用葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖、 木糖、 糖蜜、 葡萄糖母液、 果糖均可生产 3- 羟基丁酮， 其中利用 葡萄糖 3- 羟基丁酮产率最高 （30 35g/L） ， 利用麦芽糖、 蔗糖、 木糖、 糖蜜、 葡萄糖母液、 果 糖等， 3-羟基丁酮的产率在1525g/L不等， 因此菌株SFA-H4。
43、3发酵生产3-羟基丁酮碳源 优选为葡萄糖。葡萄糖浓度在 120 160g/L 的范围内， 随着葡萄糖浓度升高， 菌株 3- 羟基 丁酮产率也相应增加。 0047 氮源优选 ： 取 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面， 用接种环取 1 2环斜面菌种， 接种到液体种子培养基中， 37培养12小时， 5%的接种量接种含不同氮源的 摇瓶发酵培养基 （氮源分别为蛋白胨、 酵母浸提物、 玉米浆、 脲、 硝酸铵、 硫酸铵、 氯化铵， 浓 度均为 10g/L， 碳源为葡萄糖， 其他组分相同） ， 37摇瓶发酵培养 72 小时， 取不同氮源的发 酵液经4500rpm离心15min， 上清。
44、液适当稀释用显色法测定3-羟基丁酮的含量， 结果显示菌 株 SFA-H43 单独利用蛋白胨、 酵母浸提物、 玉米浆、 脲、 磷酸氢二铵、 硝酸铵、 硫酸铵、 氯化铵 说 明 书 CN 103333842 B 8 7/8 页 9 为氮源均可生产3-羟基丁酮， 其中单独利用酵母浸提物为氮源3-羟基丁酮产量最高， 其次 为磷酸氢二铵和玉米浆。 考虑到酵母浸出物价格比较高， 本发明又对酵母浸提物、 磷酸氢二 铵和玉米浆复合氮源的各成分浓度进行优选， 结果为当酵母浸提物添加量为 3 6g/L， 玉 米浆添加量为 5 10g/L， 磷酸氢二铵添加量为 2 3g/L 时， 菌株 SFA-H43 发酵 3- 。
45、羟基丁 酮产率比单独使用 10g/L 酵母浸出物提高 50 70%。 0048 实施例 4 3- 羟基丁酮发酵进程 0049 摇瓶培养 0050 取 35 40培养 2 3 天菌株 SFA-H43 的新鲜斜面， 用接种环取 1 2 环斜面 菌种， 接种到液体种子培养基中， 37培养 14 小时， 5% 的接种量接种摇瓶发酵培养基 （葡萄 糖 140g/l） ， 36摇瓶发酵， 每间隔 12 小时取样， 培养周期至 60 小时取样， 离心上清液已经 检测不到葡萄糖， 此时发酵液3-羟基丁酮含量为42.5g/L， 继续培养16小时， 每隔4小时取 样， 离心测定上清液中3-羟基丁酮含量。 培养周期。
46、至80小时取样3-羟基丁酮含量较76小 时取样不再增加， 此时 3- 羟基丁酮含量为 50g/L。结果表明， 当发酵液中葡萄糖耗尽以后， 继续发酵培养 16 小时， 发酵液中 3- 羟基丁酮的产量提高了 17.6%。 0051 图 2 为菌株 SFA-H43 摇瓶发酵发酵进程曲线。 0052 实施例 5 3- 羟基丁酮发酵进程 0053 发酵罐培养 0054 用37培养23天菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种， 接种液体种子培养基， 37培 养 16 小时， 再以 3% 的接种量接种到 10L 发酵罐发酵培养基中 （装液量 7.0L， 葡萄糖 160g/ L） ， 35 37进行通风搅拌培养， 。
47、培养过程中控制 pH 在 5 7， 相对溶氧浓度 5 20%， 每 间隔一定时间取样。培养周期至 56 小时取样， 离心上清液已经检测不到葡萄糖， 此时 3- 羟 基丁酮含量为 51.8g/L。继续培养， 培养周期至 76 小时取样的 3- 羟基丁酮含量较 72 小时 取样没有明显增加， 此时3-羟基丁酮含量为61.5g/L。 葡萄糖耗尽以后继续发酵培养16小 时， 发酵液中 3- 羟基丁酮的产量提高了 18.7%。 0055 图 3 为菌株 SFA-H43 10L 发酵罐发酵发酵进程曲线。 0056 实施例 6 pH 影响 0057 用37培养3天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种， 接种液。
48、体种子培养基， 37培养 16 小时， 再以 5% 的接种量接种到 10L 发酵罐发酵培养基中 （装液量 6.5L， 葡萄糖 160g/L） ， 35 37进行通风搅拌培养， 培养过程中控制 pH5.5， 控制发酵液中相对溶氧浓度 10%， 60 小时葡萄糖耗尽， 继续培养 12 小时， 3- 羟基丁酮产率为 59.7g/L。 0058 实施例 7 pH 影响 0059 用37培养2天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种， 接种液体种子培养基， 37培养 12 小时， 再以 5% 的接种量接种到 10L 发酵罐发酵培养基中 （装液量 7.0L， 葡萄糖 160g/L） ， 35 37进行通风搅拌。
49、培养， 培养过程中控制 pH7.0， 控制发酵液中相对溶氧浓度 15%， 48 小时葡萄糖耗尽， 继续培养 14 小时， 取样测定 3- 羟基丁酮含量为 55.3g/L。 0060 实施例 8 溶解氧浓度影响 0061 用 37培养 2 天的菌株 SFA-H43 的新鲜斜面菌种， 接种液体种子培养基， 37培 养 14 小时， 再以 6% 的接种量接种到 10L 发酵罐发酵培养基中 （装液量 7.0L， 葡萄糖 160g/ L） ， 35 37进行通风搅拌培养， 培养过程中 pH 控制 5 7， 通过调节搅拌转速和通风比， 说 明 书 CN 103333842 B 9 8/8 页 10 控制发酵液中相对溶氧浓度 10 15%， 发酵培养 56 小时葡萄糖耗尽， 继续培养 16 小时， 取 样测定 3- 羟基丁酮含量为 62.3g/L。 0062 实施例 9 溶解氧浓度影响 0063 用37培养2天的菌株SFA-H43的新鲜斜面菌种， 接。