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1、(10)申请公布号 CN 103570545 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103570545 A (21)申请号 201310424422.7 (22)申请日 2013.09.17 C07C 69/732(2006.01) C07C 67/48(2006.01) (71)申请人 南京师范大学 地址 210097 江苏省南京市鼓楼区宁海路 122 号 (72)发明人 陈育如 钱媛媛 柯小红 闫莽 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 一种从野艾蒿中制备咖啡酰奎尼酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了野艾蒿作为制备咖啡酰奎。
2、尼酸 类物质原料的应用及从野艾蒿中制备咖啡酰奎尼 酸的方法。 该方法是将野艾蒿的叶或全草研磨后， 经提取剂浸提， 固液分离后得到含咖啡酰奎尼酸 的提取液， 再经纯化得到高纯度的咖啡酰奎尼酸 类产品。本发明得到总咖啡酰奎尼酸类物质量达 5.8%， 其中单咖啡酰奎尼酸 （主要是 5-O- 咖啡酰 奎尼酸） 含量为 2.1%， 二咖啡酰奎尼酸含量 3.7%， 其中主要是1,5-二咖啡酰奎尼酸、 3,5-二咖啡酰 奎尼酸、 4,5- 二咖啡酰奎尼酸。本发明提供了制 备咖啡酰奎尼酸类物质的新原料来源， 为野艾蒿 的利用提供了新途径。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 。
3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103570545 A CN 103570545 A 1/1 页 2 1. 野艾蒿作为制备咖啡酰奎尼酸类物质原料的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述野艾蒿是菊科蒿属多年生植物野艾 蒿 （Artemisia lavandulaefolia DC.） 的叶或全草。 3. 一种制备咖啡酰奎尼酸的方法， 其特征在于将野艾蒿的叶或全草研磨后， 经提取剂 浸提， 固液分离后得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 再经纯化得到高纯度的咖啡酰奎尼酸类 产品。 4.。
4、 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于所述提取剂为水、 甲醇、 乙醇、 丙酮、 正丁醇、 正戊醇、 乙酸乙酯或乙酸丁酯中的一种或多种不同比例的混合液。 5. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于所述提取剂的 pH 为 1.0 10.0， 原料与提取 剂的料液比为 1:10 1:50（w/w） ， 提取时间 0.1 10h。 6. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于所述的提取方式可以是水浴提取、 超声辅助 提取、 微波辅助提取、 超高压技术提取或超临界流体萃取中的一种或多种方法的组合。 7.根据权利要求3所述方法， 其特征在于提取液中的单咖啡酰奎尼酸类物质为3-O-咖 啡酰奎尼酸、。
5、 4-O- 咖啡酰奎尼酸、 5-O- 咖啡酰奎尼酸中的一种或多种成分。二咖啡酰奎尼 酸类物质为 3,4- 二咖啡酰奎尼酸、 3,5- 二咖啡酰奎尼酸、 4,5- 二咖啡酰奎尼酸、 1,3- 二咖 啡酰奎尼酸、 1,4- 二咖啡酰奎尼酸、 1,5- 二咖啡酰奎尼酸中的一种或多种成分。 8. 根据权利要求 3 所述方法， 其特征在于纯化所用材料是大孔树脂、 聚酰胺、 Sephadex LH20、 制备性液相色谱、 高效逆流色谱或离子交换色谱的一种或多种。 权 利 要 求 书 CN 103570545 A 2 1/5 页 3 一种从野艾蒿中制备咖啡酰奎尼酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从。
6、植物中提取有效成分的方法， 具体涉及一种从野艾蒿中制备咖 啡酰奎尼酸类物质的方法。 背景技术 0002 咖啡酰奎尼酸类物质是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸通过酯化反应缩合形 成的酚酸类天然化合物， 包括单咖啡酰奎尼酸、 二咖啡酰奎尼酸、 三咖啡酰奎尼酸以及多咖 啡酰奎尼酸。 0003 单咖啡酰奎尼酸由一分子的咖啡酸和奎尼酸生成 （包括 3- 咖啡酰奎尼酸， 4- 咖啡 酰奎尼酸， 5- 咖啡酰奎尼酸） ， 具有广泛的生物活性， 如抗菌、 抗病毒、 保肝利胆、 降血压、 降 血脂、 清除自由基、 抗肿瘤等作用 （黄林 , 唐菊利 , 黄静 , 等 . 绿原酸提取与应用研究进展 J. 高效实验室工。
7、作研究 ,2012,3:114 117） 。二咖啡酰奎尼酸是由二分子咖啡酸和奎 尼酸生成的缩酚酸， 根据咖啡酸取代位置的不同， 分别为 1,3- 二咖啡酰奎尼酸、 1,4- 二咖 啡酰奎尼酸、 1,5-二咖啡酰奎尼酸、 3,4-二咖啡酰奎尼酸、 3,5-二咖啡酰奎尼酸、 4,5-二咖 啡酰奎尼酸。 0004 咖 啡 酰 奎 尼 酸 在 保 健 品、 药 物 等 领 域 的 应 用 非 常 广 泛 （CN100353938C ； CN100341500C） ， 特别是二咖啡酰奎尼酸应用更引人注目 （魏振满 , 丁晋彪 , 胡琳 , 等 . 二 咖啡酰奎尼酸片健康人体安全性及耐受性研究 J. 中国。
8、新药杂志 ,2010,19(2):106 108） 。Kimura 等发现 3,5- 二咖啡酰奎尼酸、 4,5- 二咖啡酰奎尼酸以及 3,4- 二咖啡酰 奎尼酸抑制人外周多形核白细胞中钙离子 A23187 诱导的白三烯 B4产生， 并且 3,4- 二咖 啡酰奎尼酸能促进前列腺素 E2 的形成 （Kimura Y,Okuda H,Okuda T,et al.Studies on the activities of tannins and related compounds,X:Effects of caffeetannins and related compounds on arachidona。
9、te met abolism in human polymorphonuclear leukocytesJ.Nat Prod,1987,50(3):392） 。Soh 等发现 4,5- 二咖啡酰奎尼酸预处理 C6 细胞后， 可消弱 THP 引起的谷胱甘肽过氧化酶 （GSH-Px)、 过氧化氢酶和 SOD 的改变， 并且减 少丙二醛的释放 （Soh Y,Kim J A,Sohn N W,et al.Protective effects of quinic acid derivatives on tetrahydropapaveroline-induced cell death in C6glio。
10、ma cellsJ. Biol Pharm Bull,2003,26(6):803 806)。 0005 野艾蒿 （Artemisia lavandulaefolia D C.） 和艾蒿 (Artemisia argyi Levl.et Vant)均为菊科蒿属草本植物， 具有芳香气味， 生长于路旁、 草地、 荒野等处， 也有栽培者。 我 国大部分地区， 如江苏、 安徽、 浙江、 河南等地多有出产。 0006 蒿属植物常见的成分有挥发油、 黄酮类、 三萜类等， 如桉油素、 - 石竹烯、 - 萜 品烯醇等， 具有抗菌、 消炎、 抗氧化、 抗过敏等多种生物活性 （王锦军 , 黄兆文 , 李瑶瑶 . 。
11、艾 叶化学成分的研究 J. 药学服务与研究， 2008,8(6):465 466） 。有文献报道艾蒿叶中 的 3,5- 二咖啡酰奎尼酸及其衍生物可以有效抑制梨形鞭毛虫的亮氨酰 tRNA 合成酶的氨 酰化活性， 3,5-diCQA 是在艾蒿叶的乙醇提取物中检测得到， 但含量非常低， 不足 0.01% 说 明 书 CN 103570545 A 3 2/5 页 4 （Yan-Hong Zhang,Mei-Qin Xue,Yuan-Chao Bai,et al.3,5-dicaffeoylquinic acid isolated from Artemisia argyi and its ester d。
12、erivatives exert anti-leucyl-tRNA synthetase of Giardia lamblia(G/LeuRS)and potential anti-giardial effectsJ. Fitoterapia,2012,83:1281 1285） 。 0007 刘益红等测定了不同月份艾蒿(A.argyi Levl.et Vant)中的绿原酸含量， 发现艾 蒿 （采自陕西） 其绿原酸含量最高为 1.18%， 但未对二咖啡酰奎尼酸含量进行测定 （刘益红 , 周建军 , 王晶 .HPLC 测定不同月份艾叶中绿原酸含量 J. 陕西农业科学 ,2012， (1):82 。
13、84） 。与传统的绿原酸工业化生产原料金银花 （绿原酸含量 2.40 9.23%） （向增旭 , 郭巧 生 . 不同产地金银花的绿原酸含量比较 J. 中药材 ,2007,30(12):1497 1499） 和杜仲 叶 （绿原酸含量 1.0 5.5%） （兰小艳 , 张学俊 , 龚桂珍 . 杜仲叶绿原酸的研究进展 J. 中国农学通报 ,2009,25(21):86 89） 相比， 艾蒿的工业应用价值较小。 0008 野艾蒿 (A.lavandulaefolia DC) 与艾蒿 (A.argyi Levl.et Vant) 是不同种 （同 属） 的植物， 在江苏地区野艾蒿的资源量比艾蒿多， 而关于。
14、野艾蒿中的咖啡酰奎尼酸的含量 鲜有报道。 因此， 本发明对其进行了详细的研究， 实验结果发现野艾蒿中总咖啡酰奎尼酸含 量很高 （5.8%） ， 其中仅二咖啡酰奎尼酸含量达 3.7%， 单咖啡酰奎尼酸量达 2.1%， 高于艾蒿 中的单咖啡酰奎尼酸含量 （1.18%） ， 因而野艾蒿中的高咖啡酰奎尼酸特别是高的二咖啡酰 奎尼酸含量使其成为极具潜力的咖啡酰奎尼酸产品生产新原料来源。 0009 目前传统的咖啡酰奎尼酸类物质生产原料 （杜仲、 金银花等） 或因是国家保护植物 （杜仲） 或因生物量小 （仅为金银花植物的花） 的原因而导致资源量不高， 而野艾蒿在我们国 家分布广， 生物量大 （全草） ， 其。
15、中的咖啡酰奎尼酸类物质含量丰富， 因而原料成本和生产成 本与传统原料相比有很大的优势， 应用前景广阔。 发明内容 0010 本发明公开了一种野艾蒿的新用途， 并提供了一种制备咖啡酰奎尼酸的新方法， 为综合利用野艾蒿提供了新途径。 0011 野艾蒿作为制备咖啡酰奎尼酸类物质的原料的应用。 所述野艾蒿是菊科蒿属多年 生植物野艾蒿 （Artemisia lavandulaefolia DC.） 的叶或全草。 0012 本发明还公开了一种制备咖啡酰奎尼酸的方法， 是将将野艾蒿的叶或全草经提取 剂浸提， 固液分离后得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 再经纯化得到高纯度的咖啡酰奎尼酸。 所用提取剂为水、 甲醇、。
16、 乙醇、 丙酮、 正丁醇、 正戊醇、 乙酸乙酯、 乙酸丁酯的一种或多种不同 比例的混合液。提取剂的 pH 为 1.0 10.0， 原料与提取剂的料液比为 1:10 1:50 （w/w） ， 提取时间0.510h。 所用的提取方式是水浴提取法、 超声辅助提取法、 微波辅助提取法、 超 高压技术提取法、 超临界流体萃取法的一种或多种形式的组合。 0013 经浸提获得的提取液中单咖啡酰奎尼酸类物质为 3-O- 咖啡酰奎尼酸、 4-O- 咖啡 酰奎尼酸、 5-O-咖啡酰奎尼酸中的一种或多种成分。 二咖啡酰奎尼酸类物质为3,4-二咖啡 酰奎尼酸、 3,5-二咖啡酰奎尼酸、 4,5-二咖啡酰奎尼酸、 1,。
17、3-二咖啡酰奎尼酸、 1,4-二咖啡 酰奎尼酸、 1,5- 二咖啡酰奎尼酸中的一种或多种成分。 0014 纯化所用材料是大孔树脂、 聚酰胺、 Sephadex LH20、 制备性液相色谱、 高效逆流色 谱或离子交换色谱的一种或多种。 说 明 书 CN 103570545 A 4 3/5 页 5 0015 野艾蒿作为制备咖啡酰奎尼酸原料的优点在于 ： 0016 1. 野艾蒿中咖啡酰奎尼酸类物质含量高 （5.8%） 。 0017 2. 野艾蒿中咖啡酰奎尼酸类物质种类多， 特别是 1,5- 二咖啡酰奎尼酸 （艾蒿中未 检测到） ， 占总咖啡酰奎尼酸量的 21% ； 与目前已在临床试验的抗艾滋病毒和保。
18、肝应用的药 物 （化学合成） 比较， 从野艾蒿和旋覆花等天然来源的 1,5- 二咖啡酰奎尼酸有着明显的优 势。 0018 3. 野艾蒿资源丰富， 因而在原料成本与分离成本方面都有着极大的优势。 附图说明 0019 图 1 野艾蒿浸提液 HPLC 图。 0020 图 2 单咖啡酰奎尼酸 HPLC 图。 0021 图 3 二咖啡酰奎尼酸 HPLC 图。 具体实施方式 0022 下面将结合具体实施方式进一步说明本发明， 举例是为说明本发明的过程而非仅 限于实施例。 0023 实施例 1 0024 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:10 （w/w） 加入 pH=3.0 体积浓度 60% 的乙醇溶液。
19、， 超 声作用下浸提 1h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸类物 质 2.1g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 3.7g。经聚酰胺纯化后， 得纯度为 55.6% 单咖啡酰奎尼酸， 纯度为 67.8% 二咖啡酰奎尼酸。再经有机溶剂萃取， 可分别得到纯度 90% 95% 的单咖啡 酰奎尼酸 1.3g 和二咖啡酰奎尼酸 2.1g。 0025 其中野艾蒿浸提液液相图、 单咖啡酰奎尼酸液相图、 二咖啡酰奎尼酸液相图见图 1、 图 2、 图 3 所示。 0026 实施例 2 0027 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:30 （w/w） 加入 pH=5.0 体积浓度 70% 的。
20、乙醇溶液， 微 波作用下浸提 20min， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸 类物质 1.8g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 2.5g。经大孔树脂纯化后， 得纯度为 49.8% 单咖啡酰 奎尼酸， 纯度为 56.5% 二咖啡酰奎尼酸。再经聚酰胺纯化， 可分别得到纯度 85% 90% 的单 咖啡酰奎尼酸 1.1g 和二咖啡酰奎尼酸 1.7g。 0028 实施例 3 0029 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:20（w/w） 加入 pH=6.0 体积浓度 50% 的乙酸乙酯溶 液， 微波作用浸提 30min， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰。
21、奎尼 酸类物质 1.5g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 3.1g。经大孔树脂纯化后， 得纯度为 45.7% 单咖啡 酰奎尼酸， 纯度为 53.2% 二咖啡酰奎尼酸。再经有机溶剂萃取， 可分别得到纯度 80% 85% 的单咖啡酰奎尼酸 0.9g 和二咖啡酰奎尼酸 1.8g。 0030 实施例 4 0031 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:30（w/w） 加入 pH=3.0 体积浓度 70% 的乙酸丁酯溶 液， 超声作用下浸提 3h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼 说 明 书 CN 103570545 A 5 4/5 页 6 酸类物质1.2g， 二咖啡酰奎尼酸类物。
22、质2.4g。 经大孔树脂纯化后， 得纯度为43.9%单咖啡酰 奎尼酸， 纯度为 59.7% 二咖啡酰奎尼酸。再经 Sephadex LH20 纯化， 可分别得到纯度 90% 95% 的单咖啡酰奎尼酸 0.7g 和二咖啡酰奎尼酸 1.4g。 0032 实施例 5 0033 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:50 （w/w） 加入 pH=4.0 体积浓度 60% 的正丁醇溶液， 超高压提取 1h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸类物质 1.6g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 2.8g。经乙酸乙酯萃取后， 得纯度为 33.2% 单咖啡酰奎尼酸， 纯度为 41.6% 二。
23、咖啡酰奎尼酸。再经制备性液相色谱纯化， 可分别得到纯度 85% 90% 的 单咖啡酰奎尼酸 0.7g 和二咖啡酰奎尼酸 1.4g。 0034 实施例 6 0035 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:30（w/w） 加入 pH=7.0 体积浓度 40% 的甲醇溶液， 50恒温水浴下浸提 5h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼 酸类物质2.0g， 二咖啡酰奎尼酸类物质1.9g。 经乙酸乙酯纯化后， 得纯度为33.9%单咖啡酰 奎尼酸， 纯度为 39.7% 二咖啡酰奎尼酸。再经 Sephadex LH20 纯化， 可分别得到纯度 80% 85% 的单咖啡酰奎尼酸 。
24、0.7g 和二咖啡酰奎尼酸 1.1g。 0036 实施例 7 0037 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:50 （w/w） 加入 pH=3.0 体积浓度 60% 的甲醇溶液， 超 临界流体萃取 30min， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸 类物质 1.5g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 2.9g。经制备性液相色谱纯化后， 得纯度为 67.5% 单 咖啡酰奎尼酸， 纯度为 78.6% 二咖啡酰奎尼酸。再经有机溶剂萃取， 可分别得到纯度 90% 95% 的单咖啡酰奎尼酸 0.6g 和二咖啡酰奎尼酸 1.8g。 0038 实施例 8 0039 称取野艾蒿 100g， 。
25、按固液比 1:20 （w/w） 加入 pH=6.0 体积浓度 30% 的正戊醇溶液， 50恒温水浴下浸提 3h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼 酸类物质1.8g， 二咖啡酰奎尼酸类物质2.4g。 经Sephadex LH20纯化后， 得纯度为60.9%单 咖啡酰奎尼酸， 纯度为 72.3% 二咖啡酰奎尼酸。再经有机溶剂萃取， 可分别得到纯度 85% 90% 的单咖啡酰奎尼酸 1.1g 和二咖啡酰奎尼酸 1.0g。 0040 实施例 9 0041 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:40（w/w） 加入 pH=5.0 体积浓度 50% 的丙酮溶液， 微波作用下。
26、浸提 40min， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼 酸类物质 1.7g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 2.3g。经聚酰胺纯化后， 得纯度为 59.7% 单咖啡酰 奎尼酸， 纯度为 65.6% 二咖啡酰奎尼酸。再经 Sephadex LH20 纯化， 可分别得到纯度 90% 95% 的单咖啡酰奎尼酸 0.9g 和二咖啡酰奎尼酸 1.7g。 0042 实施例 10 0043 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:20 （w/w） 加入 pH=3.0 体积浓度 20% 丙酮溶液， 超声 作用下浸提 8h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸类物。
27、质 1.5g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 2.4g。经大孔树脂纯化后， 得纯度为 48.5% 单咖啡酰奎尼酸， 纯度为 53.1% 二咖啡酰奎尼酸。再经制备性液相色谱纯化， 可分别得到纯度 85% 90% 的 单咖啡酰奎尼酸 0.8g 和二咖啡酰奎尼酸 1.3g。 说 明 书 CN 103570545 A 6 5/5 页 7 0044 实施例 11 0045 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:20（w/w） 加入 pH=4.0， 乙醇 : 丙酮 =5:1 的提取液， 超声作用下浸提 2h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸类 物质 1.7g， 二咖啡酰奎尼酸类物。
28、质 2.6g。经聚酰胺纯化后， 得纯度为 55.3% 单咖啡酰奎尼 酸， 纯度为 66.2% 二咖啡酰奎尼酸。再经制备性液相色谱纯化， 可分别得到纯度 90% 95% 的单咖啡酰奎尼酸 1.0g 和二咖啡酰奎尼酸 1.7g。 0046 实施例 12 0047 称取野艾蒿 100g， 按固液比 1:50（w/w） 加入 pH=6.0， 甲醇 : 丙酮 =4:1 的提取液， 超声作用下浸提 2h， 经固液分离后， 得到含咖啡酰奎尼酸的提取液， 其中单咖啡酰奎尼酸类 物质 1.3g， 二咖啡酰奎尼酸类物质 2.5g。经 Sephadex LH20 纯化后， 得纯度为 61.6% 单咖 啡酰奎尼酸， 纯度为 78.7% 二咖啡酰奎尼酸。再经制备性液相色谱纯化， 可分别得到纯度 90% 95% 的单咖啡酰奎尼酸 0.6g 和二咖啡酰奎尼酸 1.9g。 说 明 书 CN 103570545 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103570545 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103570545 A 9 。