技术领域
本发明涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本发明涉及 H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的制备方法。
背景技术
H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl是一种模拟蛇毒毒素Waglerin I活性的小分子 多肽，临床试验表明该多肽可以通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生，具有 优秀的光滑和迅速祛皱性能。H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl作用于突触后膜，是 肌肉烟碱乙酰胆碱受体(mmAChR)可逆转的拮抗剂。寻找一种合适的合成方 法对于该小分子多肽的产业化具有重要意义。
多肽合成常用的化学合成方法有液相合成和固相合成。对于小分子多肽， 一般氨基酸小于10个氨基酸的多肽，通用的方法是采用液相合成的方法，但 是液相合成的方法步骤较多，比较繁琐，全部采用液相的合成方法得到的粗 品的纯度不高，总产率也不高。采用固相合成，除去难度较大之外，成本效 益比也极低。完全采用固相合成或完全采用液相合成都不可避免各方法的局 限性。
发明内容
我们分析了H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的结构，选择液相和固相结合的反 应方式会具有一定优势，先将Dab羧端连接到氯树脂上，然后逐步接肽，接 肽完成后再用弱酸将全保护多肽从树脂上切割下来后再用液相方法连接苄 胺，最后脱保护得到粗品肽。
首先我们将Fmoc-Dab(Boc)-OH与2-Cl-Trt树脂结合制得 Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂，氯树脂的优势在于其可以在较低的酸性下即可 将多肽从树脂上切割下来，从而不影响氨基酸的保护基而得到全包护多肽。
在制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂后，依次用哌啶DMF溶液脱除Fmoc 保护，接上Fmoc-Pro-OH和Boc-β-Ala-OH，制得 Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂。然后用三氟乙醇和低浓度的三氟乙酸 将全包护多肽从树脂上切割下来，得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH，再与苄 胺在缩合剂存在下进行缩合反应，制得Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl。
最后采用HCl/乙酸乙酯或者三氟乙酸将Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl 的保护基脱除得到H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的盐酸盐或者三氟乙酸盐。
本发明提供了一种采用固相液相结合的方法合成 H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl的方法，所述方法包括以下步骤：
首先我们将Fmoc-Dab(Boc)-OH与2-Cl-Trt树脂结合制得 Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂，氯树脂的优势在于其可以在较低的酸性下即可 将多肽从树脂上切割下来，从而不影响氨基酸的保护基而得到全包护多肽。
在制得Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂后，依次用哌啶DMF溶液脱除Fmoc 保护，接上Fmoc-Pro-OH和Boc-β-Ala-OH，制得 Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂。然后用三氟乙醇和低浓度的三氟乙酸 将全包护多肽从树脂上切割下来，得到Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH。
最后采用HCl/乙酸乙酯或者三氟乙酸的有机溶剂溶液将 Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH的保护基脱除得到H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl盐酸 盐粗品。
进一步的，所述方法还包括将制得的H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl盐酸盐粗 品经C18反相柱用洗脱液洗脱，包括用低压柱和高压柱(HPLC)得到精制的 H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl。
所述洗脱液为含有0.1～2％的HOAC或0.1～1%的TFA等反离子酸，并 且含有一定浓度的有机溶剂如乙腈、甲醇和乙醇的水溶液，洗脱方式可以采 用等度或梯度洗脱，将收集的洗脱液进行浓缩，冷冻干燥。
我们对三肽H-β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl进行了收率及纯度分析，结果证明， 本发明的方法优于单独的固相合成或液相合成，相比单纯液相合成方法操作 简单，有效地防止了副反应的发生，粗肽的纯度也大幅度提高，相应的产率 也比单独液相合成提高10%以上，取得了意想不到的技术效果。
具体实施方式
尽管不希望受任何理论的限制，但是认为本发明是以下面的事实为基础： 由于1)DAB三肽为仅含有三个氨基酸残基的小肽；2)DAB的羧端与苄胺形成 了酰胺键，因此在合成过程中可以采用固液相结合的办法来合成。
申请人将Fmoc-DAB-OH，Fmoc-Pro-OH，Boc-β-Ala-OH与氯树脂进行 逐步接肽，在弱酸三氟乙醇或1%三氟乙酸将保护三肽从树脂上切割下来，然 后与苄胺缩合得到全保护三肽，最后脱去保护得到三肽的三氟乙酸盐，采用 C18反相脱盐纯化，冻干得到DAB三肽纯品。
1.Fmoc-Dab(Boc)-OH和氯树脂偶联的制备
2-Cl-Trt树脂用DCM溶胀，将Fmoc-Dab(Boc)-OH用有机溶剂溶解后加 入到树脂中，加入有机碱调节pH值至一定值，震荡反应超过10个小时，最 后用甲醇/DIPEA/DCM封闭得到Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂。
在该步反应中采用Fmoc-作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选 自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。
所用的溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、NMP等，优选使用二 氯甲烷。
所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIPEA(二异丙基乙 基胺)等，优选使用二异丙基乙基胺。
反应温度可为-10℃至室温。
2.脱保护
Fmoc保护的氨基酸树脂的脱保护可采用哌啶/DMF或二乙胺/DMF等脱 保护试剂来实施，但较优选哌啶/DMF。
3.Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Fmoc-Pro-OH及HOBt用DMF或DCM溶解，冰水浴冷却，加入DIC活 化，将活化后的氨基酸加入上述已脱保护好的树脂当中，反应2～3小时。
所用的溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、NMP等，优选使用 N,N-二甲基甲酰胺。
所用的耦合体系可选为DIC/HOBt，HBTU/DIPEA或HATU/DIPEA或 DCC/HOBT或PyBop等，优选使用DIC/HOBt。
反应温度可为0℃～30℃。
4.H-Pro-DAB(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Fmoc的脱保护与(2)类似
5.Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Boc-β-Ala的偶联与(3)类似
6.Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-OH的制备
取干燥的肽树脂于干燥的圆底烧瓶中。加冰冻冷却的三氟乙醇或1%三氟 乙酸/DMF切割液。以8ml/g树脂的量加入中。冰浴冷却切割反应0.5h，室温 切割1.5h。过滤，滤液冰乙醚沉淀出全包护粗肽。离心分离出粗肽。
切割试剂可以选自三氟乙醇或1%三氟乙酸/DMF，但优选三氟乙醇。
7.Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-NH-Bzl的制备
将Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-OH用溶剂溶解，加入缩合剂，随后在一定 温度下与苄胺的有机溶液混合反应，在反应过程中采用有机碱维持pH值在 一定范围内。得到Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-NH-Bzl。
所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋 喃。
所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二异丙基乙基 胺)等，优选使用NMM。
在该步反应中选用DCC/HOBt作为缩合剂，此外所述缩合剂还可选自 DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意缩合剂。
在反应过程中，当pH较低时，反应产物的纯度将降低，而pH太高时， 将使产率降低。因此，优选将pH控制在8～9范围内。
反应温度可为-10℃至室温。
8.HCl·H-β-Ala-Pro-DAB-NH-Bzl的制备
脱保护可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施，但较 优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。
9.精制冻干
将制得的HCl·H-β-Ala-Pro-DAB–NH-Bzl粗产品先预处理，即用水溶解并 过滤后调节pH至5～6，采用C18反相柱进行脱盐纯化，冻干得终产品为 H-β-Ala-Pro-DAB–NH-Bzl。
利用C18反相柱进行脱盐纯化可采用等度或梯度洗脱，洗脱液为含有 0.5～1.5％的HOAC或0.1%的TFA等反离子酸，并且含有浓度范围在0～30 ％的乙腈水溶液，为了方便操作，本发明的一个实施例中采用三步梯度洗脱， 洗脱液分别为含1％HOAC和2％乙腈的水溶液、含1％HOAC和3％乙腈的 水溶液、含1％HOAC和4％乙腈的水溶液。也可以采用乙醇或甲醇等与水混 溶的溶剂，一般说来选用乙腈的分离效果要好于醇类溶剂；三氟乙酸也可以 替代醋酸作为反离子，虽然其分离效果要比醋酸好，但是由于产品中一般不 能残留三氟乙酸所以我们避免了三氟乙酸而选择了醋酸。关于选择这种梯度 我们确实经过了一定的摸索，选择该梯度分离效果较佳，洗脱时间适宜。pH 值为根据该肽的等电点以除去盐酸盐来选择的，流速没有意义，和柱子的大 小长短有关。
将收集的洗脱液进行冷冻干燥48小时得最终产品。
在本文中，所用试剂的缩写为：
DIC：二异丙基碳二亚胺
DCC：二环己基碳二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
NMM：N-甲基吗啉
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
实施例1.Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
称取2-Cl-Trt树脂80g(88mmol)和Fmoc-Dab(Boc)-OH38.75g(88mmol)， 将其加入磨口圆底烧瓶中，然后加入DIPEA157ml(880mmol)和DCM800ml， 摇匀，密封后在摇床上震荡反应17h。用DMF洗涤树脂，加入DCM850ml， 甲醇100ml，DIPEA50ml混合液封闭20min。封闭结束后用DMF600ml洗 涤树脂四次，DCM600ml洗涤树脂二次。抽走溶剂。MeOH600ml，300ml， 300ml收缩树脂三次。真空抽干。称重90.72g。干燥低温保存。
实施例2.Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
称取干燥Fmoc-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂90.72g(40mmol)于固相反应合成 柱中。800ml DCM溶胀树脂20min，抽走。用400ml DMF洗涤树脂三次。用 400ml20%piperidine/DMF脱Fmoc二次。400ml DMF*4，400ml DCM*2洗 涤树脂。抽走溶剂。
称取Fmoc-Ser(tBu)-OH、HOBT.H2O于干燥500ml广口三角瓶中。加适 量DMF溶剂溶解。置于冰水浴中冷却。加DIC活化3min，避免水汽。将活 化后的氨基酸加入上一步树脂中反应2h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树 脂2min*3次。
实施例3.Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂的制备
Fmoc-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂用400ml20%piperidine/DMF脱Fmoc 二次。400ml DMF*4，400ml DCM*2洗涤树脂。抽走溶剂。
称取Boc-β-Ala-OH、HOBT·H2O于干燥500ml广口三角瓶中。加适量 DMF溶剂溶解。置于冰水浴中冷却。加DIC活化3min，避免水汽。将活化 后的氨基酸加入上一步树脂中反应2h。抽走反应液。用适量DMF洗涤树脂 2min*3次。
实施例4.Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH的制备
称取干燥至恒重的Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-2-Cl-Trt树脂肽树脂，加适当 的三氟乙醇裂解液(1g/10mL)切割反应45min。反应结束后，用砂芯漏斗过滤 分离树脂。将滤液旋干，得到全保护粗肽。置于真空干燥器干燥至恒重。
实施例5.Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl的制备
Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-OH，HOBt用250ml无水四氢呋喃溶解，冷至 0℃，缓慢加入DCC，0℃搅拌5分钟，然后加入苄胺及N-甲基吗啉。0℃搅 拌2小时，用N-甲基吗啉维持pH8～9，室温搅拌12小时，TLC(氯仿/甲醇/ 乙酸，20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用 石油醚反复研磨，得到的固体加1500ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×3)，饱和NaCl水溶液(75ml×1)，5％KHSO4水溶液(75ml×3)，饱 和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋 干得到粗品(产率98％)。
实施例6.HCl·H-β-Ala-Pro-Dab–NH-Bzl的制备
Boc-β-Ala-Pro-Dab(Boc)-NH-Bzl，0℃下缓慢加入250ml4M HCl/乙酸乙 酯，于0℃搅拌1.5小时，反应液出现大量沉淀，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示 原料点消失，过滤，沉淀用乙酸乙酯(50ml×3)和无水乙醚(50ml×3)反复洗涤至 无HCl，得目标化合物粗品(85％)。
实施例7.精制
采用C18反相柱纯化脱盐。
粗品预处理：60g HCl·H-β-Ala-Pro-Dab–NH-Bzl分成5份，分别用5ml 水溶解，过滤。
填料：C18，柱长800mm，内径50mm，
洗脱条件：梯度洗脱，流速2ml/min，先用2％乙腈1％HOAC水溶液洗 脱，硝酸银溶液检测氯离子，接收液无氯后换为10％乙腈1％HOAC水溶液， 1小时后再转换为15％乙腈1％HOAC水溶液。
收集样品：采用TLC茚三酮显色方法检测样品的流出情况，并根据HPLC 检测数据收集主成分，合并洗脱液，冷冻干燥24小时后，再次加入蒸馏水溶 解续冻干48小时得37g终产品白色冻干粉末(产率68％，纯度99.8%)。
已经通过非限定性实施例对本发明作出了举例说明。但本领域的技术人 员会理解，在没有偏离本发明的宗旨和范围下，可以对本发明作出各种修改、 替换和变更。