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1、(10)申请公布号 CN 103553994 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103553994 A (21)申请号 201310553611.4 (22)申请日 2013.11.08 C07C 403/24(2006.01) (71)申请人 山东百龙创园生物科技有限公司 地址 251200 山东省德州市禹城市高新技术 开发区德信大街中段 (72)发明人 窦光朋 曹文杰 霍文严 魏巍 黎丽 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 王绪银 (54) 发明名称 一种利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用红。
2、发夫酵母菌体制备 虾青素乳油的方法， 是将红发夫酵母菌干粉与乙 酸混合， 在高温高压条件下进行破壁， 得含有虾青 素的破壁红发夫酵母菌液， 利用分液漏斗使用氯 仿与甲醇的混合提取溶剂分离含有虾青素的有机 相， 然后进行真空脱溶干燥， 得到虾青素乳油。本 发明方法具有操作简便、 耗费时间短、 对设备腐蚀 性要求低、 分离提取产率高等优点， 其虾青素提取 率为 88.5% 左右， 略高于高温高压酸热法， 具有较 好的工业化应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号。
3、 CN 103553994 A CN 103553994 A 1/1 页 2 1. 一种利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法， 步骤是 ： （1） 取红发夫酵母菌干粉加入有机酸中， 搅拌均匀 ； （2） 将步骤 （1） 混匀后料液置于高压容器中加热， 使温度升温至 1202， 进行保温处 理 ； （3） 将保温处理后的高压容器自然降温降压， 当容器中的压力降至常压后， 取出料液并 继续冷却至常温， 然后调节料液的 pH 并利用旋转蒸发仪去除料液中 2/3 的水分， 得含有虾 青素的破壁红发夫酵母菌液 ； （4） 将步骤 （3） 制得的菌液加入到分液漏斗中， 再向漏斗中加入有机溶剂， 加塞充分。
4、摇 匀后， 静置 5 10min 后吸出含有虾青素的有机相 ； （5） 重复步骤 （4） 的操作， 直至吸出的有机相变为无色为止 ； （6） 合并收集的含有虾青素的有机相， 在 3000 3500rpm 条件下离心 10 15min ； （7） 取离心后的上清液， 将其置于旋转蒸发仪中进行真空脱溶干燥， 待干燥完全后即得 到虾青素乳油 ； 其特征在于 ： 步骤 （1） 所述有机酸是浓度为 0.8 1.3mol/L 的乙酸， 红发夫酵母菌干粉与乙酸按 1kg:18 23L 的比例混合， 混合之后， 向混合料液中加入维生素 C， 使其终浓度为 3mg/ml ； 步骤 （2） 所述加热的高温高压条件。
5、是 ： 温度 121、 饱和蒸汽压力 0.1Mpa， 所述保温处 理的时间为 4 8 分钟 ； 步骤 （3） 所述调节料液的 pH 至 5.0 7.0 ； 步骤 （4） 所述有机溶剂是氯仿与甲醇的混合溶液， 其中以体积比计氯仿 : 甲醇为 2 3:1 ； 含有虾青素的有机相是氯仿层 ； 步骤 （7） 所述真空脱溶干燥的条件是 ： 真空度 0.07 0.09MPa、 温度 45 50。 2. 根据权利要求 1 所述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法， 其特征在于 ： 步 骤 （1） 所述红发夫酵母菌干粉购自山东广博生物技术服务有限公司。 3. 根据权利要求 1 所述利用红发夫酵母菌体制备虾青。
6、素乳油的方法， 其特征在于 ： 步 骤 （1） 所述有机酸是浓度为 1.0mol/L 的乙酸， 红发夫酵母菌干粉与乙酸按 1kg:20L 的比例 混合。 4. 根据权利要求 1 所述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法， 其特征在于 ： 步 骤 （2） 所述保温处理的时间为 5 分钟。 5. 根据权利要求 1 所述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法， 其特征在于 ： 步 骤 （3） 所述调节料液的 pH 至 6.5。 6. 根据权利要求 1 所述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法， 其特征在于 ： 步 骤 （4） 所述氯仿与甲醇的混合溶液以体积比计氯仿 : 甲醇为 2:1。 权 利 。
7、要 求 书 CN 103553994 A 2 1/4 页 3 一种利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种乳油的制备方法， 尤其涉及一种利用红发夫酵母菌体制备虾青素 乳油的方法。 背景技术 0002 虾青素是类胡萝卜素的一种， 广泛存在于虾蟹废弃物、 某些藻类和真菌中。 研究证 明， 虾青素具有很强的抗氧化能力 ； 另外， 虾青素还具有抑制肿瘤发生、 增强人体免疫力等 多种生理功能。据此， 虾青素在高级保健品、 食品、 药品以及饲料添加剂等方面具有广泛的 应用前景。 0003 目前， 虾青素主要通过以下四种途径获得 ：（1） 化学合成 ；（2） 从甲壳类水产品。
8、废 弃物中提取 ；（3） 从藻类中提取 ；（4） 利用微生物 （如雨生红球藻和红发夫酵母等） 发酵生 产。由于虾青素分子结构复杂， 合成困难， 所以化学合成生产的虾青素价格比较昂贵 ； 而从 甲壳类水产品废弃物中提取的方法， 也面临着原材料来源和收集困难、 供应不稳定的问题。 因此， 目前国内外的研究重点都放在了利用微生物来生产获取虾青素的途径上。 0004 研究发现虾青素在野生红发夫酵母所具有的十几种类胡萝卜素中占的比例最大， 达到了 40%-95%， 因此， 红发夫酵母被认为是工业化发酵生产虾青素的优良的潜在菌株。但 是由于虾青素是一种胞内色素以及红发夫酵母的细胞壁较厚， 虾青素的提取比较。
9、困难。目 前， 对于红发夫酵母中的虾青素普遍采取的提取工艺是 ： 先经一定的方法破壁后再进行提 取。已有常规细胞破壁的手段主要有机械法、 酶法、 物理法和化学法等四大类， 但其均不同 程度的存在操作复杂、 耗费时间长等缺点。 0005 酸法破壁和高温湿热破壁是目前效果较好的两种破壁方法， 也有研究人员研发出 一种比较高效的破壁方法高温高压酸热法。但是， 高温高压酸热法中所使用的盐酸对 金属具有较强的腐蚀作用， 需要使用一种高温耐酸装置， 这在无形之中增加了生产成本， 不 利于工业化生产。 发明内容 0006 针对现有技术的不足， 本发明所要解决的问题是提供一种改进的利用红发夫酵母 菌体制备虾青。
10、素乳油的方法。 0007 本发明所述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法， 步骤是 ： 0008 （1） 取红发夫酵母菌干粉加入有机酸中， 搅拌均匀 ； 0009 （2） 将步骤 （1） 混匀后料液置于高压容器中加热， 使温度升温至 1202， 进行保 温处理 ； 0010 （3） 将保温处理后的高压容器自然降温降压， 当容器中的压力降至常压后， 取出料 液并继续冷却至常温， 然后调节料液的 pH 并利用旋转蒸发仪去除料液中 2/3 的水分， 得含 有虾青素的破壁红发夫酵母菌液 ； 0011 （4） 将步骤 （3） 制得的菌液加入到分液漏斗中， 再向漏斗中加入有机溶剂， 加塞充 说 明 书 。
11、CN 103553994 A 3 2/4 页 4 分摇匀后， 静置 5 10min 后吸出含有虾青素的有机相 ； 0012 （5） 重复步骤 （4） 的操作， 直至吸出的有机相变为无色为止 ； 0013 （6） 合并收集的含有虾青素的有机相， 在30003500rpm条件下离心1015min ； 0014 （7） 取离心后的上清液， 将其置于旋转蒸发仪中进行真空脱溶干燥， 待干燥完全后 即得到虾青素乳油 ； 0015 其特征在于 ： 0016 步骤 （1） 所述有机酸是浓度为 0.8 1.3mol/L 的乙酸， 红发夫酵母菌干粉与乙酸 按 1kg:18 23L 的比例混合， 混合之后， 向混合。
12、料液中加入维生素 C， 使其终浓度为 3mg/ ml ； 0017 步骤 （2） 所述加热的高温高压条件是 ： 温度 121、 饱和蒸汽压力 0.1Mpa， 所述保 温处理的时间为 4 8 分钟 ； 0018 步骤 （3） 所述调节料液的 pH 至 5.0 7.0 ； 0019 步骤 （4） 所述有机溶剂是氯仿与甲醇的混合溶液， 其中以体积比计氯仿 : 甲醇为 2 3:1 ； 含有虾青素的有机相是氯仿层 ； 0020 步骤 （7） 所述真空脱溶干燥的条件是 ： 真空度 0.07 0.09MPa、 温度 45 50。 0021 上述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油方法中 ： 步骤 （1） 所述红。
13、发夫酵母菌干 粉优选购自山东广博生物技术服务有限公司。 0022 上述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油方法中 ： 步骤 （1） 所述有机酸优选是浓 度为 1.0mol/L 的乙酸， 红发夫酵母菌干粉与乙酸优选按 1kg:20L 的比例混合。 0023 上述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油方法中 ： 步骤 （2） 所述保温处理的时间 优选为 5 分钟。 0024 上述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油方法中 ： 步骤 （3） 所述调节料液的 pH 优 选至 6.5。 0025 上述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油方法中 ： 步骤 （4） 所述氯仿与甲醇的混 合溶液以体积比计氯仿 : 甲醇优选为 2。
14、:1。 0026 本发明所述利用红发夫酵母菌体制备虾青素乳油的方法是一种高温高压有机酸 热法， 其改进了红发夫酵母菌体的破壁方法及从含有虾青素的破壁红发夫酵母菌液中提 取虾青素的方法， 在所述方法中， 选使用的乙酸对金属的腐蚀性较小， 相比于高温高压酸热 法， 降低了对设备的要求， 同时所使用的提取溶剂 （氯仿与甲醇的混合溶液） 较其他有机溶 剂 （如乙醇等） 具有较好的提取效果。 0027 本发明提出的虾青素乳油制备方法具有操作简便、 耗费时间短等优点， 其虾青素 提取率为 88.5% 左右， 略高于高温高压酸热法， 具有较好的工业化应用前景。 具体实施方式 0028 实施例 1 0029 。
15、（1） 取红发夫酵母菌干粉 （购自山东广博生物技术服务有限公司） ， 将红发夫酵母 菌干粉与乙酸按1kg:20L的比例加入浓度为1.0mol/L的乙酸中， 搅拌均匀， 混合之后， 向混 合料液中加入维生素 C， 使其终浓度为 3mg/ml ； 0030 （2） 将步骤 （1） 混匀后料液置于高压容器中加热， 使温度升温至 121， 饱和蒸汽 说 明 书 CN 103553994 A 4 3/4 页 5 压力为 0.1Mpa， 进行保温处理 5 分钟 ； 0031 （3） 将保温处理后的高压容器自然降温降压， 当容器中的压力降至常压后， 取出料 液并继续冷却至常温， 然后调节料液的 pH 至 6。
16、.5 并利用旋转蒸发仪去除料液中 2/3 的水 分， 得含有虾青素的破壁红发夫酵母菌液 ； 0032 （4） 将步骤 （3） 制得的菌液加入到分液漏斗中， 再向漏斗中加入氯仿与甲醇的混合 溶液 （以体积比计氯仿 : 甲醇为 2:1） ， 加塞充分摇匀后， 静置 5 后小心吸出含有虾青素的氯 仿层 （有机相下层） ； 0033 （5） 重复步骤 （4） 的操作， 直至吸出的氯仿层变为无色为止 ； 0034 （6） 合并收集的含有虾青素的氯仿层， 在 3500rpm 条件下离心 10min ； 0035 （7） 取离心后的上清液， 将其置于旋转蒸发仪中， 于真空度 0.08MPa、 50的条件下 。
17、进行真空脱溶干燥， 待干燥完全后即得到虾青素乳油。 0036 实施例 2 0037 （1） 取红发夫酵母菌干粉 （购自山东广博生物技术服务有限公司） ， 将红发夫酵母 菌干粉与乙酸按1kg:18L的比例加入浓度为0.8mol/L的乙酸中， 搅拌均匀， 混合之后， 向混 合料液中加入维生素 C， 使其终浓度为 3mg/ml ； 0038 （2） 将步骤 （1） 混匀后料液置于高压容器中加热， 使温度升温至 122， 饱和蒸汽 压力为 0.1Mpa， 进行保温处理 4 分钟 ； 0039 （3） 将保温处理后的高压容器自然降温降压， 当容器中的压力降至常压后， 取出料 液并继续冷却至常温， 然后调。
18、节料液的 pH 至 7.0 并利用旋转蒸发仪去除料液中 2/3 的水 分， 得含有虾青素的破壁红发夫酵母菌液 ； 0040 （4） 将步骤 （3） 制得的菌液加入到分液漏斗中， 再向漏斗中加入氯仿与甲醇的混合 溶液 （以体积比计氯仿 : 甲醇为 2:1） ， 加塞充分摇匀后， 静置 5 后小心吸出含有虾青素的氯 仿层 （有机相下层） ； 0041 （5） 重复步骤 （4） 的操作， 直至吸出的氯仿层变为无色为止 ； 0042 （6） 合并收集的含有虾青素的氯仿层， 在 3000rpm 条件下离心 15min ； 0043 （7） 取离心后的上清液， 将其置于旋转蒸发仪中， 于真空度 0.07M。
19、Pa、 50的条件下 进行真空脱溶干燥， 待干燥完全后即得到虾青素乳油。 0044 实施例 3 0045 （1） 取红发夫酵母菌干粉 （购自山东广博生物技术服务有限公司） ， 将红发夫酵母 菌干粉与乙酸按1kg:23L的比例加入浓度为1.3mol/L的乙酸中， 搅拌均匀， 混合之后， 向混 合料液中加入维生素 C， 使其终浓度为 3mg/ml ； 0046 （2） 将步骤 （1） 混匀后料液置于高压容器中加热， 使温度升温至 120， 饱和蒸汽 压力为 0.1Mpa， 进行保温处理 8 分钟 ； 0047 （3） 将保温处理后的高压容器自然降温降压， 当容器中的压力降至常压后， 取出料 液并继。
20、续冷却至常温， 然后调节料液的 pH 至 5.0 并利用旋转蒸发仪去除料液中 2/3 的水 分， 得含有虾青素的破壁红发夫酵母菌液 ； 0048 （4） 将步骤 （3） 制得的菌液加入到分液漏斗中， 再向漏斗中加入氯仿与甲醇的混合 溶液 （以体积比计氯仿 : 甲醇为 3:1） ， 加塞充分摇匀后， 静置 5 后小心吸出含有虾青素的氯 仿层 （有机相下层） ； 说 明 书 CN 103553994 A 5 4/4 页 6 0049 （5） 重复步骤 （4） 的操作， 直至吸出的氯仿层变为无色为止 ； 0050 （6） 合并收集的含有虾青素的氯仿层， 在 30000rpm 条件下离心 10min ； 0051 （7） 取离心后的上清液， 将其置于旋转蒸发仪中， 于真空度 0.09MPa、 45的条件下 进行真空脱溶干燥， 待干燥完全后即得到虾青素乳油。 说 明 书 CN 103553994 A 6 。