生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用.pdf

《生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用.pdf（20页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102604882 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102604882 A *CN102604882A* (21)申请号 201210102114.8 (22)申请日 2012.03.31 CCTCC NO: M 2012051 2012.03.02 C12N 1/21(2006.01) C12P 13/22(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 福建省麦丹生物集团有限公司 地址 365500 福建省三明市金沙高科技园区 (72)发明人 吴伟斌 黄钦耿 施巧琴 翁雪清 赵燕玉 陈炳生 黄祥峰 林宜云 黄维锦 吴松刚。

2、 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 生产 L- 苯丙氨酸的工程菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了生产 L- 苯丙氨酸的工程菌及 其应用。本发明提供了将重组质粒导入大肠杆菌 得到的重组菌 ； 所述重组质粒为将 pheA 蛋白的编 码基因、 aroD 蛋白的编码基因、 aroE 蛋白的编码 基因和 talA 蛋白的编码基因插入出发载体的多 克隆位点得到的重组质粒 ； 所述大肠杆菌的 CICC 编号为 10245 ； 所述 pheA 蛋白如序列表的序列 1 所示 ； 所述 aroD 蛋白如序列表的序列 3 所示 ； 所 述aro。

3、E蛋白如序列表的序列5所示 ； 所述talA蛋 白如序列表的序列 7 所示。本发明的提供的工程 菌可直接发酵得到 L- 苯丙氨酸， 发酵 48 小时后， 发酵液中的 L- 苯丙氨酸含量高达 75g/L， 极具生 产应用价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 9 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌 ； 所述重组质粒为将 pheA 蛋白的编码基因、 aroD 蛋白的编码基因、 。

4、aroE 蛋白的编码基因和 talA 蛋白的编码基因插入出发载体的多克 隆位点得到的重组质粒 ； 所述大肠杆菌的CICC编号为10245 ； 所述pheA蛋白如序列表的序 列 1 所示 ； 所述 aroD 蛋白如序列表的序列 3 所示 ； 所述 aroE 蛋白如序列表的序列 5 所示 ； 所述 talA 蛋白如序列表的序列 7 所示。 2. 如权利要求 1 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述 pheA 蛋白的编码基因如序列表的序 列2所示 ； 所述aroD蛋白的编码基因如序列表的序列4所示 ； 所述aroE蛋白的编码基因如 序列表的序列 6 所示 ； 所述 talA 蛋白的编码基因如序列表的。

5、序列 8 所示。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述重组质粒中， 自上游至下游依次 包括所述 pheA 蛋白的编码基因、 所述 aroD 蛋白的编码基因、 所述 aroE 蛋白的编码基因和 所述 talA 蛋白的编码基因。 4. 如权利要求 1 或 2 或 3 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述出发载体为载体 pBV220。 5. 如权利要求 4 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述重组质粒为将所述 pheA 蛋白的编 码基因插入所述载体 pBV220 的 BglII 酶切位点、 所述 aroD 蛋白的编码基因插入所述载体 pBV220 的 EcoRI 和 B。

6、amHI 酶切位点之间、 所述 aroE 蛋白的编码基因插入所述载体 pBV220 的 BamHI 和 SacI 酶切位点之间、 所述 talA 蛋白的编码基因插入所述载体 pBV220 的 SacI 酶切位点得到的重组质粒。 6. 如权利要求 5 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述重组菌为大肠杆菌 (Escherichia coli)MF0018， 它的保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012051。 7. 权利要求 1 至 6 中任一所述的重组菌在生产 L- 苯丙氨酸中的应用。 8. 一种生产 L- 苯丙氨酸的方法， 包括如下步骤 ： 将权利要求 1 至 6 中任一所述的重组 菌进。

7、行发酵， 得到 L- 苯丙氨酸。 权 利 要 求 书 CN 102604882 A 2 1/6 页 3 生产 L- 苯丙氨酸的工程菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生产 L- 苯丙氨酸的工程菌及其应用。 背景技术 0002 L- 苯丙氨酸 (L-phenylalanine) 是人体必须的氨基酸之一， 广泛应用于食品、 饲 料、 医药和化妆品等领域。低热量、 高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜 (Aspartame) 的应用日益 广泛， 作为合成阿斯巴甜两种原料之一的 L- 苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外， L- 苯 丙氨酸也是抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂的必需原料， 随着其在医药领域的应用不。

8、断扩 展， 需求量也将不断增加。 0003 传统的菌株选育是从自然界中筛选有产 L- 苯丙氨酸能力的菌株， 并建立其培养 条件开始的。但是该方法所能积累的氨基酸种类有限， 后来在确立突变技术和阐明氨基酸 合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、 抗药性菌株的选育， 但是采用常规诱 变育种的方法， 盲目性大， 工作量繁重， 不能增加基因的数量， 且突变株一般都携带营养缺 陷， 产量进一步提高受到限制。 发明内容 0004 本发明的目的是提供生产 L- 苯丙氨酸的工程菌及其应用。 0005 本发明保护将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌 ； 所述重组质粒为将 pheA 蛋 白的编码基因、 ar。

9、oD蛋白的编码基因、 aroE蛋白的编码基因和talA蛋白的编码基因插入出 发载体的多克隆位点得到的重组质粒 ； 所述大肠杆菌的CICC编号为10245 ； 所述pheA蛋白 如序列表的序列1所示 ； 所述aroD蛋白如序列表的序列3所示 ； 所述aroE蛋白如序列表的 序列 5 所示 ； 所述 talA 蛋白如序列表的序列 7 所示。 0006 所述 pheA 蛋白的编码基因可如序列表的序列 2 所示 ； 所述 aroD 蛋白的编码基因 可如序列表的序列 4 所示 ； 所述 aroE 蛋白的编码基因可如序列表的序列 6 所示 ； 所述 talA 蛋白的编码基因可如序列表的序列 8 所示。 0。

10、007 所述重组质粒中， 自上游至下游可依次包括所述 pheA 蛋白的编码基因、 所述 aroD 蛋白的编码基因、 所述 aroE 蛋白的编码基因和所述 talA 蛋白的编码基因。 0008 所述出发载体具体可为载体 pBV220。 0009 所述重组质粒具体可为将所述 pheA 蛋白的编码基因插入所述载体 pBV220 的 BglII酶切位点、 所述aroD蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位 点之间、 所述 aroE 蛋白的编码基因插入所述载体 pBV220 的 BamHI 和 SacI 酶切位点之间、 所述 talA 蛋白的编码基因插入所述载体 pBV22。

11、0 的 SacI 酶切位点得到的重组质粒。 0010 所述重组菌为具体可为大肠杆菌 (Escherichia coli)MF0018。大肠杆菌 (Escherichia coli)MF0018简称大肠杆菌MF0018， 已于2012年3月2日保藏于中国典型培 养物保藏中心 ( 简称 CCTCC ； 地址 ： 中国武汉， 武汉大学 ； 邮编 ： 430072)， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012051。 说 明 书 CN 102604882 A 3 2/6 页 4 0011 以上任一所述重组菌均可用于生产 L- 苯丙氨酸。 0012 本发明还保护一种生产 L- 苯丙氨酸的方法， 包。

12、括如下步骤 ： 将以上任一所述的重 组菌进行发酵， 得到 L- 苯丙氨酸。 0013 所述发酵的条件可为37、 溶氧50-70、 48小时。 所述发酵采用的发酵培养基具 体如下 ： 由溶质和水组成 ； 溶质及其在发酵培养基中的浓度如下 ： Na2HPO412H2O 20g/L、 柠 檬酸钠 8g/L、 谷氨酸钠 0.5g/L、 酪氨酸 0.8g/L、 葡萄糖 20g/L 和氨苄青霉素 50mg/L。所述 发酵培养基的pH具体可为7。 所述发酵过程中通过补加葡萄糖控制发酵体系的葡萄糖含量 为 4g/L。 0014 所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。 所述种子液是将所 述重组菌。

13、接种至种子培养基进行培养得到的。所述种子液的 OD610nm具体可为 30。所述种子 液与所述发酵培养基的体积配比具体可为14。 所述培养的条件可为37、 溶氧50-70、 12 小时。所述种子培养基具体由溶质和水组成 ； 溶质及其在发酵培养基中的浓度如下 ： 蛋 白胨1g/100mL、 氯化钠1g/100mL、 酵母粉0.5g/100mL和氨苄青霉素50g/mL。 所述种子培 养基的 pH 具体可为 7。 0015 本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-苯丙氨酸， 发酵48小时后， 发酵液中的 L- 苯丙氨酸含量高达 75g/L， 极具生产应用价值。 附图说明 0016 图 1 为载体 pB。

14、V220 的结构示意图。 0017 图 2 为重组质粒 pBV220-pheA 的结构示意图。 0018 图 3 为重组质粒 pBV220-pheA-aroD 的结构示意图。 0019 图 4 为重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE 的结构示意图。 0020 图 5 为重组质粒 pBV-pheA-aroD-aroE-talA 的结构示意图。 0021 图 6 为氨基酸标准溶液的 HPLC 谱图。 0022 图 7 为发酵液的稀释液的 HPLC 谱图。 0023 图 8 为对照液的稀释液的 HPLC 谱图。 具体实施方式 0024 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本。

15、发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0025 大肠杆菌 (Escherichia coli) 获自中国工业微生物菌种保藏管理中心 (www. china-cicc.org， 简称 CICC)， 编号为 10245， 简称大肠杆菌 10245。 0026 实施例 1、 重组质粒 pBV-pheA-aroD-aroE-talA 的构建 0027 一、 重组质粒 pBV220-pheA 的构建 0028 1、 以大肠杆菌 。

16、10245 的基因组 DNA 为模板， 用 F1 和 R1 组成的引物对进行 PCR 扩 增， 得到 PCR 扩增产物。 0029 F1 ： 5 -GAGATCTATGACATCGGAAAACCCGTTACT-3 ( 下划线标注 BgLII 酶切识别序 说 明 书 CN 102604882 A 4 3/6 页 5 列 ) ； 0030 R1 ： 5 -GAAGATCTTCAGGTTGGATCAACAGGCACTA-3 ( 下划线标注 BgLII 酶切识别序 列 )。 0031 F1 和 R1 的靶序列如序列表的序列 2 所示 ( 序列表的序列 2 所示基因即为 pheA 基 因， 编码序列表的。

17、序列 1 所示的 pheA 蛋白 )。 0032 PCR 扩增条件 ： 94预变性 5 分钟 ； 94变性 1 分钟、 56退火 1 分钟、 72延伸 1 分钟 30 秒， 30 个循环 ； 72保温 10 分钟。 0033 2、 回收 PCR 扩增产物 ( 约 1200bp) 并用限制性内切酶 BglII 进行酶切， 回收酶切 产物。 0034 3、 用限制性内切酶BglII酶切载体pBV220(从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司购得， 结构示意图见图 1)， 回收载体骨架 ( 约 3.6kb)。 0035 4、 将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接， 得到重组质粒pBV220-phe。

18、A。 重 组质粒pBV220-pheA的结构示意图见图2。 根据测序结果， 对重组质粒pBV220-pheA进行结 构描述如下 ： 在载体 pBV220 的 BglII 酶切位点之间插入了序列表的序列 2 所示的 pheA 基 因。 0036 二、 重组质粒 pBV220-pheA-aroD 的构建 0037 1、 以大肠杆菌 10245 的基因组 DNA 为模板， 用 F2 和 R2 组成的引物对进行 PCR 扩 增， 得到 PCR 扩增产物。 0038 F2 ： 5 -CGGAATTCATGAAAACCGTAACTGTAAA-3 ( 下划线标注 EcoRI 酶切识别序列 ) ； 0039 。

19、R2 ： 5 -CGGGATCCTTATGCCTGGTGTAAAATAGT-3 (下划线标注BamHI酶切识别序列)。 0040 F2 和 R2 的靶序列如序列表的序列 4 所示 ( 序列表的序列 4 所示基因即为 aroD 基 因， 编码序列表的序列 3 所示的 aroD 蛋白 )。 0041 PCR 扩增条件 ： 94预变性 5 分钟 ； 94变性 1 分钟、 56退火 1 分钟、 72延伸 1 分钟， 30 个循环 ； 72保温 10 分钟。 0042 2、 回收 PCR 扩增产物 ( 约 800bp) 并用限制性内切酶 EcoRI 和 BamHI 进行双酶切， 回收酶切产物。 0043。

20、 3、 用限制性内切酶 EcoRI 和 BamHI 双酶切重组质粒 pBV220-pheA， 回收载体骨架 ( 约 4.9kb)。 0044 4、将 步 骤 2 的 酶 切 产 物 和 步 骤 3 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pBV220-pheA-aroD。 重组质粒pBV220-pheA-aroD的结构示意图见图3。 根据测序结果， 对重 组质粒 pBV220-pheA-aroD 进行结构描述如下 ： 在重组质粒 pBV220-pheA 的 EcoRI 和 BamHI 酶切位点之间插入了序列表的序列 4 所示的 aroD 基因。 0045 三、 重组质粒 pBV22。

21、0-pheA-aroD-aroE 的构建 0046 1、 以大肠杆菌 10245 的基因组 DNA 为模板， 用 F3 和 R3 组成的引物对进行 PCR 扩 增， 得到 PCR 扩增产物。 0047 F3 ： 5 -CGGGATCCATGGAAACCTATGCTGTTTTTGGTA-3 ( 下划线标注 BamHI 酶切识别 序列 ) ； 0048 R3 ： 5 -GCGTCGACTCACGCGGACAATTCCTCCTGC-3 (下划线标注SacI酶切识别序列)。 0049 F3 和 R3 的靶序列如序列表的序列 6 所示 ( 序列表的序列 6 所示基因即为 aroE 基 说 明 书 CN 。

22、102604882 A 5 4/6 页 6 因， 编码序列表的序列 5 所示的 aroE 蛋白 )。 0050 PCR 扩增条件 ： 94预变性 5 分钟 ； 94变性 1 分钟、 56退火 1 分钟、 72延伸 1 分钟， 30 个循环 ； 72保温 10 分钟。 0051 2、 回收 PCR 扩增产物 ( 约 800bp) 并用限制性内切酶 BamHI 和 SacI 进行双酶切， 回收酶切产物。 0052 3、 用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切重组质粒pBV220-pheA-aroD， 回收载体骨 架 ( 约 5.7kb)。 0053 4、将 步 骤 2 的 酶 切 产 物 和 步。

23、 骤 3 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pBV220-pheA-aroD-aroE。重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE 的结构示意图见图 4。根 据测序结果， 对重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE 进行结构描述如下 ： 在重组质粒 pBV220-pheA-aroD 的 BamHI 和 SacI 酶切位点之间插入了序列表的序列 6 所示的 aroE 基 因。 0054 四、 重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE-talA 的构建 0055 1、 以大肠杆菌 10245 的基因组 DNA 为模板， 用 F4 和 R4 组成的。

24、引物对进行 PCR 扩 增， 得到 PCR 扩增产物。 0056 F4 ： 5 -GCGTCGACATGAACGAGTTAGACGGCAT-3 ( 下划线标注 SacI 酶切识别序列 ) ； 0057 R4 ： 5 -GCGTCGACTTATAGTTTGGCGGCAAGAAG-3 ( 下划线标注 SacI 酶切识别序列 )。 0058 F4 和 R4 的靶序列如序列表的序列 8 所示 ( 序列表的序列 8 所示基因即为 talA 基 因， 编码序列表的序列 7 所示的 talA 蛋白 )。 0059 PCR 扩增条件 ： 94预变性 5 分钟 ； 94变性 1 分钟、 56退火 1 分钟、 7。

25、2延伸 1 分钟 10 秒， 30 个循环 ； 72保温 10 分钟。 0060 2、 回收 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp) 并用限制性内切酶 SacI 进行酶切， 回收酶切产 物。 0061 3、 用限制性内切酶 SacI 酶切重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE， 回收载体骨架 ( 约 6.5kb)。 0062 4、将 步 骤 2 的 酶 切 产 物 和 步 骤 3 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pBV220-pheA-aroD-aroE-talA。重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE-talA 的结构示意图见 图 5。根据测。

26、序结果， 对重组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE-talA 进行结构描述如下 ： 在重 组质粒 pBV220-pheA-aroD-aroE 的 SacI 酶切位点之间插入了序列表的序列 8 所示的 talA 基因。 0063 实施例 2、 工程菌的构建 0064 将重组质粒pBV220-pheA-aroD-aroE-talA电击转化大肠杆菌10245原生质体， 然 后用 F1 和 R4 组成的引物对进行 PCR 鉴定 ( 显示约 4kb 的特异条带的为 PCR 鉴定阳性 )， 得 到重组菌。 0065 将 一 株 重 组 菌 命 名 为 大 肠 杆 菌 (Escherichia。

27、 coli)MF0018。 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)MF0018简称大肠杆菌MF0018， 已于2012年3月2日保藏于中国典型培 养物保藏中心 ( 简称 CCTCC ； 地址 ： 中国武汉， 武汉大学 ； 邮编 ： 430072)， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2012051。 0066 实施例 3、 应用大肠杆菌 MF0018 生产 L- 苯丙氨酸 说 明 书 CN 102604882 A 6 5/6 页 7 0067 一、 应用大肠杆菌 MF0018 生产 L- 苯丙氨酸 0068 1、 种子培养 ( 采用 30L 全自动发酵罐， 种子培养基装液量为。

28、 15L) 0069 将 大 肠 杆 菌 MF0018 接 种 至 种 子 培 养 基， 发 酵 罐 控 制 参 数 为 37 、 溶 氧 (DO)50-70， 培养 12 小时， 得到种子液 ( 种子液的 OD610nm 30)。 0070 种子培养基 (LB 培养基， pH7.0) 由溶质和水组成 ； 溶质及其在发酵培养基中的浓 度如下 ： 蛋白胨 1g/100mL、 氯化钠 1g/100mL、 酵母粉 0.5g/100mL 和氨苄青霉素 50g/mL。 0071 2、 发酵培养 ( 采用 30L 全自动发酵罐， 发酵培养基装液量 15L) 0072 将 1 体积份种子液接种至 4 体积份。

29、发酵培养基 ； 发酵罐控制参数为 37、 溶氧 (DO)50-70， 发酵体系中的葡萄糖含量低于 4g/L 时， 由发酵罐自动补加 700g/L 的葡萄糖 水溶液， 保持发酵体系的葡萄糖含量为 4g/L ； 发酵时间为 48 小时。 0073 发酵培养基 (pH7.0) 由溶质和水组成 ； 溶质及其在发酵培养基中的浓度如下 ： Na2HPO4 12H2O 20g/L、 柠檬酸钠 8g/L、 谷氨酸钠 0.5g/L、 酪氨酸 0.8g/L、 葡萄糖 20g/L 和氨 苄青霉素 50mg/L。 0074 4、 将步骤 3 的发酵体系离心 (4500rpm、 15min)， 收集上清液 ( 发酵液 。

30、)。 0075 5、 将发酵液用水稀释至 200 倍体积后进行步骤三的液相检测。 0076 二、 对照液的制备 0077 将大肠杆菌 10245 代替大肠杆菌 MF0018 进行步骤一的实验， 收集上清液 ( 对照 液 )。将对照液用水稀释至 100 倍体积后进行步骤三的液相检测。 0078 三、 发酵液中 L- 苯丙氨酸浓度的测定 0079 L- 苯丙氨酸 (phe) 浓度的测定方法采用氨基酸常用测定方法， 即高效液相色 谱 (HPLC) 柱 前 衍 生 化 方 法 (Rapid， accrate， senstitive， and reprodicobLe HPLC anaLysis of 。

31、amino acida.Henderson， J.W， Ricker， R.D.， BidLingmeyer， B.A.， Woodward， C.， AgiLent TechnoLogier， MSA， 2000)。 0080 样品溶液中 L- 苯丙氨酸浓度 (g/mL) f1/f2C ； f1 样品溶液中 L- 苯丙氨 酸的峰面积 / 内标的峰面积 ； f2 氨基酸标准溶液中 L- 苯丙氨酸的面积 / 内标的峰面积 ； C 氨基酸标准溶液中的 L- 苯丙氨酸 (g/mL)。 0081 色 谱 柱 ： AgeLa VensiL AA 柱， (4.6*250mm， 5m) ； 柱 温 ： 40。

32、 ； 监 测 波 长 ： 254nm ； 0082 流动相A的制备方法 ： 取15.2g无水醋酸钠， 加水1850mL， 溶解后用冰醋酸调pH至 6.5， 然后加 140mL 乙腈， 混匀， 用 0.45m 滤膜过滤 ； 0083 流动相 B ： 由 4 体积份乙腈和 1 体积份水组成 ； 0084 流速 ： 1mL/min。 0085 正亮氨酸内标溶液的制备方法 ： 取正亮氨酸 (NLe)10mg， 加 10mL 0.1moL/L 盐酸水 溶液， 溶解。 0086 氨基酸标准溶液 ： 购买于天津博纳艾杰尔科技有限公司， 其中苯丙氨酸浓度为 2.5moL/mL。 0087 氨基酸标准溶液和样品。

33、溶液的衍生， 依次进行如下步骤 ： 0088 (1) 分别量取氨基酸标准溶液和待测样品液各 200L， 分别置于 1.5mL 离心管 中 ； 说 明 书 CN 102604882 A 7 6/6 页 8 0089 (2) 每个离心管中加入正亮氨酸内标溶液 20L ； 0090 (3)每个离心管中加入100L三乙胺乙腈溶液(1.4mL三乙胺中加入8.6mL乙腈， 混匀)和100L异硫氰酸苯酯乙腈溶液(25L异硫氰酸苯酯加入2mL乙腈， 混匀)， 混匀， 室温放置 1 小时 ； 0091 (4) 每个离心管中加入 400L 正己烷， 振摇后放置 10min ； 0092 (5) 取下层溶液 (PT。

34、C- 苯丙氨酸 )， 用 0.45m 针式滤器过滤 ； 0093 (6) 取滤液 200L， 加 800L 水稀释， 摇匀， 进样 10L。 0094 梯度洗脱过程 ： 第 0-2min 的洗脱液为流动相 A ； 第 2-14min 的洗脱液由流动相 A 和流动相 B 组成， 流动相 A 在洗脱液中的体积份数由 100线性下降至 93 ； 第 14-29min 的洗脱液由流动相 A 和流动相 B 组成， 流动相 A 在洗脱液中的体积份数由 93线性下降至 70； 第29-32min的洗脱液由流动相A和流动相B组成， 流动相A在洗脱液中的体积份数由 70线性下降至 50； 第 32-33min 。

35、的洗脱液由流动相 A 和流动相 B 组成， 流动相 A 在洗脱 液中的体积份数由 50线性上升至 100 ； 第 33-39min 的洗脱液为流动相 A ； 第 39-45min 的洗脱液由流动相A和流动相B组成， 流动相A在洗脱液中的体积份数由100线性下降至 0 ； 第 45min 的洗脱液为流动相 B。 0095 氨基酸标准溶液的 HPLC 谱图见图 6。NLe 的峰面积为 1301485。phe 的峰面积为 3770598， 保留时间为 33.65min。 0096 发酵液的稀释液的 HPLC 谱图见图 7。phe 的峰面积为 7300825。 0097 对照液的稀释液的 HPLC 谱。

36、图见图 8。phe 的峰面积为 4825418。 0098 发酵液中的 L- 苯丙氨酸浓度为 75g/L， 对照液中的 L- 苯丙氨酸浓度为 21g/L。大 肠杆菌 MF0018 比大肠杆菌 10245 产 L- 苯丙氨酸提高约 3.6 倍， 具有很高的生产价值。 说 明 书 CN 102604882 A 8 1/9 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102604882 A 9 2/9 页 10 0003 序 列 表 CN 102604882 A 10 3/9 页 11 0004 序 列 表 CN 102604882 A 11 4/9 页 12 0005 序 列 表 CN 1026。

37、04882 A 12 5/9 页 13 0006 序 列 表 CN 102604882 A 13 6/9 页 14 0007 序 列 表 CN 102604882 A 14 7/9 页 15 0008 序 列 表 CN 102604882 A 15 8/9 页 16 0009 序 列 表 CN 102604882 A 16 9/9 页 17 序 列 表 CN 102604882 A 17 1/3 页 18 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102604882 A 18 2/3 页 19 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102604882 A 19 3/3 页 20 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102604882 A 20 。