表达含hCAT基因重组腺病毒载体及其重组腺病毒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102080102 A (43)申请公布日 2011.06.01 CN 102080102 A *CN102080102A* (21)申请号 201010581006.4 (22)申请日 2010.12.09 C12N 15/861(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12Q 1/30(2006.01) (71)申请人 西安交通大学 地址 710049 陕西省西安市咸宁西路 28 号 (72)发明人 王慧莲 宁启兰 吕社民 杨旭东 许楠 李爱玲 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120。

2、0 代理人 汪人和 (54) 发明名称 表达含 hCAT 基因重组腺病毒载体及其重组 腺病毒 (57) 摘要 本发明公开了含人过氧化氢酶基因重组腺病 毒载体、 重组腺病毒。是先将 hCAT 基因克隆到 pcDNA3.1+ 中， 酶切和基因测序鉴定阳性克隆 ； 再 利用酶切法把hCAT基因克隆至入门载体pENTR1A 中。利用体外重组 p ENTR1A-CAT 和 pAd/CMV/ V5-DEST， 得含人过氧化氢酶基因重组腺病毒载 体。将该重组腺病毒表达载体转染包装细胞一人 胚肾 293A 细胞得到重组腺病毒， 再利用免疫印迹 和 240nm 紫外光吸收法对重组病毒中 CAT 蛋白的 表达量和。

3、 CAT 酶的活性进行了测定。本发明为研 究人过氧化氢酶基因在基因治疗中的作用奠定了 基础， 同时为进一揭示氧化应激在一些疾病发生 发展中的作用机制和对一些疾病的基因治疗的研 究打下了坚实的基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 102080105 A1/1 页 2 1. 含人过氧化氢酶 (hCAT) 基因重组腺病毒表达载体， 其特征在于 ： 将 hCAT 基因依次 插入 pcDNA3.1+、 入门载体 pENTR1A， 再利用体外重组技术体外重组 p ENTR1A-CAT 和 pAd/。

4、 CMV/V5-DEST， 得到含 hCAT 基因的重组腺病毒表达载体。 2. 根据权利要求 1 所述的含人过氧化氢酶 (hCAT) 基因重组腺病毒表达载体， 其特征 在于 ： 在所述 hCAT 基因的 5 端含有 kozak 序列 ACCATGG， 该载体能够在真核细胞中表达 ； hCAT 基因的 3 端去掉终止密码， 含有 V5 表位标签， 使其在蛋白质表达时与 hCAT 形成融合 蛋白。 3. 根据权利要求 1 所述的含人过氧化氢酶 (hCAT) 基因重组腺病毒表达载体， 其特征 在于 ： 所述含hCAT基因的重组腺病毒表达载体是利用通路克隆系统， 使hCAT基因先插入入 门载体pENT。

5、R1A中， 利用入门载体和腺病毒pAd/CMV/V5-DEST载体的同源序列， 使其体外重 组， 得到 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 重组腺病毒表达载体。 4.根据权利要求3所述的含人过氧化氢酶(hCAT)基因重组腺病毒表达载体， 其特征在 于 ： 所述 pAd/CMV/V5-DEST-CAT 是 E1、 E3 区缺失的复制缺陷 5 型腺病毒表达载体。 5. 一种含 hCAT 基因重组腺病毒， 其特征在于 ： 该病毒是通过含 hCAT 基因重组腺病毒 表达载体转染人胚肾 293A 细胞得到的。 6. 根据权利要求 5 所述的含 hCAT 基因重组腺病毒， 其特征在于 ： 所述表达含。

6、 hCAT 基 因重组腺病毒是通过脂质体介导法转染人胚肾 293A 细胞得到的。 7. 根据权利要求 6 所述的含 hCAT 基因重组腺病毒， 其特征在于 ： 所述人胚肾 293A 细 胞提供反式补偿， 使得缺失 E1 元件的病毒可以在该细胞中复制和扩增。 8. 根据权利要求 5 所述的含 hCAT 基因重组腺病毒， 其特征在于 ： 所述含 hCAT 基因重 组腺病毒中所含的过氧化氢酶的活性测定是利用 240nm 紫外光吸收法进行的。 权 利 要 求 书 CN 102080102 A CN 102080105 A1/6 页 3 表达含 hCAT 基因重组腺病毒载体及其重组腺病毒 技术领域 00。

7、01 本发明属生物医学领域， 特别涉及含人过氧化氢酶 (hCAT) 基因重组腺病毒表达 载体 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT、 重组腺病毒及其过氧化氢酶活性的测定。 背景技术 0002 氧化应激是指机体内高活性分子如活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)产生过多或 抗氧化能力低下， 从而导致组织和细胞的损伤。越来越多的资料显示氧化应激与许多肿瘤 和自身免疫性疾病发生和发展有着密切关联性。人体内存在一类重要的抗氧化酶体系， 它 们在对抗氧化应激引起的疾病中发挥着重要的作用。过氧化氢酶 (CAT) 就是人体内一类非 常重要的抗氧化物酶， 它是人体内 H202 重要的清除剂， 主要分布在过。

8、氧化物酶体中。目前 已有许多证据表明 CAT 具有很强的抗急性氧化损伤的功能。 0003 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因， 通过一定方式导入人体细 胞， 以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用， 从而达到治疗疾病的目的。基因治疗为恶性肿 瘤、 心血管疾病、 遗传病和艾滋病等严重威胁人类健康的疾病提供了治疗的可能。 基因治疗 中常用的载体有病毒载体和非病毒载体。 病毒载体主要包括慢病毒载体、 逆转录病毒载体、 腺病毒载体等。 腺病毒载体由于其具有宿主细胞广泛、 可感染静止及分裂期细胞、 繁殖滴度 高、 性质稳定、 包装容量大及不整合等优点， 而被广泛应用的在基因治疗中， 尤其是用于体 内。

9、基因治疗研究。 由于腺病毒载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白质表达 的高效性， 使其在基因治疗的研究中受到人们的青睐， 成为当今使用最多的病毒载体之一。 从上世纪九十年代以来， 报道的 1000 多种基因治疗的临床方案中， 约 26是用腺病毒作为 基因治疗的载体。 发明内容 0004 本发明的一个目的是构建含人过氧化氢酶基因重组腺病毒表达载体， 并提供一种 表达 hCAT 的重组腺病毒， 该重组腺病毒可用于体内基因治疗方面的研究， 为因氧化应激所 引发的各种恶性肿瘤、 心血管疾病、 各种免疫缺陷性等疾病的基因治疗提供了的一种新颖 的技术。 0005 本发明所提供的含人过氧化氢酶 (。

10、hCAT) 基因重组腺病毒表达载体， 是将 hCAT 基 因依次插入pcDNA3.1+、 入门载体pENTR1A， 再利用体外重组技术体外重组p ENTR1A-CAT和 pAd/CMV/V5-DEST， 得到含 hCAT 基因的重组腺病毒表达载体。 0006 在 hCAT 基因的 5 端含有 kozak 序列 (ACCATGG)， 该载体能够在真核细胞中表达 ； hCAT 基因的 3 端去掉终止密码， 含有 V5 表位标签， 使其在蛋白质表达时与 hCAT 形成融合 蛋白。 0007 所述含 hCAT 基因的重组腺病毒表达载体是利用通路克隆系统， 使 hCAT 基因先插 入入门载体pENTR1。

11、A中， 利用入门载体和腺病毒pAd/CMV/V5-DEST载体的同源序列， 使其体 外重组， 得到 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 重组腺病毒表达载体。 说 明 书 CN 102080102 A CN 102080105 A2/6 页 4 0008 所述 pAd/CMV/V5-DEST-CAT 是 E1、 E3 区缺失的复制缺陷 5 型腺病毒表达载体。 0009 本发明的另一个目的是提供一种表达 hCAT 的重组腺病毒。 0010 本发明所提供的一种含 hCAT 基因重组腺病毒， 该病毒是通过含 hCAT 基因重组腺 病毒表达载体转染人胚肾 293A 细胞得到的。 0011 所述表达。

12、含hCAT基因重组腺病毒是通过脂质体介导法转染人胚肾293A细胞得到 的。 0012 所述人胚肾 293A 细胞提供反式补偿， 使得缺失 E1 元件的病毒可以在该细胞中复 制和扩增。 0013 所述含 hCAT 基因重组腺病毒中所含的过氧化氢酶的活性测定是利用 240nm 紫外 光吸收法进行的。 0014 本发明构建含人过氧化氢酶基因重组腺病毒表达载体， 并提供一种高表达含 hCAT 基因的重组腺病毒， 为将来进一步探究一些肿瘤和自身免疫性等疾病的发病机理， 并为这 些病的临床诊断和治疗提供一种新颖基因治疗方法。 本发明为研究人过氧化氢酶基因在基 因治疗中的作用奠定了基础， 同时为进一揭示氧化。

13、应激在一些疾病发生发展中的作用机制 和对一些疾病的基因治疗的研究打下了坚实的基础。 0015 下面结合附图对本发明做进一步详细说明 附图说明 0016 图 1 是 DNA 凝胶电泳图显示 RT-PCR 的结果。 0017 图 2 是 pcDNA3.1+ 质粒和质粒酶切后的 DNA 凝胶电泳图。 0018 图 3 是 pENTR1A-CAT 质粒经酶切后的 DNA 凝胶电泳图。 0019 图 4 是 Ad-hCAT 毒液转染 293A 细胞 7 天后的细胞形态图 (10)。 0020 图 5 是 Western blot 检测重组腺病毒转染的 293A 细胞中 CAT 的表达。 0021 图 6。

14、 是重组腺病毒 Ad-hCAT 过氧化氢酶活性测定曲线图。 具体实施方式 0022 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法， 具体步骤可参见 ： molecular cloning ： a laboratory manual 0023 所用主要试剂、 载体和菌株均购于 Invitrogen 等公司。引物合成及 DNA 序列测定 均由由北京奥科生物技术有限责任公司完成。 0024 一、 构建含人 CAT 基因重组腺病毒质粒载体 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 0025 ( 一 ). 人 CAT 全长基因片段的获得 0026 1.从人血中分离白细胞， 按RNA agent Tota。

15、l RNA isolation system试剂盒说明 书指导提取总 RNA。 0027 2. 反转录成 cDNA 反应体系包括 ： 5 逆转录 buffer 4l， 逆转录酶 (200U/ l)1l， dNTPs(10mmol)0.5l， 上游引物 0.4l， 下游引物 0.4l， DEPC 水 9.7l， RNA 模板 4l， 总体积 20l ； 反应条件 ： 37 1h， 95 3min。 0028 3. 根据 GenBank 公布的人 CAT(NM 001752) 序列设计并合成引物， 引物序列如下 ： 0029 正向引物 P1 ： 5 -AAAGGTACCGCTATGGCTGACAG。

16、CC-3包含酶切位点 Kpn 反向引物 说 明 书 CN 102080102 A CN 102080105 A3/6 页 5 P2 ： 5-TTTGATATCCAGATTTGCCTTCTCC-3包含了酶切位点EcoR V。 利用该引物扩增时， 能 够使 hCAT 基因的 5 端含有 kozak 序列 (ACCATGG)， 使得该载体能够在真核细胞中表达， 同 时在 hCAT 基因的 3 端去掉终止密码， 使得 hCAT 基因与 V5 表位标签基因融合， 使其在蛋白 质表达时形成融合蛋白。 0030 4.hCAT基因片段的获得 ： 以上述第2步获得的cDNA产物为模板， P1和P2为引物扩 增 。

17、hCAT 全长基因片段。反应体系包括 ： 5 定量 PCR buffer 10l， Taq 酶 (3U/l)1l， hCAT 上游引物 1.0l， 下游引物 1.0l， dNTP1l， 灭菌水 30l， cDNA 模板 5l， 总体积 50l ； 加入不同反应管中， 在 PCR 仪进行扩增 ； 反应条件 ： 94 3min ； 94 45s， 56 30s， 7290s， 35个循环 ； 725min。 结果图1显示所扩增出片段大小与预期1585bp大小相符。 0031 ( 二 ). 含目的基因 hCAT 的 pcDNA3.1+-hCAT 的构建 0032 1.酶切CAT基因片段和pCDNA3。

18、.1+空载体， 反应体系(CAT基因片段/pcDNA3.1+载 体各15g， 10K buffer5l， 3l Kpn I， 3l EcoR V， 10l 10BSA， 适量水dd H2O， 总体积 100l。 0033 2. 胶回收酶切过的目的片段和空载体 0034 3.用T4DNA连接酶连接酶切过的目的片段和空载体， 用连接液转化DH5a感受态细 胞 0035 4.在含100ug/l氨苄青霉素的LB琼脂糖平板中筛选克隆， 挑取单克隆克隆后酶 切鉴定。 0036 结果如图 2 所示 pcDNA3.1+-CAT 阳性质粒经 Kpn I 和 EcoR V 双酶切后， 释放出 1586bp目的基因。

19、片段和5385bp的空载体片段， 可以确定目的基因已经连接到该载体上。 送 出测序， 序列正确。 0037 下面通过通路克隆系统， 使 hCAT 基因先插入入门载体 pENTR1A 中， 利用入门载体 和腺病毒 pAd/CMV/V5-DEST 载体的同源序列， 使其体外重组， 得到 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 重组腺病毒表达载体。具体实施过程如下 ： 0038 ( 三 ). 含目的基因 hCAT 的入门载体 pENTR 1A-hCAT 的构建 0039 1. 用 Kpn I 和 EcoR V 同时消化 pcDNA3.1+-hCAT 和入门空载体 pENTR 1A。 0040 2.。

20、胶回收从pcDNA3.1+-hCAT酶切释放出的序列正确的-hCAT基因片段， 及酶切过 的入门空载体 pENTR 1A。 0041 3. 用 T4DNA 连接酶连接 hCAT 基因片段和空载体 pENTR 1A， 用连接液转化 DH5a 感 受态细胞。 0042 4.在含50ug/l卡那霉素的LB琼脂糖平板中筛选挑取单克隆， 提取质粒， 分别用 Kpn I 和 EcoR V 与 EcoR V 和 SalI 两对酶对待鉴定的质粒进行酶切鉴定。 0043 结果如图 3 显示 ： pENTR1A-CAT 阳性质粒经 Kpn I 和 EcoR V 双酶切后释放出 1586bp 目的基因片段和 225。

21、3bp 的空载体片段， 说明目的基因成功地连接到入门载体上 ； pENTR1A-CAT 阳性质粒经 Sal1 和 EcoR V 双酶切后， Sal1 的酶切位点在载体上， 而 EcoR V 位点是目的基因连接位点， pENTR1A-CAT 阳性质粒经 Kpn I 和 EcoR V 双酶切所释放出片段 大小与经Sal1和EcoR V双酶切释放的片段之差十几个碱基， 电泳结果几乎相同， 显示目的 基因插入的方向是正确的。即得到载体 pENTR 1A-hCAT。 0044 ( 四 ). 含 hCAT 基因重组腺病毒载体 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 的构建 说 明 书 CN 102080。

22、102 A CN 102080105 A4/6 页 6 0045 本实施例所用的腺病毒的空载体 pAd/CMV/V5-DEST 是 E1、 E3 区缺失的复制缺陷 5 型腺病毒表达载体。 0046 1. 按照体外重组试剂盒 LR clonase II Enzyme mix 实验指导， 对含目的基因的 载体 pENTR 1A-hCAT 和腺病毒空载体 pAd/CMV/V5-DEST 进行体外同源重组实验， 反应体系 (150ng pENTR 1A-hCAT， 300ngpAd/CMV/V5-DEST， 4l TE buffer pH8.0， 2l LR Clonase II enzyme mix。

23、)， 25孵育 18 小时。 0047 2. 用上述反应液全部转化 TOP10 感受态细胞。 0048 3. 阳性克隆的筛选和鉴定 ： 在含 100ug/l 氨苄青霉素的 LB 琼脂糖平板上随机 挑取克隆， 然后在含100ug/l氨苄青霉素的SOC培养基中增殖细菌， 后接种到含氯霉素的 琼脂糖平板中， 二次筛选， 选出的阳性克隆， 经 DNA 序列测定， 确定 hCAT 全长基因以正确的 序列， 整合到腺病毒 pAd/CMV/V5-DEST 的正确位置中， 从而得到含 hCAT 基因重组腺病毒载 体 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT。 0049 二、 脂质体介导重组腺病毒质粒 pAd/。

24、CMV/V5-DEST-hCAT 转染人胚肾 293A 细胞进 行病毒包装、 扩增和滴度测定 0050 本实施例中通过人胚肾 293A 细胞提供反式补偿， 使得腺病毒的空载体 pAd/CMV/ V5-DEST 所缺失 E1 元件的病毒可以在该细胞中复制和扩增。 0051 ( 一 )、 脂质体介导重组腺病毒质粒 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 转染人胚肾 293A 细胞 进行病毒包装 0052 1.转染前一天， 用胰酶消化293A细胞， 并对其进行细胞计数， 然后把细胞种入6孔 板中， 每孔种 5105个细胞， 加入 2ml 含 10胎牛血清的完全培养基 ； 0053 2.转染当天， 。

25、移去旧培养基， 加入1.5ml新鲜的含10胎牛血清的完全培养基， 并 准备 DNA 和脂质体的混合物 ； 0054 3.取1ug线性化的pAd/CMV/V5-DEST-hCAT/pAd/CMV/V5-LacZ， 用不含血清的培养 基稀释到 250l， 轻轻混匀， 备用 ； 0055 4. 取 3l 脂质体 2000， 与 247l 的不含血清的培养基轻轻混匀， 室温下孵育 5 分钟， 备用 ； 0056 5. 稀释好的 DNA 和脂质体轻轻混匀， 然后瞬时离心， 室温下温育 20 分钟 ； 0057 把 DNA 和脂质体的混合物加入到 6 孔板中， 十字轻轻晃动， 注意不要破坏单层细 胞， 然。

26、后放入到 37， 5 CO2的细胞培养箱中， 孵育过夜 ； 0058 6. 转染第二天早上， 换新鲜的含 10胎牛血清的完全培养基进行培养 ； 0059 7. 转染 48 小时后胰酶消化转移到 100mm 培养皿中培养 ； 0060 8.6-10 天后细胞出现病变 (cytopathic effect， CPE)， 即细胞开始聚集并且从平 皿上脱落， 结果如图 4 所示。 0061 9. 把培养液和细胞收集在 15cm 无菌离心管中， -80和 37之间反复冻融两次， 3000rpm 离心 15min， 去除细胞碎片， 将包装好的腺病毒液进行分装， 冻存于 -80备用。 0062 ( 二 ).。

27、 第一代腺病毒感染滴度测定 (TCID50 法 ) 0063 收集 293A 细胞， 用含 2胎牛血清的高糖 DMEM 培养液稀释细胞， 使其浓度为 1X105/mL， 取两个 96 孔板， 每孔分别加入 100ul 细胞悬液， 置 37， 5 CO2培养箱中培养 24h， 取 Ad-hCAT 毒液 100ul 稀释于 990ul 的培养液 (2胎牛血清的 DMEM) 中 (102倍稀释 )， 说 明 书 CN 102080102 A CN 102080105 A5/6 页 7 混均后， 取 200ul 稀释于 1.8mL 培养液中 (103倍稀释 )， 如此进行系列稀释， 直至 1010倍稀。

28、 释。向 96 孔板每排前 10 个孔加入 100ul 稀释好的病毒液， A 排 -G 排孔的病毒稀释度依 次为 103， 104， 105-1010 倍。每排孔的病毒稀释倍数相同。向各排孔加入毒液时， 要从高稀 释倍数开始， 余孔加 100ul 培养液作阴性对照。将 2 各 96 孔板置 37， 5 CO2培养箱中 培养 10 天。10 天后， 在显微镜下计数每排发生 CPE 孔数的比例， 带入公式 ： T 101+d(s-0.5) TCID50/mL(T 滴度， D Log 稀释倍数， s 阳性比例的总和 )， 将 TCID50/mL 转化为 PFU/mL 的公式为 ： TCID50/mL。

29、 1X10-0.7PFU/mL。最后测得收获的重组腺病毒 Ad-hCAT 的滴度为 l 即 6.3107pfu/ml. 0064 ( 三 )、 重组腺病毒的扩增 0065 1.转染前一天， 在75mm2培养瓶中加入10ml 5DMEM低糖培养基含3106个293 细胞。 0066 2. 取 0.5ml 首次扩增的病毒保存液， 加入 DMEM5至 1ml， 混匀， 这样稀释得到的 MOI 值为 5。 0067 3. 移去培养液， 小心加入病毒混合液， 切勿破坏细胞单层， 十字形慢慢晃动 3 次， 37 CO2孵箱中培养 90 分钟。 0068 4. 加入 9ml DMEM5， 再培养 48 小时。

30、， 这时在 10ml 溶液中大有 5109 51010 个病毒颗粒， 0069 5. 收集培养液和细胞于 15cm 无菌离心管中， -80和 37反复冻融 3 次。 0070 6. 台式离心机上 3000rpm 离心 10 分钟， 收集上清冻存于 -80备用。 0071 三、 测定重组腺病毒 Ad-hCAT 过氧化氢酶的活性及表达情况 0072 含 hCAT 基因重组腺病毒中所含的过氧化氢酶的活性测定是利用 240nm 紫外光吸 收法进行的， 具体过程如下 ： 0073 ( 一 ). 测定重组腺病毒 Ad-hCAT 过氧化氢酶的活性 0074 在 100mm 培养皿中种 5105个 293A 。

31、细胞， 用 100l 的病毒液感染细胞， 24h 后 收集细胞， PBS 洗 2 次。500l PBS 重悬。冰上用 100功率超声破碎细胞 15min， 得三组 细胞裂解液即 ： 正常对照组细胞裂解液、 pAd/CMV/V5-LacZ 感染组细胞裂解液和 pAd/CMV/ V5-DEST-CAT 感染组细胞裂解液。每组取 3 个 5ml 的试管， 标记为 S1， S2(S1 和 S2 是两个 平行的实验组)和S0， 分别加入的成分为S1(0.2ml细胞裂解液， 1.5mlpH7.8磷酸， 1.0ml蒸 馏水 )， S2(0.2ml 细胞裂解液， 1.5mlpH7.8 磷酸， 1.0ml 蒸馏。

32、水 )， S0(0.2ml 煮沸细胞裂解 液， 1.5ml pH7.8 磷酸， 1.0ml 蒸馏水 )， 每加一管立刻计时， 并迅速倒入到石英比色皿中， 在 紫外分光光度计上测定各试管在 240nm 下的光吸收值， 每隔 1min 读数 1 次， 共测 4min。重 复测定 3 次。最后依据公式 A240 AS0-(AS1+AS2)/2 的值， 绘制曲线用以比较不同方式 处理的试管中 CAT 活性的大小， 利用 t-test 检验测试组和对照组数据之间的显著性差异。 0075 结果如图 6 所示。图 6 中 A 曲线代表用 pAd/CMV/V5-DEST-CAT 病毒感染 293A 细 胞 2。

33、4 小时， 其细胞蛋白提取液在 1 至 4 分钟反应中过氧化氢酶活性的变化 ； B 曲线代表用 pAd/CMV/V5-LacZ感染293A细胞24小时， 其细胞蛋白提取液在1至4分钟反应中过氧化氢 酶活性的变化 ； C 曲线代表用 PBS 感染 293A 细胞 24 小时， 其细胞蛋白提取液在 1 至 4 分钟 反应中过氧化氢酶活性的变化。 0076 其中 B 和 C 曲线显示， 随反应时间的延长 A240 值均趋于不变， 且 B 和 C 两组之 说 明 书 CN 102080102 A CN 102080105 A6/6 页 8 间 CAT 酶活性没有显著性差异 (p 0.05)， 其 CA。

34、T 酶的活性只是细胞本身具有的该酶的活 性。而 A 曲线显示 A240 值随反应时间的延长而增加， 且 A 与 C 两组之间 CAT 酶活性具有 显著性差异(p0.001， p0.05)， 说明被Ad-CAT重组腺病毒感染的293A细胞裂解液中， 含有较强的 CAT 酶的活性， 而活性增高显然来自于被 Ad-CAT 重组腺病毒感染过 293A 细胞 中， CAT 基因在蛋白质水平上的高表达。 0077 ( 二 )、 Western blotting 鉴定蛋白水平 hCAT 的表达 0078 用 RIPA 蛋白提取试剂盒提取经重组腺病毒 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 感染 293A 。

35、细 胞的蛋白， 用BCA法定量蛋白， 进行免疫印迹实验。 即以10的SDS聚丙稀酰胺凝胶分离蛋 白质， 再将蛋白转移到polyscreen PVDF膜上， 将PVDF膜浸在含0.1Tween-20的PBS(简 称 TBS 液 ) 中 1h。然后将膜放入初级抗体溶液中， 在 4下过夜孵育 ； 将膜用 TBS 液洗两次 后， 再在二级抗体液中培养 1.5h 后， 用 TBS 洗 3 次。用 ECL 检测试剂盒检测 CAT 蛋白条带 的免疫强度， 并用 ChemiImager 成像系统采集实验结果所得的图象， 再用相关的软件对图 象中的免疫强度进行分析。结果如图 5 所示 ： 道 1 ： pAd/C。

36、MV/V5-DEST-CAT 感染 24 小时的 细胞蛋白提取液， 道 2 ： pAd/CMV/V5-LacZ 感染 24 小时的细胞蛋白提取液， 道 3 ： PBS 感染 24 小时的细胞蛋白提取液。与道 2 和 3 中所显示的 hCAT 蛋白免疫强度相比较， 道 1 即用含目 的基因 CAT 的 pAd/CMV/V5-DEST-hCAT 病毒感染 293A 细胞后， 其 hCAT 蛋白在该细胞中得到 了高水平的表达。 说 明 书 CN 102080102 A CN 102080105 A1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102080102 A CN 102080105 A2/2 页 10 图 6 说 明 书 附 图 CN 102080102 A 。