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1、(10)申请公布号 CN 102586437 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586437 A *CN102586437A* (21)申请号 201210044102.4 (22)申请日 2012.02.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/577(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 复旦大学附属妇产科医院 地址 200011 上海市黄浦区方斜路 419 号 (72)发明人 徐丛剑 张志刚 俞。
2、弋 李军 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 CCDC72基因及其表达产物在制备诊断及治疗 卵巢癌制剂中的应用 (57) 摘要 本发明属分子生物学特别是基因诊断领域， 提供一种新的卵巢癌诊断标志物和药物治疗靶 点， 具体涉及 CCDC72 基因及其表达产物作为肿瘤 标志物和药物疗靶点以及基于 CCDC72 及其表达 产物的应用。 该应用比现有技术检测省时、 灵敏度 与准确度更高、 成本更低、 和/或更高效。 另外， 本 发明还提供了用于这些应用的试剂盒以及引物对 等。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页。
3、 说明书 6 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 8 页 1/1 页 2 1.CCDC72 基因及其表达产物在制备诊断卵巢癌制剂中的应用。 2.CCDC72 基因及其表达产物在制备治疗卵巢癌制剂中的应用。 3.CCDC72 基因及其表达产物在制备筛选治疗卵巢癌药物中的应用。 4. 用于检测 CCDC72 基因及其表达产物的试剂盒， 其包括基于 CCDC72 基因序列的特异 性探针与引物对。 5.权利要求3所述的试剂盒， 其还包括纯化的兔抗人CCDC72单克隆抗体加生物素标记 的羊抗兔二抗， 加链亲和素标记的辣根。
4、过氧化物酶与底物 3， 3， - 二氨基联苯胺。 6. 一种检测肿瘤标志物的方法， 所述标志物为 CCDC72 基因， 其包括 ： 1) 采用免疫组织化学方法检测 CCDC72 基因在离体的肿瘤组织中的表达 ； 2) 检测不同组织学来源的肿瘤细胞系中 CCDC72 mRNA 水平 ； 3) 采用 RNA 干扰技术检测 CCDC72 对肿瘤细胞凋亡的影响 ； 4) 检测 CCDC72 对肿瘤细胞周期的影响 ； 5) 检测 CCDC72 对肿瘤细胞增殖能力的影响 ； 6) 检测 CCDC72 对肿瘤细胞信号转导通路的影响。 7. 按权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述的肿瘤是卵巢癌。 权。
5、 利 要 求 书 CN 102586437 A 2 1/6 页 3 CCDC72 基因及其表达产物在制备诊断及治疗卵巢癌制剂 中的应用 技术领域 0001 本发明属分子生物学特别是基因诊断领域， 具体涉及一种新的肿瘤相关抗原 CCDC72 基因及其表达产物和在制备诊断和治疗卵巢癌制剂中的应用。 背景技术 0002 研究显示， 在女性生殖器官的恶性肿瘤中， 卵巢癌其发病率居第三位， 病死率居于 首位。卵巢癌是一种形态学和生物学上均具有异质性的疾病， 其分型繁多， 同时其发生发 展及转移是一个涉及多基因、 多信号通路调控的网络体系。据报道， 目前全世界每年约有 二十万以上的妇女饱受卵巢癌折磨。尽管。
6、已有很多研究表明， 不同亚型的卵巢癌分子机制 分析差异明显， 但目前临床上仍将不同亚型的卵巢癌作为一个单一的整体诊断和治疗， 这 无疑会降低诊断的敏感性和治疗的有效性。 临床实践显示， 卵巢癌患者普遍存在复发率高、 5年生存率低的状况， 而该疾患起病隐匿且缺乏有效准确的诊断标志物是重要影响因素。 目 前临床上诊断卵巢癌的三种主要的传统的检查方法， 即 ： 结合临床表现进行盆腔检查、 经阴 道超声检查、 血清检测 CA125 水平各具优势， 但均存在局限性和缺陷。免疫组化染色诊断成 为重要的辅助诊断方法。因此， 迫切需要寻找一种能够早期诊断卵巢癌的标志物及有效的 靶向治疗方法。 0003 现有技。
7、术公开了CCDC72(coiled-coil domain containing-72)基因， 最初是从体 外凝集性生长状态下的毛乳头细胞 (DPC) 中筛选并克隆出的一种造血干细胞分化相关基 因， 其产物为 7.06kKD 小分子可溶性蛋白。该基因在人体多种组织器官中表达， 特别是一些 新陈代谢旺盛的组织， 如皮肤、 肿瘤、 淋巴组织等。 这种分布特征提示， 该基因可能与细胞增 殖、 分化有关。 0004 目前， 有关 CCDC72 的研究极少， 其生物学功能不甚明确。迄今为止， 仅有研究显 示， RNA 干扰技术使 CCDC72 基因在毛乳头细胞 (DPC) 中的表达减弱或消失后， DPC。
8、 生长速度 明显减慢， 细胞失去凝集性生长特性， CCDC72 重组蛋白可促进 DPC 的增殖及 DNA 合成。尚 未见有关 CCDC72 基因在上皮性卵巢癌中的表达和功能的报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种新的卵巢癌诊断标志物和药物治疗靶点， 具体涉及 CCDC72 基因及其表达产物作为肿瘤标志物和药物疗靶点以及基于 CCDC72 及其表达产物的 应用。该应用比现有技术检测省时、 灵敏度与准确度更高、 成本更低、 和 / 或更高效。 0006 另外， 本发明还提供了用于这些应用的试剂盒以及引物对等。 0007 具体而言， 在第一方面， 本发明提供了 CCDC72 基因及其表达。
9、产物可作为肿瘤标志 物和药物治疗靶点。 0008 本发明中 ： 0009 1， 采用免疫组织化学方法检测 CCDC72 在卵巢组织中的表达， 结果显示 ： CCDC72 的 说 明 书 CN 102586437 A 3 2/6 页 4 表达与卵巢组织的恶性程度有关， 恶性程度越高， CCDC72 表达越高 ； CCDC72 的表达与不同 卵巢癌的组织学分型有关， CCDC72 在黏液性腺癌中的阳性表达率为 42.4 (14/33)， 明显 低于浆液性腺癌的阳性表达率 96.4 (106/110) 和子宫内膜样腺癌的阳性表达率 88.9 (56/63)， 差异具有统计学意义 (P 0.001)。。
10、 0010 2， 检测不同组织学来源的卵巢癌细胞系中 CCDC72 mRNA 水平， 结果显示， CCDC72 在不同的细胞系中表达具有差异性， 其中浆液性腺癌细胞系普遍高表达 CCDC72， 尤其是 SKOV3ip 细胞系。 0011 3， 采用 RNA 干扰技术检测 CCDC72 对卵巢癌细胞凋亡的影响， 结果显示， 与阴性对 照组 (NC) 相比， siRNA-1、 siRNA-2 分别转染 SKOV3ip 及 OVCA433 细胞 48h， 干扰效率均可达 到50及以上， SKOV3ip细胞系的干扰效果优于OVCA433细胞 ； 采用Annexin V-FITC/PI染 色细胞流式方法。
11、检测 CCDC72 基因对细胞凋亡的作用， 结果证实， siRNA-1 组与 siRNA-2 组 细胞凋亡率均明显升高， 差异具有统计学意义。 0012 4，检 测 CCDC72 对 卵 巢 癌 细 胞 周 期 的 影 响，结 果 显 示，与 NC 组 相 比， CCDC72siRNA-1、 siRNA-2 组的细胞数在 G0/G1、 S 期增多， G2/M 期降低， 结果表明， 干扰 CCDC72 基因后会诱导 SKOV3ip 细胞阻滞在 G0/G1、 S 期， 促进细胞凋亡。 0013 5， 检测CCDC72对卵巢癌细胞增殖能力的影响， 结果表明， 干扰CCDC72基因在卵巢 癌细胞中的表。
12、达可以抑制卵巢癌细胞的生长。 0014 6， 检测 CCDC72 对卵巢癌细胞信号转导通路的影响， 结果显示， 干扰组与对照组 相比， Src 的表达无明显改变， 但磷酸化的 Src 表达明显减弱 ； 24h 后对照组、 干扰组出现 p-Src 的变化， 而 48h 后则无明显改变， FAK/p-FAK、 Akt/p-Akt、 Erk1/2/p-Erk1/2 的变化与 Src/p-Src 相似。 0015 本发明的试验结果表明， CCDC72 在卵巢癌中高表达且在不同组织学类型的卵巢癌 中表达不同， CCDC72 可作为具有较高灵敏度与准确度的肿瘤诊断标志物， 有效地提高不同 亚型卵巢癌的诊断。
13、水平。 0016 在第二方面， 本发明提供了用于免疫检测用的 CCDC72 检测试剂盒、 基因诊断用的 荧光定量 PCR 试剂盒， 和其他类型的诊断试剂或方法用于肿瘤、 基因检测或细胞学研究， 如 分子生物学试剂 ： RT-PCR、 生物芯片等 ； 基于 CCDC72 的单克隆或多克隆抗体的试剂与方法 ： ELISA、 流式细胞计数、 Western-Blot 等。所述试剂盒中， 其包括基于 CCDC72 基因序列的特 异性探针与引物对。试剂盒中各成分都是分离放置的。 0017 所述的的试剂盒还可以包含纯化的兔抗人 CCDC72 单克隆抗体加生物素标记的羊 抗兔二抗， 加链亲和素标记的辣根过氧。
14、化物酶与底物 3， 3， - 二氨基联苯胺 (DAB) 等成分。 0018 本发明第三方面基于上述基因功能实验结果， CCDC72 具有促进细胞增殖、 抑制细 胞凋亡的作用， 表明CCDC72可以作为卵巢癌治疗的新的靶标， 基于此， 进一步构建RNA干扰 系统， 或作为肿瘤药物筛选的靶分子制备药物， 或构建针对该基因的基因表达调控系统等 用于治疗卵巢癌。 0019 本发明经实验证实， CCDC72 基因可以有效地促进卵巢癌细胞增殖、 抑制癌细胞凋 亡， 可作为一种有效的诊断标志物及治疗的靶标基因。具体的， CCDC72 基因可作为卵巢癌 及其不同组织学亚型诊断的标志基因， 包括各种免疫组化诊断。
15、方法， 原位杂交， RT-PCR， 病 理诊断及早期诊断方面的应用 ； CCDC72 基因可作为卵巢癌癌基因治疗及药物筛选靶标的 说 明 书 CN 102586437 A 4 3/6 页 5 应用。本发明用于诊断具有特异性高， 检测准确性高的优点 ； 用于肿瘤药物筛选靶分子， 具 有靶标明确的优点。 0020 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和具体实施方式对本发明进行详细地描 述。需要特别指出的是， 这些描述仅仅是示例性的描述， 并不构成对本发明范围的限制。 附图说明 0021 图 1 显示了 CCDC72 在不同类型卵巢组织中的表达情况， 其中， 0022 图1A ： 免疫组织化学方法检。
16、测CCDC72在不同卵巢肿瘤中的表达 ； 图1B ： CCDC72在 卵巢癌中高表达， 在不同亚型的卵巢癌中红表达不同 ； 图1C ： 将265例不同卵巢组织分别按 照年龄、 手术病例分期、 病理分级、 良恶性肿瘤及恶性肿瘤的不同组织学亚型分类， 进行统 计学分析， 列表。 0023 图 2 显示了 CCDC72 在八株不同组织学亚型来源的卵巢癌细胞系中 mRNA 的表达情 况， 0024 其中， 细胞从左到右依次是 ： 浆液性 (SKOV3ip、 SKOV3、 OVCA433、 OVCA439)， 黏液性 (RMUG-S， 3AO)， 子宫内膜样 (TOV112D)， 透明细胞性 (ES2)。
17、。CCDC72 在浆液性腺癌细胞系表 达普遍偏高， 尤其是 SKOV3ip 细胞 0025 图 3 显示了 CCDC72 对卵巢癌细胞凋亡的作用， 0026 其中， 图 3A ： 在 SKOV3ip 和 OVCA433 细胞中， 与 NC 相比， siRNA 有效的干扰了 CCDC72 的表达 ； 图 3B ： 对 3A 的柱形图和统计分析 ； 图 3C ： Annexin V/PI 细胞流式凋亡实验 证实， 与 NC 相比， CCDC72-siRNA 促进了细胞的凋亡。 0027 图 4 显示了 CCDC72 对卵巢癌细胞的细胞周期分布的影响， 0028 其中， 包括细胞流式仪对三组实验组的。
18、细胞周期分期的分析， 及数据柱形图和统 计分析。 0029 图 5 显示了 CCDC72 对卵巢癌细胞增殖能力的作用， 0030 其中， 经 CCK8 实验测定， SKOV3ip 和 OVCA433 细胞的 CCDC72 siRNA 组与 NC 组相 比， 24h， 48h， 72h， 96h 后， 生长速率均明显降低。 0031 图 6 显示了 CCDC72 对细胞信号转导通路的影响， 0032 其 中， Western-blotting 法 测 定， siRNA 组 相 比 NC 组， p-Fak、 p-Src、 p-Akt、 p-Erk1/2 表达均减弱， 且 24h 即出现变化。 具体。
19、实施方式 0033 本发明将通过具体的实施例来进行示例性的说明， 其中， 如有未尽之处， 可参见 分子克隆实验指南 ( 第三版 ) ( 科学出版社， 北京 ) 等实验手册以及市售的试剂和仪器的 使用说明。 0034 本发明所述的 CCDC72 基因序列为根据 Genbank 登录号 NM015933.3 所示的序列。 0035 本发明所述的细胞系均为本领域公知渠道市购。 0036 实施例 1 0037 1) 检测 CCDC72 在卵巢组织中的表达情况 0038 收集离体的卵巢组织 265 例， 其中， 包括 24 例正常卵巢组织和 241 例卵巢肿瘤 说 明 书 CN 102586437 A 。
20、5 4/6 页 6 组织 (110 例浆液性腺癌， 33 例黏液性腺癌， 63 例子宫内膜样腺癌， 5 例移行细胞癌， 22 例 良性肿瘤， 8 例交界性上皮性肿瘤 )， 采用免疫组织化学方法检测 CCDC72 的表达， 结果显 示 ： CCDC72 的表达与卵巢组织的恶性程度有关， 恶性程度越高， CCDC72 表达越高 ； CCDC72 的表达与不同卵巢癌的组织学分型有关， CCDC72 在黏液性腺癌中的阳性表达率为 42.4 (14/33)， 明显低于浆液性腺癌的阳性表达率 96.4 (106/110) 和子宫内膜样腺癌的阳性 表达率 88.9 (56/63)， 差异具有统计学意义 (P。
21、 0.001)。 0039 2) 检测 CCDC72 在卵巢癌细胞中的表达 ： 0040 检测不同组织学来源的卵巢癌细胞系中 CCDC72 mRNA 水平， 其中 ： 浆液性 ： SKOV3ip， SKOV3， OVCA439， OVCA433 ； 黏液性 ： RMUG-S， 3AO ； 子宫内膜样 ： TOV112D ； 透明细胞 ： ES2， 结果显示， CCDC72 在不同的细胞系中表达具有差异性， 其中浆液性腺癌细胞系普遍高 表达 CCDC72， 尤其是 SKOV3ip 细胞系。 0041 3) 检测 CCDC72 对卵巢癌细胞凋亡的影响 ： 0042 采用目前常用的基因功能研究方法的。
22、 RNA 干扰技术， 通过 siRNA 干扰高表达 CCDC72 的细胞系 SKOV3ip 和 OVCA433， 用 Negative-control、 siRNA-1、 siRNA-2 分别转染 SKOV3ip和OVCA433， 24h、 48h、 72h后， 定量real-time PCR检测干扰效果， 结果显示， 与阴性 对照组 (NC) 相比， siRNA-1、 siRNA-2 分别转染 SKOV3ip 及 OVCA433 细胞 48h， 干扰效率均 可达到 50及以上， SKOV3ip 细胞系的干扰效果优于 OVCA433 细胞 ； 进一步采用了 Annexin V-FITC/PI 。
23、染色细胞流式方法检测 CCDC72 基因对细胞凋亡的作用， 结果证实， 与 NC 相比， siRNA-1 组与 siRNA-2 组细胞凋亡率均明显升高， 差异具有统计学意义。 0043 4) 检测 CCDC72 对卵巢癌细胞周期的影响 ： 0044 用 negative-control RNA、 CCDC72 siRNA-1、 CCDC72 siRNA-2 转染 SKOV3ip 细胞 48h 小时后， 收集细胞流式分析， 结果显示， 与 NC 组相比， CCDC72 siRNA-1、 siRNA-2 组的细 胞数在 G0/G1、 S 期增多， G2/M 期降低， 结果表明， 干扰 CCDC72。
24、 基因后会诱导 SKOV3ip 细胞 阻滞在 G0/G1、 S 期， 促进细胞凋亡。 0045 5) 检测 CCDC72 对卵巢癌细胞增殖能力的影响 ： 0046 分 别 将 negative control-siRNA， CCDC72 siRNA-1， CCDC72 siRNA-2 转 染 入 SKOV3ip 和 OVCA433 细胞系， 接种于 96 孔板， 5000 细胞 / 孔， 分别培养 24h、 48h、 72h、 96h 后， 用 CCK8 法检测细胞生长速率， 结果显示， 在 SKOV3ip 细胞系中， 阴性对照组的细胞生长 速率随着时间的延长不断增加， 而 siRNA-1 组。
25、的细胞数在 24h、 48h、 72h 中不断降低， 96h 升 高， siRNA-2 组的细胞数变化趋势与 1 组相似 ； 在 OVCA433 细胞系中， 三组实验组的细胞数 均随着时间的延长而不断增加， 但两组 CCDC72 干扰组细胞增长速率低于阴性对照组， 结果 表明， 干扰 CCDC72 基因在卵巢癌细胞中的表达可以抑制卵巢癌细胞的生长。 0047 6) 检测 CCDC72 对卵巢癌细胞信号转导通路的影响 0048 western-blotting 检测 SKOV3ip 细胞三个实验组 negative-control siRNA、 CCDC72 siRNA-1、 CCDC72 si。
26、RNA-2 转染 24h、 48h 后 FAK、 Src、 Akt、 Erk1/2 的蛋白表达， 结果 显示， 两组干扰组与 NC 组相比， Src 的表达无明显改变， 但磷酸化的 Src 表达明显减弱 ； 24h 后 NC 组、 siRNA-1 组、 siRNA-2 组即出现 p-Src 的变化， 而 48h 后则无明显改变， FAK/p-FAK、 Akt/p-Akt、 Erk1/2/p-Erk1/2 的变化与 Src/p-Src 相似。 0049 试验结果表明， CCDC72 在卵巢癌中高表达且在不同组织学类型的卵巢癌中表达 说 明 书 CN 102586437 A 6 5/6 页 7 不。
27、同， CCDC72 可作为具有较高灵敏度与准确度的肿瘤诊断标志物， CCDC72 具有促进细胞增 殖、 抑制细胞凋亡的作用， 表明 CCDC72 可以作为卵巢癌治疗的新的靶标。 0050 实施例 2 制备 CCDC72 检测试剂盒 0051 按常规方法制备 CCDC72 检测试剂盒， 其中采用纯化的兔抗人 CCDC72 单克隆抗体 加生物素标记的羊抗兔二抗， 再通过加链亲和素标记的辣根过氧化物酶与底物 3， 3， - 二氨 基联苯胺 (DAB) 的显色反应可来鉴别诊断不同病理类型的卵巢癌及不同组织学亚型的卵 巢癌。 0052 实施例 3 制备诊断 CCDC72 用的荧光定量 PCR 试剂盒 0。
28、053 根据 CCDC72 核苷酸序列设计特异性探针， 核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR 扩增法、 重组法或人工合成的方法获得 ； 其中对于 PCR 扩增法， 根据公开的有关核苷酸 序列， 尤其是开放阅读框序列来设计引物， 用 cDNA 库作为模板， 扩增而得有关序列 ； 重组法 中， 用来大批量地获得有关序列， 将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖 后的宿主细胞中分离得到有关序列 ； 核酸探针与扩增的标记序列接触， 该探针优选连接到 一种发色团， 但可被放射标记， 探针也可连接到一种结合伴侣上， 如抗体或生物素， 或另一 种携带可检测结构域的结合伴侣上。 0054 。
29、设计及合成表达 siRNA(small interfering RNA) 的化学片段 ： 0055 化学合成 siRNA 干扰目的基因 ： 0056 选择 CCDC72 的特定序列， 分别设计 0057 negative-control RNA ： sense-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT， 0058 antisense-ACGUGACACGUUCGGAGAATT ； 0059 CCDC72 siRNA-1 ： sense-CCUUGGCCACAGGUGGAAUTT ； 0060 antisense-AUUCCACCUGUGGCCAAGGTT ； 0061 CCDC72 siRN。
30、A-2 ： sense-CCCUUUAUUUCAUCUGUAUTT ； 0062 antisense-AUACAGAUGAAAUAAAGGGTT. 0063 用Negative-control RNA、 CCDC72 siRNA-1、 CCDC72 siRNA-2分别转染SKOV3ip和 OVCA433 细胞 24h、 48h、 72h 后， 定量 real-time PCR 检测 CCDC72 mRNA 表达。结果显示， 在 SKOV3ip细胞中， 与阴性对照(NC)相比， siRNA-1分别降低73.1、 76.2、 76.4的CCDC72 mRNA 表达 ； siRNA-2 分别降低 4。
31、1、 46.2、 54.5的 CCDC72 mRNA 表达 ； 在 OVCA433 细胞 中， 与 NC 相比， siRNA-1 分别降低 26.6、 55.2、 43.9的 CCDC72 mRNA 表达 ； siRNA-2 分 别降低 46.2、 65.6、 47.8的 CCDC72 mRNA 表达 ； 结果表明， CCDC72 siRNA-1、 CCDC72 siRNA-2 分别转染 SKOV3ip 及 OVCA433 细胞干扰效率均可达到 50及以上。 0064 实施例 4 0065 采用CCDC72检测试剂盒对265例样本进行免疫组化染色， 用纯化的兔抗人CCDC72 单克隆抗体加生物。
32、素标记的羊抗兔二抗， 再通过加链亲和素标记的辣根过氧化物酶与底物 3， 3， -二氨基联苯胺(DAB)的显色反应。 免疫组化染色结果分析显示， CCDC72在正常卵巢组 织、 良性卵巢肿瘤、 交界性上皮性卵巢肿瘤、 恶性上皮性卵巢癌中的阳性表达率逐渐升高， 且在不同组织学亚型的上皮性卵巢癌中表达具有差异性， 浆液性腺癌中表达最高 ； CCDC72 在上皮和间质的表达呈现出规律的负性相关 0066 实施例 5 说 明 书 CN 102586437 A 7 6/6 页 8 0067 采用诊断 CCDC72 用的荧光定量 PCR 试剂盒检测八种不同组织学来源的卵巢癌 细胞系 ( 浆液性 ： SKOV。
33、3ip， SKOV3， OVCA439， OVCA433 ； 黏液性 ： RMUG-S， 3AO ； 子宫内膜样 ： TOV112D ； 透明细胞 ： ES2)中CCDC72 mRNA水平， 结果显示， CCDC72在八种卵巢癌细胞系中均 有不同程度的表达， 经 18S 内参标准化后， CCDC72mRNA 的相对表达量在 SKOV3ip(7.53) 中 最高， 其次分别为 SKOV3(2.2)、 ES2(2.0)、 OVCA433(0.94)、 OVCA439(0.54)、 TOV112D(0.5)、 3AO(0.48)， 在 RMUG-S(0.34) 中最低， 与黏液性来源的细胞系相比， 。
34、浆液性卵巢癌细胞系高 表达CCDC72， 尤其是SKOV3ip细胞系， 统计学分析检测， 各组间的mRNA表达差异均具有统计 学意义。 0068 实施例 6 检测 CCDC72 对卵巢癌细胞凋亡、 增殖的影响 0069 采用Annexin V-FITC/PI染色细胞流式方法检测细胞凋亡情况， 其中Annexin V-/ PI- 染色代表活细胞 ； Annexin V+/PI- 染色代表早期凋亡的细胞 ； Annexin V+/PI+ 染色代 表细胞晚期凋亡或坏死细胞， 结果显示， 在SKOV3ip和OVCA433细胞系中， siRNA-1、 siRNA-2 组与阴性对照组 (NC) 相比， 细。
35、胞凋亡率均明显升高， 差异具有统计学意义。 0070 采用细胞流式术检测干扰 CCDC72 基因后对卵巢癌细胞 SKOV3ip 细胞周期分布的 影响， 用 negative-control RNA、 CCDC72 siRNA-1、 CCDC72 siRNA-2 转染 SKOV3ip 细胞 48h 小时后， 收集细胞流式分析， 结果显示， 与 NC 组相比， CCDC72 siRNA-1、 siRNA-2 组的细胞数 在 G0/G1、 S 期增多， G2/M 期降低， 结果表明， 干扰 CCDC72 基因后使诱导 SKOV3ip 细胞阻滞 在 G0/G1、 S 期， 促进细胞凋亡。 0071 细。
36、胞计数实验 (cell counting kit-8 assay) 检测 CCDC72 基因对 SKOV3ip 和 OVCA433 细胞增殖活性的影响， 实验分为三组 ： 阴性对照 (NC) 组、 CCDC72 siRNA-1 组、 CCDC72 siRNA-2 组， 结果显示 ： SKOV3ip 和 OVCA433 细胞的两组干扰组与 NC 组相比， 生长 速率均明显降低 ； 在 SKOV3ip 细胞系中， NC 组的细胞生长速率随着时间的延长 (24h、 48h、 72h、 96h) 不断增加， 而干扰组的细胞生长速率在 24h、 48h、 72h 中不断降低， 96h 后升高 ； 在 O。
37、VCA433 细胞系中， 三组的细胞生长速率均随着时间的延长而不断增加， 但两组干扰组细胞 增长速率低于阴性对照组， 结果表明， 干扰 CCDC72 基因在卵巢癌细胞中的表达可以抑制卵 巢癌细胞的生长， 统计学检验， 组间差异具有统计学意义。 0072 分别用 negative-control RNA、 CCDC72 siRNA-1、 CCDC72 siRNA-2 转染 SKOV3ip 细胞 24h、 48h 后， 收集细胞蛋白， western-blotting 检测 FAK、 Src、 Akt、 Erk1/2 的蛋白表 达， 结果显示， 两组干扰组与 NC 组相比， Src 的表达无明显改。
38、变， 但磷酸化的 Src 表达明显 减弱 ； 24h 后 NC 组、 siRNA-1 组、 siRNA-2 组即出现 p-Src 的变化， 而 48h 后则无明显改变， FAK/p-FAK、 Akt/p-Akt、 Erk1/2/p-Erk1/2 的变化与 Src/p-Src 相似， 结果表明， CCDC72 能 通过 Src/Fak、 Akt、 Erk1/2 信号通路途径影响卵巢癌细胞的增殖、 凋亡。 说 明 书 CN 102586437 A 8 1/8 页 9 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 9 2/8 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 10 3/8 页 11 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 11 4/8 页 12 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 12 5/8 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 13 6/8 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 14 7/8 页 15 图 5 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 15 8/8 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 102586437 A 16 。