水溶性香豆素基荧光探针的合成及其生化应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201811316361.1	申请日：	20181107
公开号：	CN109232499A	公开日：	20190118
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C07D311/16,C09K11/06,G01N21/64	主分类号：	C07D311/16,C09K11/06,G01N21/64
申请人：	长沙理工大学
发明人：	李和平,赵超,尚金艳
地址：	410114 湖南省长沙市天心区万家丽南路二段960号长沙理工大学
优先权：	CN201811316361A
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内容摘要

本发明涉及化学结构式A所示的水溶性香豆素基荧光探针的制备方法及其在检测L－半胱氨酸领域的应用。A式中R1、R2、R3、R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、C1~C2烷基；R5选自：氢、C1~C2烷基。

权利要求书

1.水溶性香豆素基荧光探针，其结构特征如化学结构式A所示，式中R、R、R、R选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、C1~C2烷基；R选自：氢、C1~C2烷基。 2.如权利要求1所述的水溶性香豆素基荧光探针在检测L－半胱氨酸中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物的制备方法，具体是水溶性香豆素基荧光探针的制备方法及其在检测L－半胱氨酸（Cys）方面的应用。

背景技术

L-半胱氨酸(Cys)是一种含巯基脂肪族天然氨基酸，在中性环境下易被空气氧化成胱氨酸，它直接参与蛋白质的合成编码，同时它又是生物体内硫铁络合物中硫配体的提供者，人体中的Cys水平异常会引起毛发色素脱色、生长缓慢、肝功能损伤、肌肉松弛、肥胖、阿尔茨海默氏病和心血管病等临床症状, 因此, 在生物条件下对Cys进行有效检测意义重大。

在现有的检测方法中, 荧光分析法具有操作简单、检测限低、灵敏度高和高选择性等优点, 受到广泛关注，因此，以具有良好生物相容性和荧光性能的香豆素为母体，引入亲水性基团，合成基于香豆素衍生物的水溶性荧光探针，在Cys的检测方面具有良好应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供化学结构式A所示的水溶性香豆素基荧光探针的制备方法及其在检测Cys方面的应用。

式中R1、R2、R3、R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、C1 ~C2烷基；R5选自：氢、C1~C2烷基。

本发明的目的在于提供水溶性香豆素基荧光探针的制备方法，其特征在于它的制备操作是：以二氯甲烷为溶剂，三乙胺为催化剂，以化学结构式B所示的3-氰基-7-羟基香豆素与R5-CH=CHCOCl在冰-水浴条件下反应0.5~3.0 h，制得A所示的水溶性香豆素基荧光探针，制备反应如下：

式中R1、R2、R3、R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、C1 ~C2烷基；R5选自：氢、C1~C2烷基。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

首次合成如A式所示的水溶性香豆素基荧光探针，并首次发现其具有检测Cys的性能；合成在二氯甲烷溶剂中,三乙胺为催化剂，冰-水浴条件下即可进行。

具体实施方式

实施例1

优选化合物3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素的合成。

将1.0 mmol的3-氰基-7-羟基香豆素溶于20.0 mL二氯甲烷中,加入1.0 mL三乙胺,冰-水浴条件下加入1.0 mmol丙烯酰氯，搅拌30 min至反应完全, 将混合物溶于10.0 mL乙酸乙酯中，用去离子水洗涤2-3次，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，乙酸乙酯重结晶，抽滤，真空干燥，得化合物3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素,产率为84.1%，1HNMR（300MHz，CDCl3），δ5.71-6.26（m,3H,-CH=CH2）, δ6.83-7.24(m, 3H, Ar-H), δ8.12(s, 1H, C4-H)ppm; MS(m/z)，242（M++1）。

实施例2

水溶性香豆素基荧光探针（A）的合成。

式中R1、R2、R3、R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、C1 ~C2烷基；R5选自：氢、C1~C2烷基。

按实施例1的方法制备化学结构式A所示的水溶性香豆素基荧光探针。

实施例3

优选化合物3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素随不同Cys加入量的荧光谱图的变化。

取3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素溶于pH=7.4的PBS缓冲溶液配成浓度为2.0 mM的探针母液，将Cys溶于pH=7.4的PBS缓冲溶液配制成100.0 mM的Cys母液，25℃下用荧光光谱仪测量当探针3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素浓度为1mM时，Cys浓度分别为0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 1.8 mM时的荧光发射光谱（激发波长=410nm），发现荧光发射光谱的荧光强度随着Cys浓度的升高而荧光强度不断增大，发射波长为460nm处的荧光强度由0逐步增大到1350。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811316361.1 (22)申请日 2018.11.07 (71)申请人长沙理工大学地址 410114 湖南省长沙市天心区万家丽南路二段960号长沙理工大学 (72)发明人李和平赵超尚金艳 (51)Int.Cl. C07D 311/16(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称水溶性香豆素基荧光探针的合成及其生化应用 (57)摘要本发明涉及化学结构式A所示的水溶性香豆素基荧光探针的。

2、制备方法及其在检测L半胱氨酸领域的应用。 A式中R1、 R2、 R3、 R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、 C1C2烷基； R5选自：氢、 C1C2烷基。权利要求书1页说明书3页 CN 109232499 A 2019.01.18 CN 109232499 A 1.水溶性香豆素基荧光探针，其结构特征如化学结构式A所示，式中R1、 R2、 R3、 R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、 C1 C2烷基； R5选自：氢、 C1C2烷基。 2.如权利要求1所述的水溶性香豆素基荧光探针在检测L半胱氨酸中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 109232499。

3、 A 2 水溶性香豆素基荧光探针的合成及其生化应用技术领域 0001 本发明涉及化合物的制备方法，具体是水溶性香豆素基荧光探针的制备方法及其在检测L半胱氨酸（Cys）方面的应用。背景技术 0002 L-半胱氨酸(Cys)是一种含巯基脂肪族天然氨基酸，在中性环境下易被空气氧化成胱氨酸，它直接参与蛋白质的合成编码，同时它又是生物体内硫铁络合物中硫配体的提供者，人体中的Cys水平异常会引起毛发色素脱色、生长缓慢、肝功能损伤、肌肉松弛、肥胖、阿尔茨海默氏病和心血管病等临床症状, 因此, 在生物条件下对Cys进行有效检测意义重大。 0003 在现有的检测方法中, 荧光。

4、分析法具有操作简单、检测限低、灵敏度高和高选择性等优点, 受到广泛关注，因此，以具有良好生物相容性和荧光性能的香豆素为母体，引入亲水性基团，合成基于香豆素衍生物的水溶性荧光探针，在Cys的检测方面具有良好应用前景。发明内容 0004 本发明的目的在于提供化学结构式A所示的水溶性香豆素基荧光探针的制备方法及其在检测Cys方面的应用。 0005 式中R1、 R2、 R3、 R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、 C1 C2烷基； R5选自：氢、 C1C2烷基。 0006 本发明的目的在于提供水溶性香豆素基荧光探针的制备方法，其特征在于它的制备操作是：以二氯。

5、甲烷为溶剂，三乙胺为催化剂，以化学结构式B所示的3-氰基-7-羟基香豆素与R5-CH=CHCOCl在冰-水浴条件下反应0.53.0 h，制得A所示的水溶性香豆素基荧光探针，制备反应如下：说明书 1/3 页 3 CN 109232499 A 3 式中R1、 R2、 R3、 R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、 C1 C2烷基； R5选自：氢、 C1C2烷基。 0007 本发明与现有技术相比具有如下优点：首次合成如A式所示的水溶性香豆素基荧光探针，并首次发现其具有检测Cys的性能；合成在二氯甲烷溶剂中,三乙胺为催化剂，冰-水浴条件下即可进行。 0008 具体实施。

6、方式 0009 实施例1 优选化合物3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素的合成。 0010 将1.0 mmol的3-氰基-7-羟基香豆素溶于20.0 mL二氯甲烷中,加入1.0 mL三乙胺,冰-水浴条件下加入1.0 mmol丙烯酰氯，搅拌30 min至反应完全, 将混合物溶于10.0 mL乙酸乙酯中，用去离子水洗涤2-3次，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，乙酸乙酯重结晶，抽滤，真空干燥，得化合物3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素,产率为84.1%， 1HNMR （300MHz， CDCl3）， 5.71-6.26 （m,3H,-CH=CH2） , 6.83-7.24(m,。

7、 3H, Ar-H), 8.12(s, 1H, C4-H)ppm; MS(m/z)， 242 （M+1）。 0011 实施例2 水溶性香豆素基荧光探针（A）的合成。 0012 式中R1、 R2、 R3、 R4选自：氢、氘、氟、氯、溴、氨基、 C1 C2烷基； R5选自：氢、 C1C2烷基。 0013 按实施例1的方法制备化学结构式A所示的水溶性香豆素基荧光探针。 0014 实施例3 优选化合物3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素随不同Cys加入量的荧光谱图的变化。 0015 取3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素溶于pH=7.4的PBS缓冲溶液配成浓度为2.0 mM的探针母液，将Cys溶于pH=7.4的PBS缓冲溶液配制成100.0 mM的Cys母液， 25下用荧光光谱说明书 2/3 页 4 CN 109232499 A 4 仪测量当探针3-氰基-7-丙烯酰氧基香豆素浓度为1mM时， Cys浓度分别为0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 1.8 mM时的荧光发射光谱（激发波长=410nm），发现荧光发射光谱的荧光强度随着Cys浓度的升高而荧光强度不断增大，发射波长为460nm处的荧光强度由0逐步增大到1350。说明书 3/3 页 5 CN 109232499 A 5 。

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