技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体地涉及一株桑肠杆菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。
背景技术
现有技术中，香兰素(Vanillin)，又名香荚兰醛；香荚兰素；香兰醛；香兰素。白色针状结晶，呈香荚兰豆特有的芳香气味，微甜。香兰素最初来自于墨西哥，是香荚兰的主要成分，是一种广谱型的高档香料，用途广泛。香兰素堪称世界上使用最广的增香剂，香荚兰豆、香荚兰豆浸膏等香荚兰制品广泛应用于冰淇淋、饮料、巧克力、糖果、布丁、焙烤食品以及酒类、香烟中，除了增香剂外，香兰素作为含有多不饱和组分的食品中的抗氧化剂等。此外，香兰素以及香兰素等系列化合物还是重要的化工原料。香兰素具有特殊的香型，是各国消费者最为喜欢的一种食用香料，有“食品香料之王”的美称。在食品工业中，常作为香料添加于糕点、豆奶、清凉饮料、糖果等食品中；广泛用作名烟名酒、奶油、咖啡、可可、巧克力等高档食品的调香原料；另外由于香兰素具有一定的抗菌能力，可用作保鲜剂。香兰素的世界年消费量约1.2万吨，而天然香兰素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。
目前市场上绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产物纯度高，原料来源广泛，但是存在严重的缺陷，比如环境 污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。
生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，既是指利用微生物(微生物的生长细胞、微生物的休止细胞)、酶(来自微生物或动植物的纯酶或粗酶)或植物细胞，通过简单的生物转化或生物合成制备所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂专一性更强、催化活性更高、条件更易控制。可接受大量的外源复杂分子作为底物，化学选择性、区域选择性、立体选择性或对映选择性的催化底物生成相应的产物。生物转化广泛应用于天然产物的生物合成、药物前体化合物的转化、有机化合物的不对称合成、光学活性化合物的拆分、活性成分筛选及新药开发、药物代谢研究等诸多领域。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同(Natural-identical vanillin)，被称为生物香兰素(Bilogic Vanillin)。其转化前体有丁香酚、异丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香族氨基酸等天然化合物。例如利用微生物发酵的方法，模拟酶在香荚兰中讲解阿魏酸衍生物时产生香兰素的过程而得的“natural vanillin”，符合EU和FDA对天然香精的使用安全要求。
关于用多种微生物发酵法将阿魏酸转化为香兰素已有报道，培养基成分较为复杂，生产成本较高，副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创木酚等，给产品分离提取带来了相当的困难。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一株桑肠杆菌及用此桑肠杆菌生物转化阿魏酸来生产天然香兰素的方法。
本发明的一株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3，于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2012020，所述桑肠杆菌的菌株VL4-3的16SrRNA序列，其序列全长1414bp，与桑肠杆菌的相似度达到99.608％。
一株桑肠杆菌CCTCC M2012020生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法按以下步骤进行：
(1)菌种活化：取桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020接种到斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72小时后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；
所述斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25～35℃条件下，100～150rpm/min振荡培养24h～72h，连续转接1～4次，制得种子培养液；
所述种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
(3)发酵：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比2～20％的接种量接入发酵培养基，在30～40℃条件下，100～200rpm/min振荡培养1～3天；
所述发酵培养基：碳源5～20g/L，氮源1～3g/L，氯化钠0.5～1.5g/L，七水硫酸亚铁0.5～1.5g/L，调节pH 3～10；115℃条件下灭菌20分钟；
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入2～10g/L的阿魏酸，在30～40℃条件下，100～200rpm/min避光振荡培养5～12天后停止，
转化发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液；所得到的天然香兰素发酵液浓度可达1.5～2.3g/L，转化率为18.25～28.87％。
其中：
步骤(3)中的所述碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮、谷壳之中的一种或多种的混合。所述的碳源中优选的是麸皮。
步骤(3)中的所述发酵培养基的pH为8。
步骤(3)中的所述发酵培养基的氮源为豆粕、黄豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨(Arg)、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵之中的一种或多种。步骤(3)中的所述发酵培养基的氮源优选的是豆粕。
步骤(3)中的所述发酵温度为37℃。
步骤(3)中的所述发酵转速优选的是100rpm/min。
步骤(4)转化中的所述接种量为10％，所述阿魏酸添加量为8.5g/L，所述阿魏酸添加时间为24h。
本发明的优点是：菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020未见报道，利用其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法也未经报道，本发明的优选方案，碳源、氮源成本很低，来源广泛易得，其发酵液中天然香兰素浓度大、产量较高，生产工艺过程简单，条件温和，环境友好，有工业化前景，并具备良好的变废为宝的社会效益和经济效益。
附图说明
附图1不同碳源发酵生产天然香兰素的产量比较图；
附图2不同氮源发酵生产天然香兰素的产量比较图；
附图3不同发酵培养基初始pH值下生产天然香兰素的产量比较图；
附图4不同发酵温度下天然香兰素的产量比较图；
附图5不同发酵培养转速下生产天然香兰素的产量比较图；
附图6发酵过程光照/避光生产天然香兰素的产量比较图；
附图7不同摇瓶装液量生产天然香兰素的产量比较图
附图8菌种的活化次数对天然香兰素产量的影响示意图。
生物材料保藏信息
一株桑肠杆菌Enterobactor mori VL4-3于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012020。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020的生物学特征是：该菌株为直杆状，为革兰氏阴性菌，兼性好氧，具有ONPGβ-半乳糖苷酶、LDC赖 氨酸脱羧酶、ADH精氨酸双水解酶、ODC鸟氨酸脱羧酶的酶活性；色氨酸脱氨酶、尿酶反应、H2S产生、明胶液化、吲哚产生呈阴性；能利用柠檬酸、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖，产酸和气，生成酸甜香气物质。能以多种氨基酸、大部分单糖、多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长；在以环糊精、衣康酸、α-酮戊酸、奎尼酸、阿东糖醇、i-赤藻糖醇、L-墨角藻糖、琥珀酰胺酸、乳果糖、羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-焦谷氨酸、D，L-肉碱、γ-氨基丁酸、D-乳糖酸内酯、α-酮戊二酸、癸二酸、γ-羟基丁酸、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2，3-丁二醇为唯一碳源的培养基上不能生长。
(1)不同碳源发酵生产天然香兰素的产量
以高氏一号培养基为基础培养基，固定氮源和无机盐，分别以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳作为碳源，浓度均为20g/L。由图1可知，不同碳源对香兰素产量影响由高到低依次是麸皮、谷壳、蔗糖、淀粉、麦芽浸粉、麦芽糖、葡萄糖和果糖。其中果糖不利于阿魏酸转化为香兰素，缓效碳源比速效碳源更易于香兰素的产生，缓效碳源中的麸皮和谷壳可能由于其中含有生长因子而比单一碳源更易于香兰素的产生。其中以麸皮为碳源时发酵液中香兰素的浓度最高，且麸皮价格便宜，来源广泛方便。
再进一步，所述氮源为酵母粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆粕任选其一，所述氮源优选豆粕。
(2)不同氮源发酵生产天然香兰素的产量
以高氏一号培养基为基础培养基，固定碳源和无机盐，分别以酵母粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆粕作为氮源，浓度均为1g/L。
由图2可知，不同氮源对香兰素产量的影响有高到低依次是豆粕、黄豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨(Arg)、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵。其中有机氮源比无机氮源更利于阿魏酸转化为香兰素。以豆粕作为氮 源时比其他氮源产生的香兰素更多；豆粕的价格便宜。
再进一步，所述pH优选为8。
(3)不同发酵培养基初始pH值下天然香兰素产量
使用优化后的培养基，选择pH在3～10对培养基的pH进行优化。由图4可以看出，在培养基pH3～5之间由于酸性较强，香兰素产量较低；在碱性条件下，pH6～10之间都具有相对较高的产量，说明该菌在碱性条件下更适合阿魏酸转化为香兰素。其中在pH值为8时香兰素的浓度最高。
再进一步，所述发酵温度优选为37℃。
(4)不同发酵温度下天然香兰素的产量
使用优化的培养基，调节pH到8.0，选择温度在30～40℃之间进行优化。当在温度在30℃～37℃之间时，香兰素的产量逐渐升高；而当温度在37～40℃时，可能是由于温度到达40℃时转化阿魏酸生成香兰素的酶的活性降低，所以香兰素浓度降低。结果由图5可以看出，发酵温度为37℃时发酵液中的香兰素浓度最高，此温度下适宜菌体酶活与菌种生长。
再进一步，发酵转速优选为100rpm/min。
(5)不同发酵培养转速下生产天然香兰素的产量
用以下条件为基础来优化摇床培养的转速：发酵培养基pH＝8，培养温度37℃，接种量为10％，底物加入量为8.5g/L，底物加入时间为接种后24h。根据图7可以看出，随着转速的增加，香兰素的产量降低，当发酵转速为100rpm时，发酵液中香兰素的浓度最高。
再进一步，发酵过程优选为避光条件。
(6)发酵过程光照/避光生产天然香兰素的产量
选择发酵时的光照和避光来研究光照条件对香兰素的影响，根据图6可以看出，在避光条件下比光照条件下的香兰素高，可能是在光照条件下部分香兰素分解或部分阿魏酸分解，因而影响香兰素的产量，所以桑肠杆菌转化阿魏酸生产香兰素更适合在避光条件下进行。
不同发酵培养条件下生产天然香兰素的产量
(1)接种量、底物添加量和底物添加时间对香兰素产量的影响
以优化得到的培养基为基础，调节pH＝8，培养温度为37℃。优化接种量、底物添加量和底物添加时间，三个因素对香兰素产量的影响顺序为阿魏酸加入量＞阿魏酸加入时间＞接种量，即阿魏酸加入量的对香兰素产量影响最大，接种量对香兰素产量影响最小。由实验结果可知最佳组合为接种量为10％，底物阿魏酸添加量为8.5g/L，底物阿魏酸添加时间为24h。
(2)不同摇瓶装液量生产天然香兰素的产量
转速和摇瓶装液量是影响溶氧的两个重要因素，同时也影响氧化还原反应。以转速为100rpm考察装液量对香兰素产量的影响。根据图7可以看出，随着装液量的增加，香兰素的产量降低，装液量为10％时，发酵液中香兰素的浓度最高，因此以10％装液量(500mL三角瓶中加入50mL发酵培养基)作为该菌种转化阿魏酸生产香兰素的最佳发酵装液量。
(3)菌种的活化次数对天然香兰素产量的影响
菌株的状态对转化阿魏酸生成香兰素的各种酶的活性影响较大，对4℃保存的菌种活化1～4次来研究菌种的状态对香兰素产量的影响，根据图8可以看出，随着菌种活化次数增加，香兰素产量随之增加，当活化次数在3次及以上时，菌种的转化能力和香兰素的产量保持稳定。
本发明的优点是：本发明的菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020未见报道，利用其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法也未经报道，本发明经优化，碳源优选为植物废料麸皮、氮源优选为植物废料豆粕时，成本很低，来源广泛易得，其发酵液中天然香兰素浓度可达2.3g/L，最大转化率为28.87％，产量较高，生产工艺过程简单，条件温和，环境友好，有工业化前景，并具备良好的变废为宝的社会效益和经济效益。
实施例1
本发明的微生物菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020 发酵生产天然香兰素的方法如下：
1.微生物发酵
(1)菌种活化：取桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020接种于准备好的斜面培养基上，在恒温培养箱中，在30℃、pH7条件下，静置培养36h，得到活化菌种，保存于4℃冰箱中；
斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)配制种子培养液：用接种环挑取一环VL4-3到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在恒温摇床中，30℃，转速100rpm/min振荡培养24h；活化1次，制得种子培养液；
种子液培养基组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
(3)发酵：将培养好的VL4-3种子液以10％(V/V)的接种量接入到发酵培养基(装液量10％)中，40℃，100rpm/min振荡培养24h，
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入3.5g/L的阿魏酸25％(体积比)，40℃，转速100rpm/min，避光培养8天后停止发酵。
发酵培养基的组成为：麸皮20g/L，豆粕3g/L，氯化钠1.0g/L，FeSO4·7H2O0.5g/L，pH 9。115℃条件下灭菌20分钟。豆粕经粉碎机粉碎为10目以上。
2.发酵液中天然香兰素的提取纯化
发酵液在8000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液。
实施例2
本发明的微生物菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020发酵生产天然香兰素的方法如下：
1.微生物发酵
(1)菌种活化：取桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020接种于准备好的斜面培养基上，在恒温培养箱中，在35℃、pH9条件下，静置培养72h，得到活化菌种，保存于4℃冰箱中；
斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)配制种子培养液：用接种环挑取一环VJ4-1到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在恒温摇床中，25℃，转速150rpm/min振荡培养24h；活化2次，制得种子培养液；
种子液培养基组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
(3)发酵：将培养好的VJ4-1种子液以40％(V/V)的接种量接入到发酵培养基(装液量10％)中，35℃，150rpm/min振荡培养36h，
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入5g/L的阿魏酸25％(V/V)，30℃，转速200rpm/min，避光培养12天后停止发酵。
发酵培养基的组成为：淀粉5g/L，黄豆饼粉1g/L，氯化钠1.5g/L，FeSO4·7H2O 1.0g/L，pH 5。115℃条件下灭菌20分钟。豆粕经粉碎机粉碎为10目以上。
2.发酵液中天然香兰素的提取纯化
发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，得到淡黄色天然香兰素发酵液。
实施例3
本发明的微生物菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020发酵生产天然香兰素的方法如下：
1.微生物发酵
(1)菌种活化：取桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020接种于准备好的斜面培养基上，在恒温培养箱中，在25℃、pH5条件下，静置培养72h，得到活化菌种，保存于4℃冰箱中；
斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)配制种子培养液：用接种环挑取一环VJ4-1到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在恒温摇床中，30℃，转速130rpm/min振荡培养36h；活化4次，制得种子培养液；
种子液培养基组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
(3)发酵：将培养好的VJ4-1种子液以30％(V/V)的接种量接入到发酵培养基(装液量10％)中，30℃，200rpm/min振荡培养72h，
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入8.5g/L的阿魏酸25％(V/V)，40℃，转速100rpm/min，避光培养6天后停止发酵。
发酵培养基的组成为：果糖15g/L，酵母粉2g/L，氯化钠1.0g/L，FeSO4·7H2O 1.5g/L，pH 7。115℃条件下灭菌20分钟。豆粕经粉碎机粉碎为10目以上。
2.发酵液中天然香兰素的提取纯化
发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液。
实施例4
本发明的微生物菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020发酵生产天然香兰素的方法如下：
1.微生物发酵
(1)菌种活化：取桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020接种于准备好的斜面培养基上，在恒温培养箱中，在30℃、pH 7条件下，静置培养36h，得到活化菌种，保存于4℃冰箱中；
斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)配制种子培养液：用接种环挑取一环VJ4-1到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在恒温摇床中，30℃，转速100rpm/min振荡培养36h；活化2次，制得种子培养液；
种子液培养基组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
(3)发酵：将培养好的VJ4-1种子液以10％(V/V)的接种量接入到发酵培养基(装液量10％)中，30℃，100rpm/min振荡培养36h；
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入10g/L的阿魏酸25％(V/V)，40℃，转速100rpm/min，避光培养8天后停止发酵。
发酵培养基的组成为：谷壳20g/L，牛肉膏2g/L，氯化钠1.5g/L，FeSO4 ·7H2O 1.0g/L，pH 6。115℃条件下灭菌20分钟。
2.发酵液中天然香兰素的提取纯化
发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液。
实施例4
本发明的微生物菌株食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus CCTCC M201200发酵生产天然香兰素的方法如下：
1.微生物发酵
(1)菌种活化：取食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC M2012004接种于准备好的斜面培养基上，在恒温培养箱中，在30℃、pH 5条件下，静置培养72h，得到活化菌种，保存于4℃冰箱中；
斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)配制种子培养液：用接种环挑取一环VJ4-1到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在恒温摇床中，35℃，转速100rpm/min振荡培养72h；活化1次，制得种子培养液；
种子液培养基组成为：牛肉膏50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
(3)发酵：将培养好的VJ4-1种子液以10％(V/V)的接种量接入到发酵培养基(装液量10％)中，35℃，150rpm/min振荡培养24h，
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入5.0g/L的反式阿魏酸25％(V/V)，30℃，转速150rpm/min，光照培养8天后停止发酵。
发酵培养基的组成为：蔗糖20g/L，动物蛋白胨2g/L，氯化钠1.5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，pH 10。115℃条件下灭菌20分钟。
2.发酵液中天然香兰素的提取纯化
发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液。
实施例5
本发明的微生物菌株桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020发酵生产天然香兰素的方法如下：
1.微生物发酵
(1)菌种活化：取桑肠杆菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020接种于准备好的斜面培养基上，在恒温培养箱中，在30℃、pH 5条件下，静置培养72h，得到活化菌种，保存于4℃冰箱中；
斜面培养基：胡萝卜浸液200mL/L，蔗糖20g/L，琼脂13g/L；
(2)配制种子培养液：用接种环挑取一环VJ4-1到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在恒温摇床中，35℃，转速100rpm/min振荡培养72h；活化1次，制得种子培养液；
种子液培养基组成为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
(3)发酵：将培养好的VJ4-1种子液以10％(V/V)的接种量接入到发酵培养基(装液量10％)中，35℃，150rpm/min振荡培养24h，
(4)转化：使用步骤(3)所得的发酵液，加入5.0g/L的阿魏酸25％(V/V)，30℃，转速150rpm/min，光照培养8天后停止发酵。
发酵培养基的组成为：麦芽浸粉20g/L，酵母粉2g/L，氯化钠1.5g/L，FeSO4·7H2O 1.5g/L，pH 8。115℃条件下灭菌20分钟。
2.发酵液中天然香兰素的提取纯化
发酵液在7000rpm/min条件下，12min离心处理，收集上清液，得到淡黄色天然香兰素发酵液。