技术领域
本发明涉及利用具有广的基质特异性的酪氨酸酶(tyrosianse)以高的生产率和 收率筛选性地从多种单酚型结构物质(monophenoliccompounds)仅生成儿茶酚型 结构物质的方法。由此，本发明可实现利用酶反应的功能性儿茶酚型结构物质的 批量生产，且可适用于原料化及医疗用产品生产。
背景技术
据报告，很多儿茶酚型结构物质(catecholderivatives)在抗氧化、抗癌、抗炎 症或抗病毒等效果中呈现好的生理活性，与单酚型结构物质(monophenolic compounds)相比，其效果更高。尤其，儿茶酚型结构物质作为酪氨酸酶(tyrosinase) 的抑制剂利用，并具有减少基于酪氨酸酶的黑色素(melanin)的生产的效果。并且， 众所周知，在大豆甙元(daidzein，来源于大豆的异黄酮)中，特异性地实现邻羟基 化(ortho-hydroxylation)的3’-邻羟基大豆甙元(3’-ODI，3’-orthohydorxydaidzein)的 一部分存在于熟成的大酱中，预防由紫外线引起的皮肤癌，并抑制与癌转移相关 的活性(JBC，2010，vol.285，pp.21458；JBC，2011，vol.286，pp.14246)。作为 来源于芹菜素(apigenin)的儿茶酚型物质，羟基化的木犀草素(luteolin)在抗氧化性 好的洋蓟(arichoke)中可提取极少量，据最新报告，可在乳腺癌治疗中使用(Food Chemistry，2013，"Luteolinsensitisesdrug-resistanthumanbreastcancercellsto tamoxifenviatheinhibitionofcyclinE2expression")。除此之外，众所周知，橄榄 油中的羟基酪醇(hydroxytyrosol)、葡萄酒中的白皮杉醇(piceatannol)等的儿茶酚型 物质还用作强力的抗氧化剂。高分子物质上的儿茶酚型结构物质可摹仿贻贝蛋白 质的功能，其应用领域从医疗物质至表面改性纳米工程正广泛地进行研究(Annu RevMaterRes.2011141：99-132Biofouling2012，28：8，865-877)。
在利用以往的生物催化剂来生产儿茶酚型结构物质的情况下，利用包括P450 酶在内的多种单加氧酶(mono-oxigenase)。但是，在大部分的单加氧酶的情况下， 需要辅酶，并需要用于电子传递的双还原酶(reductase)。这会影响基质的生物转 化反应速度，并由低的收率和生产率引起。相反，酪氨酸酶的单酚结构物质氧化 反应相对快(作为参考，来源于蘑菇类的酪氨酸酶的kcat/Km值为大致 1000mM-1s-1)，不伴随用于辅酶的电子传递反应的双酶。
但是，酪氨酸酶的问题如下：使单酚型结构物质羟基化，来在生产儿茶酚型 结构物质的第一次羟基化反应(monophenolaseactivity)之后，在单酚型结构物质中 生物转化的儿茶酚型结构物质借助酪氨酸酶的第二次氧化反应(dipehnolase activity)生物转化为醌型物质(quinoniccompounds)。通常，醌型物质形成自由基 (radical)来快速形成黑色素(melanin)，生成的黑色素以稳定的结构体具有阻隔紫外 线区域的光的功能。
酪氨酸酶由活性部位周边6个组氨酸(Histidine)固定两个铜离子，上述两个 铜离子之间的距离在包括铜的儿茶酚氧化酶(catecholoxidase)和其他酪氨酸酶组 中规定地保持。根据氧的存在与否，并根据在两个铜之间结合的氧原子的数量， 酪氨酸酶区分为三种形态，即，脱氧形态(脱氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))、氧 形态(氧-酪氨酸酶(oxy-tyrosinase))及甲硫氨酸形态(甲硫氨酸-酪氨酸酶 (met-tyrosinase))。
脱氧形态(脱氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))为两个铜离子之间不包含氧的形 态，若不供给氧，则成为无法进行羟基化及氧化反应的非活性体。
若在空气中，氧在溶剂中解离或供给过氧化氢，则在脱氧形态的两个铜离子 之间固定一个氧(O2)分子，并将这种形态称为氧形态(氧-酪氨酸酶 (oxy-tyrosinase))。在这种氧形态中，若单酚的氧原子与一个铜离子相结合，则开 始酪氨酸酶的第一次羟基化反应。
作为上述第一次羟基化反应(monophenolaseactivity)，氧分子键断裂，一个氧 原子与邻位碳相结合，插入羟基，在酪氨酸酶的两个铜之间仅残留有一个氧原子。 将这种形态称为甲硫氨酸形态(甲硫氨酸-酪氨酸酶(met-tyrosinase))。此时，儿茶 酚型结构物质和甲硫氨酸-酪氨酸酶分离，两个铜之间的一个氧原子重新排列已形 成的角度，并准备第二次氧化反应(diphenolaseactivity)。
甲硫氨酸形态可使儿茶酚型结构物质氧化，但不参与单酚型的羟基化反应。 在第一次羟基化反应之后，从芳香环上的两个羟基的残基中去除氢离子，从而连 续发生与残留的一个氧原子相结合来生成水的氧化反应。若使用完结合的两个氧 原子，则两个铜离子之间被空出，并重新回到脱氧形态。在单酚型初始基质中， 通过两次生物转化(羟基化反应及氧化反应)生成的产物为邻-苯醌形态的结构物 质。
在第二次氧化反应(diphenolaseactivity)中，可从儿茶酚型结构物质的两个羟 基中去除氢，来与两个铜相结合，一个氧原子从儿茶酚型物质中接收两个电子来 还原为水(diphenolaseactivity)。如上所述，甲硫氨酸形态可使儿茶酚型结构物质 氧化，但不参与单酚型的羟基化反应。因而，在氧-酪氨酸酶的单酚型结构物质的 氧化反应之后，生成的儿茶酚型结构物质无法由甲硫氨酸-酪氨酸酶氧化的情况 下，甲硫氨酸-酪氨酸酶因无法转换为脱氧-酪氨酸酶而积累，酪氨酸酶被失活。
与第一次羟基化反应(monophenolaseactivity)的反应速度常数(k1)相比，第二 次氧化反应(diphenolaseactivity)的速度常数(k2)大大致10倍左右，因而在积累作 为中间生成物的儿茶酚型结构物质方面存在困难。酪氨酸酶的研究焦点主要集中 在黑色素的形成反应和其抑制剂的作用，因而在应用其的多种儿茶酚型结构物质 形成反应最优化技术中，本研究可视为最初技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：韩国特许公开10-2012-0114072
专利文献2：韩国特许登录10-0878394
非专利文献
非专利文献1：L-抗坏血酸对酪氨酸酶的单酚酶活性产生的影响，Biochem J.1993October1；295(Pt1)：309–312
非专利文献2：用于单酚酶/双酚酶激活比率的酪氨酸酶的方向进化，Enzyme andMicrobialTechnology，Volume47，Issue7，8December2010，Pages372-376
发明内容
技术问题
适用生物学方法的儿茶酚型结构物质的代表性生产方法可分为两种情况， 即，儿茶酚和其他结构的结合方法和单酚型结构物质的羟基化反应。
相当于第一种情况的代表性反应为日本味之素(Ajinomoto)公司多巴(DOPA) 生产方法。利用酪氨酸-苯酚裂解酶(tyrosin-phenolliase)使儿茶酚、乙酸及氨生物 转化为多巴(DOPA)，并最高可生产100g/L左右。为了利用裂解酶生产儿茶酚型 结构物质，需要筛选与儿茶酚可形成碳-碳键的特异性基质和相应的裂解酶。由此， 在多种儿茶酚型结构物质的生产上存在局限。
相当于第二种情况的苯类结构物质或单酚型结构物质的羟基化反应有利用 单加氧酶(monooxygenase)的方法。单加氧酶作为氧化还原酶的一种，需要借助电 子传递系统的电子的供给。代表性的单加氧酶反应酶为细胞色素P450(cytochrome P450)，从位于酶的中心的血红素(heme)结构的铁离子的氧化还原作用诱导反应。 使细胞色素P450的基质特异性转换，从而适用于多种结构的儿茶酚型结构物质 的生产。但是，在大部分的单加氧酶的情况下，需要辅酶，并需要用于电子传递 的双还原酶(reductase)。这会影响基质的生物转化反应速度，并由低的收率和生 产率引起。
作为除此之外的其他生物催化羟基化反应有酪氨酸酶的应用。酪氨酸酶的活 性部位主要存在于蛋白质表面，在多种儿茶酚型结构物质的生产中，优点为对单 酚型结构物质的酪氨酸酶的基质特异性广。并且，酪氨酸酶的单酚结构物质氧化 反应相对快(作为参考，来源于蘑菇类的酪氨酸酶的kcat/Km值为大致 1000mM-1s-1)，不伴随用于辅酶的电子传递反应的双酶。但在酪氨酸酶的情况下， 将多种单酚型结构物质用作基质，从而具有与所提及的上述两种情况相比，可更 快地转换为儿茶酚型结构物质的优点，但同时还快速使儿茶酚型结构物质氧化， 从而形成醌形态。生成的醌型物质容易形成自由基，来形成黑色素等的高分子物 质，或使周边物质氧化。
为了有效地积累作为中间体的儿茶酚型结构物质，需要研究基于醌型物质的 还原的儿茶酚型物质的积累、已积累的儿茶酚型物质的氧化防止、随着儿茶酚型 物质积累而失活的酪氨酸酶的重新激活。
本发明的目的在于，通过如上所述的三种研究，提供利用酪氨酸酶以高的生 产率和收率生产功能性儿茶酚型结构物质的生产方法。
解决问题的手段
为了抑制酪氨酸酶的第二次氧化反应，并有效地生产儿茶酚型结构物质，本 技术的战略大致分为三个部分，即，基于醌型物质的还原的儿茶酚型物质的积累、 已积累的儿茶酚型物质的氧化防止、失活的酪氨酸酶的重新激活。
具体地，第一，本发明提供如下方法，即，使通过酪氨酸酶的第二次氧化反 应生产的醌型物质有效地重新还原为儿茶酚型结构物质。
第二，本发明提供如下方法，即，针对通过酪氨酸酶的第一次羟基化反应生 成的儿茶酚型结构物质，诱导与其他元素的配位键，来从酪氨酸酶的第二次氧化 反应中得到保护。
第三，本发明提供有效调节酪氨酸酶的三种活性形态来将酶活性最优化的技 术。当儿茶酚型结构物质未氧化时，不容易去除甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子， 因而酪氨酸酶处于失活状态。像这样处于失活状态的酪氨酸酶可借助还原力来重 新激活。
具体地，本发明提供如下。
(1)利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法的特征在 于，其包括以下步骤(a)至步骤(c)中的一个步骤，步骤(a)，导入还原力来使通过 酪氨酸酶的过氧化反应生成的醌型结构物质还原为儿茶酚型结构物质；步骤(b)， 利用过渡金属离子或硼离子使生成的儿茶酚型结构物质形成配位键；以及步骤 (c)，导入还原力来使甲硫氨酸-酪氨酸酶激活。
(2)根据(1)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的 方法，其特征在于，在步骤(a)或步骤(c)中使用的还原力从选自由电化学、还原型 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、 抗坏血酸、半胱氨酸、对香豆酸、羟胺、儿茶酚、邻苯三酚及咖啡酸组成的组中 的物质提供。
(3)根据(1)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的 方法，其特征在于，单酚型结构物质选自由酪氨酸氨基酸、酪醇、白藜芦醇、大 豆甙元、染料木素、芹菜素、根皮素、苯酚、对香豆酸、对硝基苯酚、对甲酚、 对乙烯基苯酚及邻氨基苯酚组成的组中。
(4)根据(1)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的 方法，其特征在于，儿茶酚型结构物质选自由木犀草素、3-羟基根皮素、3’-邻羟 基大豆甙元、二羟四氢黄酮、白皮杉醇、羟基酪醇、多巴(dopa)、咖啡酸、3，4- 二羟基硝基苯、3，4-二羟基甲苯及3，4-二羟基苯乙烯组成的组中。
(5)根据(1)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的 方法，其特征在于，还包括分离纯化儿茶酚型结构物质的步骤(d)，在上述步骤(d) 中，在有机溶剂中溶解包含儿茶酚型结构物质的生成物来取得水层，降低取得的 水层的pH之后，还在有机溶剂中溶解来取得有机层，并使有机层蒸发来取得儿 茶酚型结构物质。
(6)根据(1)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的 方法，其特征在于，单酚型结构物质为高分子上的酪氨酸残基。
(7)高分子交联反应方法的特征在于，利用通过(6)所述的利用酪氨酸酶从单酚 型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法来制备的儿茶酚型结构物质。
发明效果
本发明涉及利用酪氨酸酶的功能性儿茶酚型结构物质的制备及其应用，可适 用于多种来源的酪氨酸酶。这是根据酪氨酸酶基质特异性概括在多种单酚型结构 物质中向功能性儿茶酚型物质的羟基化反应的，可实现现有的难提取或难以进行 有机化学合成的儿茶酚型结构物质的生产，从而可贡献于其生理学功效实验。最 近，有很多对黄酮/异黄酮系列的氢氧化物的抗癌性相关研究。但是，难以实现位 置特异性的有机合成法，并且在提取自然极少存在的羟基黄酮/异黄酮方面也存在 局限。通过本研究，可使功能性儿茶酚型结构物质的生产变得容易，且可进行更 多的与此相关的生理学研究及新材料/功能性原料开发。
并且，利用酪氨酸酶可使作为蛋白质上的单酚型氨基酸残基的酪氨酸 (tyrosine)羟基化为多巴，这可改良性质成为可摹仿贻贝蛋白质的粘结功能的蛋白 质。像这样，改良性质的蛋白质可发展为组织工程的支架(scaffolds)，进一步可开 发为功能性蛋白质给药系统(drugdeliverysystem)(AnnuRevMaterRes.20111； 41：99-132；Biofouling，2012，28：8，865-877；CurrentOpinioninBiotechnology 2013，24：1–7)。
附图说明
图1为用于由酪氨酸酶生成有效的儿茶酚型结构物质的示意图，图1的a为 单酚型结构物质，图1的b为儿茶酚型结构物质，图1的c为醌型结构物质，图 1的d为与儿茶酚型结构物质的其他元素形成配位键的结构体。并且，图1的1 为酪氨酸酶的第一次羟基化反应，图1的2为酪氨酸酶的第二次氧化反应，图1 的3为脱氧-酪氨酸酶将一个氧分子放入存在于活性部位内的两个铜之间，并成为 氧化-酪氨酸酶的反应，图1的4为借助使甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子还原 的还原剂的反应，图1的5为羟基化的儿茶酚型结构物质形成配位键的反应，图 1的6为使醌型结构物质还原来重新积累为儿茶酚型结构物质的反应，图1的7 为过氧化的醌型物质高分子化为黑色素的反应。
图2作为罗列在酪氨酸酶全细胞反应中添加的还原剂的表，在添加各个还原 剂(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、L-抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、羟基醌、 1-萘酚、对香豆酸、姜黄素、儿茶酚、邻苯三酚或阿魏酸)的情况下，在白藜芦醇 (trans-resveratrol)中呈现羟基化的白皮杉醇(piceatannol)的相对生产量。
图3为有关三种不同来源的酪氨酸酶(BMT_tyr：巨大芽孢杆菌酪氨酸酶、 ABS_tys：双孢蘑菇酪氨酸酶、SAV_tyr：除虫链霉菌酪氨酸酶)的酪氨酸氨基酸 (L-tyrosine)和多巴(L-dopa)的单加氧酶反应速度和双加氧酶反应速度的比较表。
图4为表示从单酚型结构物质通过酪氨酸酶的羟基化反应生成的多个儿茶酚 型结构物质的反应式。
图5为通过pH调节确认羟基化的3’-邻羟基大豆甙元(3’-ODI， 3’-orthohydorxydaidzein)是否形成配位键的高性能-液相层析的定量分析。
图6为通过pH调节确认羟基化的二羟四氢黄酮(orobol)和木犀草素(luteolin) 是否形成配位键的高性能-液相层析的定量分析。
图7a为以时间为单位观察pH9的硼酸缓冲液中包含1mM的大豆甙元及 100nM的酪氨酸酶的5mL体外(invitro)反应中的3’-邻羟基大豆甙元的生产率的 曲线图。
图7b为以时间为单位观察pH9的三(羟甲基)氨基甲烷(tris-HCl)中包含 300μM的大豆甙元及100nM的酪氨酸酶的5mL体外反应中的3’-邻羟基大豆甙元 的生产率的曲线图。
图8为以时间为单位观察添加了羟胺或抗坏血酸的1mM的染料木素的羟基 化反应的曲线图。
图9为以时间为单位观察添加了羟胺或抗坏血酸的1mM的白藜芦醇的羟基 化反应的曲线图。
图10为用于分离/纯化生成的儿茶酚型结构物质的技术的示意图，在实施例 5中详细且明确地示出了其方法。
图11a表示利用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析从大豆甙元(daidzein)生成 的3’-邻羟基大豆甙元(3’-ODI)的结果，由1表示的保留时间(retentiontime)18.18 分为通过气相色谱法(GC)分离的3’-邻羟基大豆甙元，由a表示的486.48、m/z为 分子量(TMS)的m/z，由b表示的471.50、m/z为分子量(TMS)-15的m/z，由c 表示的383.39、m/z为分子量(TMS)-103的m/z。
图11b表示利用气相色谱-质谱联用仪分析从白藜芦醇(trans-resveratrol)生成 的白皮杉醇(piceatannol)的结果，由1表示的保留时间(retentiontime)14.82分为通 过气相色谱法分离的白皮杉醇，由a表示的532.53、m/z为分子量(TMS)的m/z， 由b表示的517.45、m/z为分子量(TMS)-15的m/z。
图12示出根据pH的儿茶酚型结构物质与铁离子形成配位键的状态。
具体实施方式
以下，对本发明进行更详细的说明。
只要无其他定义，在本发明中使用的所有技术性术语及科学性术语具有与本 发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的术语相同的含义。通常，在本说 明书中使用的命名法及以下记述的实验方法为在本技术领域中众所周知且通常 使用的方法。
本发明提供利用酪氨酸酶或表达酪氨酸酶的微生物(全细胞)来生产儿茶酚型 结构物质的方法。
并且，提供为了抑制基于酪氨酸酶的过氧化反应的儿茶酚型结构物质的生物 转化反应而形成配位键来积累的方法。
并且，本发明提供使通过过氧化生成的醌型物质有效地还原为儿茶酚型结构 物质的方法。
具体地，本发明可通过i)基于醌型物质的还原的儿茶酚型物质的积累、ii)已 积累的儿茶酚型物质的氧化防止、iii)随着儿茶酚型物质积累而失活的酪氨酸酶的 重新激活，有效地积累儿茶酚型结构物质。
第一，本发明提供可有效地使通过酪氨酸酶的第二次氧化反应生产的醌型物 质重新还原为儿茶酚型结构物质的方法。由此有可能延迟醌型结构物质高分子化 为黑色素。这是因为多个自由基借助还原力而稳定化，且因为醌型物质接收电子， 从而可重新转换为儿茶酚型结构物质。不对酶活性产生坏影响而可使用的有效的 还原力有电化学方法和图2的还原剂目录中明确示出的化合物之类的还原剂。若 在氧化反应中添加目录中的还原剂，则可确认暗的黑色素的形成被延迟。此时， 虽然延迟黑色素的形成，但是可确认作为初始基质的单酚型物质持续减少，由此 判断为如上所述的还原力仅影响黑色素的形成，而与酪氨酸酶的活性降低无关。 上述还原力可从选自由电化学、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸、抗坏血酸、半胱氨酸、对香豆酸、羟胺、儿茶酚、邻苯三酚 及咖啡酸组成的组中的物质提供。优选地，上述还原力可利用葡萄糖脱氢酶 (glucosedehydrogenase)等的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(NAD(P)H)再生 产酶来在反应中持续提供，这在体内(invivo)生产儿茶酚型物质时，可更有效地 得到应用。
第二，本发明提供如下方法，即，针对通过酪氨酸酶的第一次羟基化反应生 成的儿茶酚型结构物质，诱导与其他元素的配位键，来从酪氨酸酶的第二次氧化 反应中得到保护。众所周知，儿茶酚型结构物质根据pH与铁离子形成配位键(Proc NatlAcadSciUSA.201115，108(7)，2651-2655)。这种道理与贻贝蛋白质结合于 有机物中的金属离子来具有粘结力的道理相同(AnnuRevMaterRes.201141， 99-132)。基于此，除了铁离子之外，对酪氨酸酶的活性无害，并筛选了与儿茶酚 型结构物质形成配位键的物质，通过用于本研究的实施例的实验来进行。
硼(B)具有sp2杂化轨道函数，但当存在路易斯碱(Lewisbase)时，成为sp3。 据报告，儿茶酚型结构物质起到路易斯碱的作用，根据pH，与一个或两个儿茶 酚物质形成配位键(BBA，2002，1569，35-44)。与硼酸相结合的复合体的亲水性 增加，由于这种机制，当稳定具有二醇(diol)的糖时，使用硼酸离子，当从咖啡豆 或茶叶中提取咖啡因时还使用硼酸离子。形成配位键的儿茶酚型物质的羟基全部 与硼酸形成配位键，因而不被酪氨酸酶氧化。因而，当排除第二次氧化反应，而 仅观察第一次羟基化反应时还利用(JACS，2003，vol.125，43，13034-13035)。
第三，本发明提供有效调节酪氨酸酶的三种活性形态(脱氧形态、氧形态及甲 硫氨酸形态)来将酶活性最优化的技术。当儿茶酚型结构物质未氧化时，甲硫氨酸 -酪氨酸酶的一个氧原子不容易被去除，因而酪氨酸酶处于失活状态。像这样处于 失活状态的甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子借助其他还原剂或电化学还原力还 原，从而有可能作为水分子被去除，酪氨酸酶重新转换为可接收氧(O2)分子的脱 氧形态。作为这种还原剂，如图2的还原剂列表中明确示出，除了儿茶酚型物质 之外，有羟胺(NH2OH，hydroxylamine)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)、 抗坏血酸(ascorbicacid)等。
如图1的反应4所示，羟胺(hydroxylamine)使残留在活性部位内的铜之间的 氧原子还原来生成水，并使无法作为基质接收单酚型物质的酪氨酸酶转换为脱氧 形态(JACS，2003，vol.125，43，13034-13035)。脱氧-酪氨酸酶与一个氧分子重 新形成铜-氧复合体(μ-η2：η2peroxobinuclearcoppercomplex)来成为氧-酪氨酸酶。 图1的反应4不仅借助羟胺来实现，而且还可借助可靠近活性部位的还原剂，即， 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)、抗坏血酸、其他儿茶酚型物质等来实现。
另一方面，在本发明中使用的术语为在本技术领域中通常使用的术语，只要 是本发明所属技术领域的普通技术人员，就都可以理解其含义，但在本说明书中， 进行简单的说明如下。
(1)酪氨酸酶作为包含铜的蛋白质，是指催化黑色素的生产的酶。
(2)单酚型结构物质是指具有与图1的a相同的结构的物质。上述单酚型结构 物质有酪氨酸氨基酸(tyrosin)、酪醇(tyrosol)、白藜芦醇(resveratrol)等的1，2-二 苯乙烯(stilbene)系列、大豆甙元(daidzein)、染料木素(genistein)、芹菜素(apigenine)、 根皮素(phloretin)等的黄酮(flavonone)/异黄酮(isoflavone)系列，除此之外，还有苯 酚(phenol)、对香豆酸(para-coumaricacid)、对硝基苯酚(para-nitrophenol)、对甲酚 (para-cresol)、对乙烯基苯酚(para-vinylphenol)及邻氨基苯酚(ortho-aminophenol)。 优选地，可使用白藜芦醇、对香豆酸、大豆甙元、染料木素、对硝基苯酚、对甲 酚、对乙烯基苯酚、芹菜素或根皮素等。
并且，单酚型结构物质可以为高分子物质上的酪氨酸残基，上述高分子物质 可以为蛋白质(多肽)。
(3)儿茶酚型结构物质是指具有与图1的b相同的结构的物质。上述儿茶酚型 结构物质作为对单酚型结构酪氨酸物质特异性地进行邻羟基化的物质，有木犀草 素(luteolin)、3-羟基根皮素(3-hydroxyphloretin，3’-ODI)、二羟四氢黄酮(orobol) 等的羟基黄酮(flavonone)/异黄酮(isoflavone)系列、白皮杉醇(piceatannol)等的羟基 1，2-二苯乙烯(stilbene)系列、羟基酪醇(hydroxyltyrosol)、多巴(dopa)、咖啡酸 (caffeicacid)、3，4-二羟基硝基苯(3，4-dihydroxynitrobenzene)、3，4-二羟基甲 苯(3，4-dihydroxytoluene)、3，4-二羟基苯乙烯(3，4-dihydroxystyrene)等。优选 地，以上罗列的优选的多个单酚型结构物质作为特异性地进行邻羟基化的形态， 依次有白皮杉醇、咖啡酸、3’-邻羟基大豆甙元、二羟四氢黄酮、3，4-二羟基硝 基苯(3，4-dihydroxynitrobenzene)、3，4-二羟基甲苯(3，4-dihydroxytoluene)、3， 4-二羟基苯乙烯(3，4-dihydroxystyrene)、木犀草素、3-羟基根皮素 (3-hydroxyphloretin)等。
(4)醌型结构物质是指具有与图1的c相同的结构的物质。
(5)配位键复合物质是指形成与图1的d或图12的单复合体(mono-complex)、 双复合体(bis-complex)或三羟甲基氨基甲烷复合体(tris-complex)相同的结构的复 合体。可使用过渡金属离子(transitionmetalions)或硼酸离子(boricacid，borate ion)。
(6)细胞提取物是指表达辅助蛋白和酪氨酸酶的本发明的微生物提取物。
(7)全细胞反应是指破碎包含特定酶的细胞来利用细胞内容物，或不对酶进行 分离纯化而利用完整的整个细胞的反应。
(8)酪氨酸酶第一次羟基化反应(单加氧酶活性)是指在向碳-氢键内导入氧原 子时进行催化的酪氨酸酶酶反应，生成羟基的残基。
(9)酪氨酸酶第二次氧化反应(双加氧酶活性)是指在儿茶酚型结构物质中去除 与氧相结合的氢和电子，来以苯醌形态催化的酪氨酸酶酶反应。
(10)PCR作为聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，是指使脱氧核糖 核酸的一个区域特异性地扩增的方法。
(11)载体是指由单链、双链、圆形或超螺旋脱氧核糖核酸或核糖核苷酸形成 的多核苷酸。载体可包含在适当的距离以操作的方式连接的结构要素，用于可生 产重组蛋白质。这种结构要素可包含复制起点、启动子、增强子、5’信使核糖核 酸(5’mRNA)前导序列、核糖体结合位点、核酸盒、终止及聚腺苷酸化位点及可 筛选的标记格式等，多个上述结构要素可根据特异性用途减少一个或一个以上结 构要素。核酸盒可包含用于插入所要表达的重组蛋白质的限制酶位点。在功能性 载体中，核酸盒含有包含翻译开始及终止位点的所要表达的核酸序列。根据需要， 还使用在载体内可插入两种盒的载体，如上所述的多个功能可附加地进行序列 化。插入于重组载体的基因可使用表达用大肠杆菌菌株BL21(DE3)等，但可根据 插入的载体的种类而不同。只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，就可以 容易选择这种载体及表达菌株。
(12)作为延迟醌型结构物质高分子化为黑色素，且使醌型物质可有效地还原 为儿茶酚型结构物质的还原剂，可使用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)、L- 抗坏血酸、谷胱甘肽(glutathione)、半胱氨酸(cystein)、异种儿茶酚型结构物质、 苯或单酚型结构物质等，作为异种儿茶酚型结构物质，可使用儿茶酚、3-甲基儿 茶酚、4-甲基儿茶酚、咖啡酸(caffeicacid)、邻苯三酚或儿茶酚紫等。并且，作为 单酚型结构物质，可使用苯酚、大豆甙元、染料木素、对香豆酸等。
(13)作为用于使酪氨酸酶重新激活的、可靠近活性部位的还原剂，可使用羟 胺、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)、抗坏血酸或其他儿茶酚型物质等。
表达法1：酪氨酸酶的表达
通过聚合酶链式反应使来源于巨大芽孢杆菌(BMT，Bacillusmegaterium)和来 源于除虫链霉菌(SAV，放线菌，Streptomycesavermitilis)的酪氨酸酶脱氧核糖核 酸序列扩增之后，分别放入pet28a或petDuet载体之后，对此，在大肠杆菌(E.coli) 中，如组氨酸标记(histag)(6个组氨酸)所示地分别进行了表达。表达方法如下。 向BL21感受态细胞(competentcell)转化插入有酪氨酸酶碱基序列的质粒之后，分 别在包含适合质粒的抗生素的LB固体培养基中，在37℃培养基中进行了培养。 在5mL的包含抗生素的LB液体培养基中接种一个菌落，并在37℃培养器中， 以200rmp速度培养8小时。将其重新在包含50mL的抗生素的新的液体培养基 中接种了1v％(500uL)。若细胞光密度600nM达到0.6，则放入2mM的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和1mM的CuSO4，并在18℃培养器中，以200rpm的 速度，将蛋白质表达诱导了17小时。17小时之后，以4000rpm的速度对细胞进 行离心分离，并利用5mL的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗来准备。清洗之后，在三(羟 甲基)氨基甲烷缓冲液或硼酸缓冲液中进行了全细胞反应，并以超声波处理的方式 准备了除外的细胞提取物。体外(Invitro)全细胞反应直接使用细胞提取物中的水 溶体部分，或利用了以常用组氨酸标记(6-histag)纯化法纯化的蛋白质，并在各个 实施例中具体且明确地示出。
反应法1：利用酪氨酸酶和还原物质的儿茶酚型结构物质的生产方法
使获取的上述微生物或生产的酪氨酸酶提取物或纯化的酪氨酸酶和如图1的 a的单酚型结构物质进行反应，来生产了如图1的b的儿茶酚型结构物质。在反 应中，添加还原剂来抑制图1的c物质之后的生产过程。
相对于单酚型结构物质的浓度，添加的还原剂的浓度优选为1至100倍，更 优选为5至30倍，尤其优选为7至13倍。在反应中，添加与生成的儿茶酚可形 成配位键的物质，来从酪氨酸酶的第二次氧化反应得到保护。
相对于单酚型结构物质的浓度，添加的配位键前体的浓度优选为1至10000 倍，更优选为50至600倍，尤其优选为100至500倍。
本发明的反应温度优选为2至80℃，更优选为20至70℃，尤其优选为20 至40℃。
反应液的pH优选为5至11，更优选为5至11，尤其优选为7至9。如图3 所示，每个酪氨酸酶的反应速度不同，根据其基质特异性，使用了酪氨酸酶。
以实施例对本发明的具体方法进行详细说明，但本发明的技术范围并不限定 于实施例。在以下实施例中，若没有特别的提及，则所有百分比以最终组合物的 100重量百分比为基准。
实施例1
根据pH的初始基质(单酚型结构物质)的溶解度变化
作为异黄酮系列的大豆甙元(daidzein)具有对水低的溶解度，因而在常温条件 下的中性的水或缓冲液中，存在0.1％的二甲基亚砜(DMSO)的情况下，可溶解 300uM左右。但是，可确认如下：在利用高浓度的硼酸缓冲液的情况下，随着 pH变高，溶解度增加，在pH9中，以5mM水平，溶解度增加十倍以上，在pH10 中，以30mM水平，溶解度增加100倍。酪氨酸酶与其他单加氧酶不同，在广的 pH中具有活性，从而可使用高浓度的初始基质来提高反应生产率。
在作为酪氨酸酶活性范围的pH9中，5mL的、包含300μM的大豆甙元及 100nM的酪氨酸酶的体外(invitro)反应每小时生产15mg的3’-邻羟基大豆甙元， 相反，5mL的、包含pH9的硼酸缓冲液中的1μM的大豆甙元及100nM的酪氨酸 酶的体外(invitro)反应每小时生产45mg的3’-邻羟基大豆甙元，其生产率可增加 三个左右。将其明确示于图7a及图7b中。
实施例2
根据还原剂的儿茶酚型结构物质收率比较实验
不破碎表达了根据明确示出的上述表达法1培养的来源于除虫链霉菌的酪氨 酸酶的细胞，而只清洗细胞，并添加0.1mM的白藜芦醇、1mM的多种还原剂(还 原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、L-抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、羟基醌、1-萘 酚、对香豆酸、姜黄素、儿茶酚、邻苯三酚或阿魏酸)来生产了白皮杉醇。反应后， 利用同量的乙酸乙酯(EA，ethylacetate)或非极性溶剂来提取之后，用高性能-液相 层析定量分析，来比较基于还原剂添加的白皮杉醇生产效率，并将其明确示于图 2中。
实施例3
儿茶酚型结构物质的配位键
如反应法1，利用200nM的纯化的来源于骨髓移植(BMT)的酪氨酸酶，来使 500uM的大豆甙元进行羟基化反应，此时，放入硼酸来诱导配位键。如图5的(a) 部分所示，通过高性能-液相层析确认到在碱性反应液中形成配位键的3’-邻羟基 大豆甙元具有亲水性，因而不提取为有机溶剂。并且，在图5的(b)部分中确认到 处理2M的HCl时，配位键被解除，并检测到200uM的3’-邻羟基大豆甙元。
并且，利用纯化的300nM的骨髓移植酪氨酸酶，还使1mM的染料木素和芹 菜素进行羟基化反应，如图6所示，通过高性能-液相层析确认到羟基化的二羟四 氢黄酮和木犀草素也在碱性反应液中形成配位键，来在有机溶剂中不未被提取， 若在酸性反应液中解除配位键，则在有机溶剂中被提取。
实施例4
酪氨酸酶的失活防止
对在表达法1中培养的酪氨酸酶进行组氨酸标记纯化，并在反应中添加了 100nM的酪氨酸酶，为了防止酪氨酸酶的失活，放入羟胺或抗坏血酸进行激活。 此时，相对于基质，添加的羟胺或抗坏血酸的浓度为1至100倍，更优选为3倍 至50倍，尤其优选为10倍至20倍。通过这种组成，根据反应法1，使1mM的 大豆甙元进行反应，并按时间利用4倍的乙酸乙酯(ethylacetate，EA)或非极性溶 剂来提取100uL的反应物之后，利用高性能-液相层析进行定量分析。根据定量 分析结果，在反应6小时时，以100％收率生产了1mM的3’-邻羟基大豆甙元， 并将其示于图7a中。
以相同的方法，诱导了染料木素(genistein)及白藜芦醇(resveratrol)的位置特异 性羟基化反应，如上所述的单酚型物质可通过酪氨酸酶的第一次羟基化反应生物 转化为功能性儿茶酚型结构物质。染料木素在反应1小时时，生物转化为95％的 二羟四氢黄酮(orobol)，白藜芦醇在反应1小时时，生物转化为100％的白皮杉醇 (piceatannol)。将其示于图8及图9中。
实施例5
生成的儿茶酚型结构物质的分离纯化法
为了分离在实施例4中生成的儿茶酚型结构物质，利用生成物和反应物的溶 解度。在碱性缓冲液中，进行反应而生成的儿茶酚型物质形成配位键，从而提高 亲水性(图10的1部分)。不形成配位键体的单酚型结构物质在反应体积4倍数的 乙酸乙酯(ethylacetate，EA)中被提取，如图10的2部分所示，有机溶剂和水层因 比重差异而区分层。利用滴定管对上述有机溶剂和水层进行分离，来分离图10 的3-1(水层)和3-2(有机层)，并使分离的有机层蒸发，来使残留在其内的单酚型 结构物质可重新使用于反应中。水层利用1M的HCl来降低pH，并利用4倍数 的乙酸乙酯(ethylacetate，EA)来重新提取了儿茶酚型结构物质(图10的4部分)。 提取之后，利用滴定管分离了酸性反应液层。就乙酸乙酯(ethylacetate，EA)层而 言，利用真空蒸发器(vacuumevaporator)去除乙酸乙酯(ethylacetate，EA)，且可取 得纯化的粉形态的儿茶酚型结构物质。
实施例6
利用酪氨酸酶的羟基化反应生成物的质量分析
利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对在实施例5中生成的多个功能性儿茶 酚型结构物质进行定性分析，其结果明确示于图11中。
具体地，图11a表示利用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析从大豆甙元 (daidzein)生成的3’-邻羟基大豆甙元(3’-ODI)的结果，由1表示的保留时间 (retentiontime)18.18分为通过气相色谱法(GC)分离的3’-邻羟基大豆甙元，由a 表示的486.48、m/z为分子量(TMS)的m/z，由b表示的471.50、m/z为分子量 (TMS)-15的m/z，由c表示的383.39、m/z为分子量(TMS)-103的m/z，上述结果 可参照现有论文(HydroxylationofdaidzeinbyCYP107H1fromBaciilussubtilis 168，JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，Vol59，issue4，August2009， Pages248-253)确认为3’-邻羟基大豆甙元。
图11b表示利用气相色谱-质谱联用仪分析从白藜芦醇(trans-resveratrol)生成 的白皮杉醇(piceatannol)的结果，由1表示的保留时间(retentiontime)14.82分为通 过气相色谱法分离的白皮杉醇，由a表示的532.53、m/z为分子量(TMS)的m/z， 由b表示的517.45、m/z为分子量(TMS)-15的m/z，上述结果可参照现有论文(The cancerpreventativeagentresveratrolisconvertedtotheanticanceragentpiceatannol bythecytochromeP450enzymeCYP1B1，BritishJournalofCancer(2002)86， 774-778)确认为白皮杉醇。
实施例7
高分子上单酚型物质向儿茶酚型结构物质的生物转化：向贻贝蛋白质的摹仿
为了将高分子上的酪氨酸残基有效地生物转化为多巴残基，利用除虫链霉菌 酪氨酸酶。具有(VPGYG)12(VPGVG)24的共180个氨基酸序列的弹性蛋白样多 肽(ELP，elastinlike-polypeptide)将以下弹性蛋白样多肽Y以0.5重量百分比在 300uL的pH9的50mM的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中溶解之后，放入2mM的 FeCl3和抗坏血酸、500nM的除虫链霉菌酪氨酸酶，并反应两小时之后，利用1M 的NaOH和1M的HCl来改变pH。在pH5中溶解的弹性蛋白样多肽_Y在pH7 中，以粉的形式沉淀。确认到在将pH调节为11的情况下，弹性蛋白样多肽_Y 进行凝胶化(gelation)。确认到在重新降低pH的情况下，形成的水凝胶(hydrogel) 溶解，从而是具有可逆性的反应。这是与摹仿贻贝蛋白质的功能的以前的论文相 一致的结果(ProcNatlAcadSciUSA.201115，108(7)，2651-2655)。
产业上的可利用性
本发明可利用酶反应来实现功能性儿茶酚型结构物质的批量生产，且可适用 于新材料/功能性原料及医疗用产品的生产。具体地，本发明根据酪氨酸酶基质特 异性，概括从多种单酚型结构物质向功能性儿茶酚型物质的羟基化反应，可实现 现有的难以提取或难以进行有机化学合成的儿茶酚型结构物质的生产，从而可贡 献于其生理学功效实验。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征 在于，包括以下步骤(a)至步骤(c)：
步骤(a)，导入还原力来使通过酪氨酸酶的过氧化反应生成的醌型结构物质还原为 儿茶酚型结构物质；
步骤(b)，利用过渡金属离子或硼离子使生成的儿茶酚型结构物质形成配位键； 以及
步骤(c)，导入还原力来使甲硫氨酸-酪氨酸酶激活。
2.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物 质的方法，其特征在于，在步骤(a)或步骤(c)中使用的还原力从选自由电化学、还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、抗坏血酸、半胱氨酸、 对香豆酸、羟胺、儿茶酚、邻苯三酚及咖啡酸组成的组中的物质提供。
3.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物 质的方法，其特征在于，单酚型结构物质选自由酪氨酸氨基酸、酪醇、白藜芦醇、大 豆甙元、染料木素、芹菜素、根皮素、苯酚、对香豆酸、对硝基苯酚、对甲酚、对乙 烯基苯酚及邻氨基苯酚组成的组中。
4.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物 质的方法，其特征在于，儿茶酚型结构物质选自由木犀草素、3-羟基根皮素、3’-邻羟 基大豆甙元、二羟四氢黄酮、白皮杉醇、羟基酪醇、多巴、咖啡酸、3，4-二羟基硝 基苯、3，4-二羟基甲苯及3，4-二羟基苯乙烯组成的组中。
5.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质 的方法，其特征在于，还包括分离纯化儿茶酚型结构物质的步骤(d)，在上述步骤(d)中， 在有机溶剂中溶解包含儿茶酚型结构物质的生成物来取得水层，降低取得的水层的pH 之后，还在有机溶剂中溶解来取得有机层，并使有机层蒸发来取得儿茶酚型结构物质。
6.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物 质的方法，其特征在于，单酚型结构物质为高分子上的酪氨酸残基。
7.一种高分子交联反应方法，其特征在于，利用通过权利要求6所述的利用酪 氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法来制备的儿茶酚型结构物质。