技术领域
本发明涉及生物信息学技术领域，尤其是涉及一种PI3K/Akt信号通路在鸡胚成纤维细胞内对马立克氏病毒增殖的应用及其检测方法。
背景技术
马立克氏病(Marek′s disease,MD)是由鸡的马立克氏病毒(Marek′s disease virus,MDV)引起的鸡的一种肿瘤性疾病，以淋巴细胞增生和肿瘤的形成为主要特征，以外周神经、生殖腺、脏器、免疫器官中单核细胞浸润以及由于外周神经肿瘤细胞的集聚而引起的半瘫痪或完全瘫痪为典型特征。马立克氏病毒是一种严格的细胞结合性病毒，其亲淋巴特性与γ疱疹病毒相似，但是其分子结构和基因组成与α疱疹病毒类似。随着马立克氏病毒疫苗的免疫压力，近年来，马立克氏病毒有增强的趋势，不断有报道超强毒株突破现有疫苗CVI988的免疫保护，因此亟需研究MDV的致病机制以更有效的防治马立克氏病。
PI3K/Akt信号转导通路作为细胞内重要的信号转导通路，能够调控细胞内的多种生物学活动，包括细胞代谢、凋亡、存活、增殖等，对细胞的凋亡和存活具有重要的调节作用。Akt作为PI3K/Akt信号转导通路的关键分子，在促进细胞生存、生长、增殖；促进细胞运动、侵袭和转移；抑制细胞凋亡方面起核心作用。PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤组织有Akt的过度表达和活化。然而，目前关于PI3K/Akt信号通路在鸡的马立克氏病毒感染中作用的研究还未见报道。
因此，探索马立克氏病毒(MDV)体外感染鸡胚成纤维细胞(CEF) 是否活化PI3K/Akt通路，研究PI3K/Ak通路的上下游作用分子在MDV感染CEF过程中的作用，以及PI3K/Akt信号通路对病毒复制的影响。阐明病毒感染与细胞间的相互作用机制，对于进一步揭示MDV的致病机制和提出新的抗病毒策略的提出具有积极的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用，所述应用证明可以通过抑制PI3K/Akt 信号通路，进而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达，该应用对于进一步揭示MDV的致病机制和提出新的抗病毒策略的提出具有积极的意义。
本发明的第二目的在于提供一种PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用的检测方法，所述检测方法包括免疫印记法、病毒滴定法和DNA分子水平检测法，上述检测方法为证明通过抑制 PI3K/Akt信号通路，从而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达的作用机理提供了最直接的证据。
本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用。
进一步的，所述应用为通过抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达。
进一步的，所述马立克氏病毒的感染菌株为马立克氏病毒超强毒株 Md5。
进一步的，所述抑制PI3K/Akt信号通路的抑制剂为LY294002。
更进一步的，所述PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的浓度为 20μmol/L。
本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用的检测方法，所述检测方法包括免疫印记法、病毒滴定法和DNA分子水平检测法。
进一步的，所述免疫印记检测法包括以下步骤：
(a)、将鸡胚成纤维细胞培养成单层细胞后加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002，随后接种Md5株病毒，然后分别收集接种后0.5～60小时的培养细胞，最后将收集的细胞裂解得到蛋白样品；
(b)、使用BCA方法测定步骤(a)蛋白样品的蛋白含量，随后取 10～30μg蛋白样品依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、TBS洗涤、一抗孵育、二抗孵育，然后用红外荧光扫描成像分析Akt磷酸化水平。
进一步的，所述病毒滴定法包括以下步骤：将鸡胚成纤维细胞接种至细胞培养板上，待长满后加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002，再将 Md5株病毒分别接种于细胞培养板，35～40℃、3～8％CO2培养，并在24～96h 分别进行噬菌斑形成单位计数。
进一步的，所述DNA分子水平检测法包括以下步骤：首先，将鸡胚成纤维细胞培养成单层细胞后加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002，随后接种Md5株病毒，并在孵育24h、48h、72h、96h分别提取细胞DNA，然后采用TaqMan探针法进行荧光定量PCR分析。
更进一步的，所述检测马立克病毒基因的引物为：
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用，所述应用证明可以通过抑制PI3K/Akt信号通路，进而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达，该应用对于进一步揭示 MDV的致病机制和提出新的抗病毒策略的提出具有积极的意义。
本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用的检测方法，所述检测方法包括免疫印记法、病毒滴定法和DNA分子水平检测法，上述检测方法为证明通过抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达的作用机理提供了最直接的证据。本发明不但优化了适用于检验MDV感染激活PI3K/Akt 信号通路的免疫印记实验方法，还优化了鸡马立克氏病毒DNA分子水平检测的PCR反应体系和条件。本发明提供的检测方法具有特异性高，灵敏性强和重复性好的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的PI3K特异性抑制剂对鸡胚成纤维细胞的毒性检测图；
图2为本发明实施例2提供的Western blot检测结果图；
图3为本发明实施例3提供的PI3K特异性抑制剂抑制马立克氏病毒增殖的病毒滴定结果图；
图4为本发明实施例4提供的PCR检测LY294002抑制马立克氏病毒基因转录的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用。
本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用，所述应用证明可以通过抑制PI3K/Akt信号通路，进而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达，该应用对于进一步揭示 MDV的致病机制和提出新的抗病毒策略的提出具有积极的意义
在本发明的一种优选实施方式中，所述应用为通过抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达。
在本发明的一种优选实施方式中，所述马立克氏病毒的感染菌株为马立克氏病毒超强毒株Md5。
在本发明的一种优选实施方式中，所述抑制PI3K/Akt信号通路的抑制剂为LY294002。
作为一种优选的实施方式，LY294002是一种常用的phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)抑制剂。LY294002可以通透细胞，特异性抑制PI3K，抑制PI3K/Akt信号途径，包括常见的抑制Akt磷酸化等。
在上述优选实施方式中，所述PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的浓度为20μmol/L。
根据本发明的一个方面，PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用的检测方法，所述检测方法包括免疫印记法、病毒滴定法和DNA分子水平检测法。
本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用的检测方法，所述检测方法包括免疫印记法、病毒滴定法和DNA分子水平检测法，上述检测方法为证明通过抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达的作用机理提供了最直接的证据。
在本发明的一种优选实施方式中，所述免疫印记检测法包括以下步骤：
(a)、将鸡胚成纤维细胞培养成单层细胞后加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002，随后接种Md5株病毒，然后分别收集接种后0.5～60小时的培养细胞，最后将收集的细胞裂解得到蛋白样品；
(b)、使用BCA方法测定步骤(a)蛋白样品的蛋白含量，随后取 10～30μg蛋白样品依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、TBS洗涤、一抗孵育、二抗孵育，然后用红外荧光扫描成像分析Akt磷酸化水平。
在本发明的一种优选实施方式中，所述病毒滴定法包括以下步骤：将鸡胚成纤维细胞接种至细胞培养板上，待长满后加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002，再将Md5株病毒分别接种于细胞培养板，35～40℃、3～8％ CO2培养，并在24～96h分别进行噬菌斑形成单位计数。
在本发明的一种优选实施方式中，所述DNA分子水平检测法包括以下步骤：首先，将鸡胚成纤维细胞培养成单层细胞后加入PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002，随后接种Md5株病毒，并在孵育24h、48h、72h、96h 分别提取细胞DNA，然后采用TaqMan探针法进行荧光定量PCR分析。
在上述优选实施方式中，所述检测马立克病毒基因的引物为：
引物 引物序列(5’→3’) 上游引物MF CCTAACGGTGACCCTTGGAC 下游引物MR GGACAAAGCTGAGCGTAAACC 探针MP CTGAACCTCCCATTTGCACTCCTCCAC
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1细胞毒性检测
本实施例检测不同浓度PI3K特异性抑制剂LY294002对鸡胚成纤维细胞毒性的影响，具体步骤如下：
(1)、使用DMEM培养基将PI3K特异性抑制剂LY294002配制为 5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，30μmol/L，50μmol/L的不同浓度；
(2)、同时在96孔板接种100μL/孔的鸡胚成纤维细胞悬液，待细胞铺满单层后，弃培养液，用PBS洗涤两次，加入新的含有2％FBS的DMEM 培养液，随后，分别将上述步骤(1)不同浓度的抑制剂分别加入96孔板，每孔10μL，每个浓度重复8孔，并加入等量的0.1％DMSO作为对照；
(3)、将加入抑制剂后的孔板于5％CO2，37℃培养箱中孵育24h；孵育后每孔加入CCK-8溶液10μL，培养箱内继续培养2h，随后使用酶标仪检测450nm处的吸光值，其结果如图1所示。
由图1可知，当抑制剂浓度为5、10、20μmol/L对鸡胚成纤维细胞活性影响较小；但当抑制剂浓度为30μmol/L时，细胞活性显著降低。因此，由本实施例可知，采用20μmol/L抑制剂是对细胞活性影响最小的最高浓度，可以作为后续实验使用浓度。
实施例2免疫印记检测
(1)、蛋白提取：将鸡成纤维细胞在35mm×10mm的无菌培养皿中，用含10％新生牛血清的DMEM营养液培养成单层细胞后加入20μmol/L的抑制剂LY294002；
随后，接种2×105PFU病毒量的Md5，收集接毒后的不同时间段(0.5、 1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48、60h)的样品，用4℃预冷的 PBS洗涤两次，吸净PBS洗液，加入200μL含5％蛋白酶抑制剂(PMSF) 的RIPA蛋白裂解液，于冰上放置10min，用细胞刮刮取细胞，吸至新的 1.5mL离心管中，用1mL注射器抽打数次，4℃12000rpm离心10min，取上清，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮样5min，使蛋白变性，提取得到鸡成纤维细胞总蛋白，同时使用BCA蛋白浓度测定总蛋白浓度；
(2)Western blot鉴定：在SDS-PAGE电泳胶中加入10～30μg蛋白样品，恒压80V 30min，蛋白样品跑至下层分离胶时改恒压120V 60min，待蛋白Marker均匀分散且目的蛋白分离后，停止电泳；切除蛋白胶多余部分，剪取适当大小的NC膜，将蛋白胶小心铺在三层滤纸之上，并用NC膜完全覆盖住蛋白胶，再在NC膜上覆上三层滤纸，仔细赶走每层的气泡，恒压 60V湿式转膜70min；
转膜结束后，小心取出NC膜，用TBS溶液洗净膜上的转膜缓冲液，用TBST溶液配制5％BSA作为封闭液，室温封闭2h。TBST洗涤3次(5min/ 次)，含5％BCA的PBST稀释目的蛋白抗体，稀释比例为1:1000，一抗兔抗p-Akt(Ser473)、Akt、内参抗体GAPDH，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次 (10min/次)，加入IRDye 800DX偶联抗兔Ig G(稀释比为1:10000)，避光室温孵育1h。TBST洗涤3次(10min/次)，用Odyssey红外荧光扫描成像系统观察，其结果如图2所示。
由图2可知，在马立克氏病毒感染后4-6h，Akt磷酸化水平明显上调，由此可见，Md5毒株感染鸡成纤维细胞能够诱导Akt磷酸化水平升高。当使用20μmol/L的PI3K特异性抑制剂LY294002处理后，Md5病毒感染鸡呈纤维细胞中Akt的磷酸化水平达到最低，可见Md5感染激活细胞内的Akt 依赖PI3K路径，即Md5病毒可以通过PI3K途径激活鸡呈纤维细胞中的 Akt。
实施例3病毒滴定测定
将鸡成纤维细胞接种至两个96孔板，长满单层后弃液，用PBS洗涤两次，加入新的含有2％FBS的DMEM培养液，先将其中一个孔板每孔加入 LY294002抑制剂孵育1h，再将病毒液用含有2％FBS的DMEM培养液做连续2倍稀释，每个稀释度分别接种8孔，同时将另一个孔板设2列不接种病毒作为空白对照。37℃、5％CO2培养，在24h、48h、72h、96h分别进行PFU计数，其结果如图3所示。
由图3可知，与未加入LY294002抑制剂的细胞相比，加入LY294002 抑制剂处理鸡呈纤维细胞中病毒滴度明显降低。
实施例4DNA分子水平检测
首先，将鸡成纤维细胞在35mm×10mm的无菌培养皿中，用含10％新生牛血清的DMEM营养液培养成单层细胞，随后将细胞随机分为抑制组、非抑制组和对照组，待细胞长满单层后，弃培养液，用PBS洗涤两次，加入新的含有2％FBS和1％双抗的DMEM培养液，其中：
抑制组加入浓度为20μmol的LY294002抑制剂孵育1h，
抑制组和非抑制组同时接种2×105PFU病毒量的MDV，在接毒后的不同时间段(24、48、72、96h)提取DNA，
以未接毒的细胞作为对照组同样提取DNA；
然后使用DNA提取试剂盒提取的样本DNA作为模板按照下表1的引物体系进行荧光定量PCR反应，每个样本做三个重复，反应条件为两步法的PCR反应程序：95℃预变性2min，95℃变性10sec，60℃退火20sec， 40个循环，其结果如图4所示。
表1：所述检测马立克病毒基因的引物体系
由表4可知，加入PI3K抑制剂后Md5病毒RNA复制受到明显抑制，由此可见阻断PI3K对马立克氏病毒的入侵具有抑制作用。上述研究结果表明，PI3K对马立克氏病毒在宿主细胞中的复制增殖具有明显的促进作用。
综上所述，本发明提供的PI3K/Akt信号通路在抑制鸡胚成纤维细胞中马立克氏病病毒增殖的应用，所述应用证明可以通过抑制PI3K/Akt信号通路，进而抑制马立克氏病毒在鸡胚成纤维细胞内的增殖表达，该应用对于进一步揭示MDV的致病机制和提出新的抗病毒策略的提出具有积极的意义。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。