技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，涉及lncRNA作为分子标志物在胃癌诊断中的应用，尤其涉及lncRNA中的ZFPM2-AS1在制备胃癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
胃癌是我国主要的疾病负担之一。目前胃癌常用的治疗手段包括外科手术、放疗、化疗及靶向治疗等，但上述治疗方式对进展期胃癌的治疗仍然有限。
研究胃癌发生发展过程中的分子生物学基础发现，相应的诊断和治疗分子标志物具有重要的临床意义。长链非编码RNA是非编码RNA的一种，定义为长度大于200bp的非编码RNA。以往lncRNA并未受到研究者的重视，被认为是转录过程中的“噪音”。近年来，不断有研究证据表明lncRNA在包括肿瘤在内的多种疾病中发挥重要作用，其中在肿瘤中意义受到越来越多的认可。
研究证实LncRNA能够通过多种机制对细胞功能进行调控。lncRNA能作为顺式作用元件直接影响下游基因表达，或者通过形成RNA-RNA、RNA-DNA复合物影响目的基因的表达过程，或者通过RNA干扰降解mRNA或者蛋白。通过上述机制，lncRNA影响基因的表达和蛋白活性，进而改变细胞的生物学状态，影响肿瘤的发生和发展。
与正常细胞相比，肿瘤细胞中的lncRNA表达谱差异显著，并参与了肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、耐药等多种恶性生物学行为。近年来LncRNA被证实存在高度的种属和器官特异性，提示其作为肿瘤诊断标志物的潜能(如前列腺癌中的DD3)，并有望成为新的肿瘤治疗靶点。但是，相对于miRNA，lncRNA作为诊断标志物的研究仍处于初级阶段。
研究发现许多分泌型和循环型lncRNA在肿瘤患者的体液中(如尿液、血浆)表达水平显著升高。研究发现结直肠癌患者血浆中的HOTAIR显著高表达，且HOTAIR在血浆样本和肿瘤组织中的表达水平高度一致。有研究在食管癌患者中也得到了类似的结论：肿瘤患者血浆中HOTAIR较健康人显著升高，但手术治疗后表达水平显著下调。上述发现提示血浆HOTAIR可以反映其在肿瘤内的表达水平，标志肿瘤的发生。研究者检测前列腺癌患者尿液中的PCA3水平后发现，PCA3的具有良好的前列腺癌诊断潜能，且诊断效能显著优于传统的PSA指标。一项纳入57例患者的研究表明HULC在肝癌患者血液中高表达，且具有显著的器官和肿瘤特异性。
ZFPM2-AS1，位于基因组GRCh38.p7，GENE ID为102723356,经验证为不具有编码蛋白能力的长链RNA。目前有关ZFPM2-AS1的研究极少。既往全转录组测序发现正常组织中ZFPM2-AS1在子宫内膜、膀胱等组织中相对高表达，在胃、胰腺等多种组织中相对低表达(PMID 24309898)。
因此，寻找胃癌早期lncRNA标志物，进一步了解lncRNA在胃癌早期病变中的生物学功能具有重要意义。目前尚无ZFPM2-AS1应用于胃癌诊断的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供胃癌的诊断标志物，本发明的目的也在于提供LncRNA中的ZFPM2-AS1的新用途，即在制备胃癌诊断试剂盒中的应用。
本发明的第一方面，提供了ZFPM2-AS1作为胃癌诊断标志物的应用。
本发明的第二方面，提供了ZFPM2-AS1在制备胃癌诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
本发明所述的ZFPM2-AS1在制备胃癌诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，所述的诊断试剂为检测生物样品中ZFPM2-AS1含量的试剂。
所述的诊断试剂盒，包含了检测生物样品中ZFPM2-AS1含量的试剂。
所述的检测生物样品中ZFPM2-AS1的含量的试剂，选自：对ZFPM2-AS1具有检测特异性的PCR引物。
所述的对ZFPM2-AS1具有检测特异性的PCR引物如下：
所述的生物样品选自：获自对象的外周血。
本发明的第三方面，提供了一种胃癌的诊断试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中ZFPM2-AS1含量的试剂。
本发明所述的胃癌诊断试剂盒由逆转录系统、引物系统和扩增系统组成，所述的引物系统包括如SEQ ID NO:1～4所示的PCR引物。
本发明的第四方面，提供了一种利用上述诊断试剂盒进行胃癌检测的方法，如下：
A.将待检血液样本常温离心，获取血浆，提取血浆中的总RNA并测定血浆纯度；
B.对步骤A中的总RNA进行逆转录，得到cDNA；
C.采用实时定量PCR技术对ZFPM2-AS1的拷贝数进行定量检测，检测过程中所用引物如SEQ ID NO:1～4所示。
数据均采用SPSS16.0处理，采用平均值±标准差的方式表示。
通过生物信息学分析，发现ZFPM2-AS1在胃癌中显著高表达。实验证明过表达ZFPM2-AS1可显著提高胃癌细胞的增殖和侵袭转移能力，抑制ZFPM2-AS1的体内表达可抑制肿瘤细胞的恶性表型，从而达到抑制胃癌的效果。上述结果提示ZFPM2-AS1在胃癌细胞中的特异性和灵敏性高，具有明确的促癌的生物学功能，可应用于胃癌诊断或胃癌治疗。
本发明的第五方面，提供了ZFPM2-AS1在制备治疗胃癌药物中的应用。
所述的药物为抑制或沉默ZFPM2-AS1表达的试剂。具体为ZFPM2-AS1的干扰RNA，在本发明的优选实施例中，所述的ZFPM2-AS1的干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5或6所示。
本发明的有益保障及效果如下：
申请人从合作医院取得了大量的胃癌病人的外周血标本，为本发明的研究提供了有力的保障。
就技术而言，ZFPM2-AS1的检测本质上是一种血液基因组的定量PCR检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。
我们所采用基本检测方法是定量PCR，这一技术在现代实验诊断学中已被证实是高灵敏度、高准确度的检测方法，试验技术已经十分成熟，并且我们采用的是这一技术中的标准曲线定量法，可以准确地对各种样品中特点核酸分子做精确定量。
此外，本发明所涉及的指标ZFPM2-AS1在癌组织中ZFPM2-AS1的表达显著上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)，其临床参考价值和可信度较高，不仅能够提高家族性胃癌的检出率和准确率，对于家族性胃癌的临床治疗有着重大的意义，而且只需要采集检测者的血液即可获得检测结果，也避免了采用影像学手段进行检查时，患者需根据检测设备的要求提前进行准备的麻烦以及受到仪器辐射危害的风险。
本发明提供了一种以定量PCR为基础的胃癌检测试剂盒，可以通过检测病人外周血基因组RNA中ZFPM2-AS1的表达丰度来对胃癌做出诊断。其检测方法特别简便、周期短、灵敏度高，是现行检测试剂的有效补充。
附图说明
图1是本发明中采用qPCR检测ZFPM2-AS1基因在胃癌和非胃癌组织中的表达情况结果图；
图2是本发明中采用qPCR检测ZFPM2-AS1基因在正常胃上皮细胞和胃癌细胞中的表达情况结果图；
图3是本发明中采用qPCR检测ZFPM2-AS1基因过表达载体在胃癌细胞中的转染效率结果图；
图4是本发明采用CCK8方法检测ZFPM2-AS1基因对胃癌细胞增殖的影响图。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
实施例一胃癌与非癌组织中ZFPM2-AS1的表达水平检测
1、样品收集
分别收集胃癌与癌旁组织样本73对，放置于-80℃冰箱中。全部病例在手术前均未接收放化疗，所有患者均签署知情同意书，该实验方案取得本单位伦理委员会同意。
2、总RNA提取
1)从-80℃冰箱中取出临床标本，置于冰上。称取25mg组织放置于2ml离心管中，并置于冰上，离心管中加入1mlTrizol，使用手持式自动组织匀浆机处理至无固体成分，室温静置10min。
2)4℃，13000rpm离心10min。
3)移液器吸去上清液至干净的RNase-Free的1.5mL离心管中。
4)加入0.2ml的三氯甲烷，用旋涡混合器震荡，室温静置10min。
5)4℃，3000rpm离心10min。
6)用移液器取水相并转移至1.5ml RNase-Free的1.5ml离心管中。
7)加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-40℃静置30min。
8)4℃，13000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇0.5ml，再次混匀。
9)4℃，13000rpm离心10min，弃上清。
10)低速离心并吸弃残余液体，加入20μlRNase-Free水，将沉淀充分溶解。
3、总RNA定量与纯度分析
使用紫外分光光度计测定RNA在260nm和280nm处的光密度值，当OD260/OD280在1.8-2.0范围内认为RNA的纯度是可靠的。
4、采用RT-qPCR方法验证ZFPM2-AS1在胃癌与癌旁组织中的表达差异
4.1逆转录反应
反应体系如表1所示：
表1逆转录反应体系
反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，反应结束。将产物cDNA进行下一步操作或置于-20℃保存。
4.2引物的合成与设计
ZFPM2-AS1含量测定过程中所用的引物序列如表2所示：
表2ZFPM2-AS1引物序列汇总
4.3qPCR反应
反应体系如表3所示：
表3RT-PCR反应体系
反应条件为：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；72℃，30s；共45个循环。
4.4统计学分析
所有实验均重复三次，数据均采用SPSS16.0处理，采用平均值±标准差的方式表示。癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，当p<0.05时认为具有统计学差异。
4.5结果
结果如图1所示，与胃癌癌旁组织相比，癌组织中ZFPM2-AS1的表达显著上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2ZFPM2-AS1在胃癌细胞中的表达情况
1、细胞培养
人永生化胃粘膜上皮细胞GES-1、人胃癌细胞系AGS、BCG-823、MGC-803、MKN-28、MKN-45和SGC-7901均使用10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
2、RNA提取
弃去培养基，用PBS清洗2遍后加入适量Trizol，并用移液器反复吹打，加速细胞裂解。其余步骤同实施例1。
3、RT-qPCR
具体步骤同实施例1。
4、结果
结果如图2所示，与胃粘膜上皮细胞相比，胃癌细胞系中ZFPM2-AS1的表达水平显著上调，差异具有统计学差异((P均<0.05)。
实施例3ZFPM2-AS1的表达抑制
1、细胞培养
具体步骤同实施例2。
2、siRNA的设计
采用在线siRNA设计工具设计ZFPM2-AS1的siRNA两条：siRNA#1，SEQ ID NO.5(ctgattaagacggttgaaactag)；以及siRNA#2，SEQ ID NO.6(gacaggttatcaacgaaacttct)。
3、转染
将胃癌细胞AGS分为三组，分别为空白对照组(转染无意义siRNA)，siRNA组#1(转染siRNA#1)和siRNA组#2(转染siRNA#2)。
siRNA浓度为50nM，转染6小时后换液。
4、总RNA提取及ZFPM2-AS1的表达检测与分析
48小时后收取细胞样品，后续具体步骤同实施例2。
5、结果
结果如图3所示，与对照组相比，转染特异性siRNA组的ZFPM2-AS1显著下调，且差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4下调ZFPM2-AS1表达可显著抑制胃癌细胞增殖能力
采用CCK-8(Dojindo，cat#CK04-11)的方法检测ZFPM2-AS1对胃癌细胞增殖能力的影响，步骤如下：
1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
2、各组细胞经胰酶消化重悬、计数后调整细胞浓度，以每孔3000个细胞的总量接种胃癌细胞AGS于96孔板中，每组细胞设立5个副孔。
3、待细胞到达相应时间点(12h，24h,48h,72h,96h)后，按照说明书建议方法处理细胞后用酶标仪在490nm波长测定其吸光度值。
4、统计学分析
同实施例3。
5、结果
结果如图4所示，与对照组相比，siRNA#1和siRNA#2组细胞的增殖能力受到显著抑制。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海长海医院
<120> ZFPM2-AS1在制备胃癌诊断试剂或试剂盒中的应用
<130> 说明书；权利要求书
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctctctgc attcatgtgg t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagttgcaag atgacgctca g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagacgggc ggagagaaac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatggtgtc tgagcgatct 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgattaaga cggttgaaac tag 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacaggttat caacgaaact tct 23