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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510776030.6 (22)申请日 2015.11.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105238726 A (43)申请公布日 2016.01.13 (83)生物保藏信息 CGMCC No.11032 2015.07.02 (73)专利权人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 余向阳冯发运张猛葛静 王琼 (74)专利代理机构 江苏圣典律师事务所 32237 代理人 杨文晰孙忠浩 (51)Int.C。
2、l. C12N 1/20(2006.01) A01N 25/32(2006.01) A01G 7/06(2006.01) A01C 1/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) 审查员 代月函 (54)发明名称 一株克罗诺杆菌及其应用 (57)摘要 本 发 明 公 开 了 一 株 保 藏 号 为 C G M C C No.11032的克罗诺杆菌 （Cronobactersp.） ， 该 菌可制成XFP-gy菌剂， 用于增强农作物中残留毒 死蜱的降解； 相对于现有技术， 该菌可效降解环 境中毒死蜱残留， 并长期定植于农作物根部， 可 增强农作物降解残留毒死蜱的活性， 在不影响。
3、农 作物品质的前提下， 高效降解农药残留， 绿色无 污染； 该菌株对毒死蜱的降解能力极强， 培养方 法简单， 生长速度快， 不易变异， 既可以直接用于 土壤和农药生产废水中毒死蜱的降解， 也可以接 种水稻等作物作为内生菌用于毒死蜱的农残控 制， 适宜广泛推广使用。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105238726 B 2018.09.18 CN 105238726 B 1.一种克罗诺杆菌 （Cronobacter sp.） 在增强农作物残留毒死蜱降解中的应用； 所述克罗诺杆菌保藏编号为CGMCC No. 11032， 菌株为革兰氏阴性， 菌体呈杆状; 所述应用是指： 向农作物接种。
4、XFP-gy菌剂， 用以增强农作物中残留毒死蜱的降解； 所述XFP-gy菌剂是这样获得的： A） 将所述的克罗诺杆菌接种至LB培养基， 30划线、 挑单菌落培养两次后， 挑取单菌落 于菌种活化培养基中， 30， 150-200 rpm摇床振荡培养12-24h， 获得活化菌种； B） 向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种， 接种量为种子培养基体积的1， 25-38 ， 通空气培养16-24h， 得到液体种子； C） 向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子， 接种量为种子培养基体积的1%， 30-35 ， 150 rpm下避光培养至对数生长期， 得到活菌体培养物； D） 取活菌体培养物50 ml于4。
5、 、 5000 rpm下离心15 min， 取沉淀菌体用无菌生理盐水 冲洗3次， 再用无菌生理盐水调节至菌含量为1010cfu/mL， 即获得XFP-gy菌剂； LB培养基： 胰蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 琼脂20g， 加水至1L， 121灭菌20 min； 菌种活化培养基： 胰蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 加水至1L， 121灭菌20 min； 种子培养基： K2HPO4 4.8g， KH2PO4 3.5g，（NH4）2SO4 2g， MgCl2 0.16g， CaCl2 0.02g， Na2MoO4.2H2O 0.0024g， FeCl3 0.0018g，。
6、 MnCl2.2H2O 0.0015g， pH=7.0， 加水至1L， 121灭菌 20 min。 2.如权利要求1所述应用， 其特征在于， 将发芽的种子或农作物根系浸没于XFP-gy菌剂 稀释液中， 浸泡24h后再进行田间移栽； 所述XFP-gy菌剂稀释液是由无菌生理盐水将XFP-gy菌剂稀释至含菌量为103-104cfu/ mL后获得。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105238726 B 2 一株克罗诺杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物领域， 特别是一株可增强农作物中残留毒死蜱降解的克罗诺杆 菌 （Cronobacter sp.） 及其应用。 背景技术 0002 毒死。
7、蜱 （chlorpyrifos） 是美国陶氏益农化学公司于1965年研发出来的一种高效、 低毒、 广谱、 低残留及低抗药性的有机磷杀虫杀螨剂。 有效成分的化学名称为O,O-二乙基- O- (3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯 （O,O-diethyl -O-(3,5,6- trichloro -2- pyridyl， phosphorothioate） 。 毒死蜱在室温及酸性介质中稳定， 在碱性介质中则易分解， 难容于水， 易溶于大多数有机溶剂。 由于高毒有机磷农药被禁用， 毒死蜱作为有效的取代产 品， 在用量和使用范围上越来越大， 在我国广泛应用于水稻防治稻飞虱、 水稻螟虫， 韭菜等 。
8、防治根蛆以及叶菜类蔬菜防治蚜虫、 螨类等害虫， 如目前田间通常使用48%毒死蜱乳油500 -800倍稀释液灌根防治韭菜根蛆； 但是与其他有机磷农药相同， 毒死蜱也存在残留和对生 态环境的潜在威胁性， 在我国由于大量以及不合理的使用， 使得毒死蜱在稻米及蔬菜中的 农残超标， 成为发达国家设置绿色贸易壁垒的重要手段， 对我国对人民健康产及农产品出 口造成重大的影响。 0003 由于毒死蜱在土壤、 水源、 大气及农作物的残留对人类及环境存在的潜在危险性， 为了减少最终农药的摄入量， 保障人们的身体健康与生态环境， 对毒死蜱的消解去除方式 的研究进展也在不断发展。 目前已报道的消解方法大致分类可分为非。
9、生物降解和生物降 解， 非生物降解包括物理方式、 水解、 光解， 生化降解， 这些方法只能清洗或去除农产品表面 的农药残留， 同时还有可能造成农产品外观及品质方面的损害； 而生物降解则有植物修复 降解和微生物降解， 与其他方法相比， 微生物降解农药残留被公认为是一种有效、 安全、 廉 价和无二次污染的方法， 生物修复技术由于具有纯生态过程的显著优越性， 在环境污染尤 其是土壤污染的治理中具有广阔的应用前景， 是目前农药降解研究的重点方向。 发明内容 0004 针对上述问题， 本发明一株由菊科植物小飞蓬中分离得到的， 可增强农作物中残 留毒死蜱降解的克罗诺杆菌株， 在不影响作物生长及农产品安全的。
10、前提下， 可提升韭菜对 毒死蜱的降解能力， 从源头上降低毒死蜱的在农产品中的残留， 本发明是这样实现的： 0005 一株克罗诺杆菌 （Cronobacter sp.） ， 其保藏编号为CGMCC No. 11032； 该克罗诺 杆菌菌株为革兰氏阴性， 菌体呈杆状。 0006 所述保藏编号为CGMCC No. 11032的克罗诺杆菌在增强农作物残留毒死蜱降解中 的应用。 0007 进一步， 本发明所述应用中， 是利用XFP-gy菌剂对农作物进行灌根或浸泡处理， 以 接种克罗诺杆菌XFP-gy， 用以增强农作物中残留毒死蜱的降解； 0008 所述XFP-gy菌剂是这样获得的： 说明书 1/5 页 。
11、3 CN 105238726 B 3 0009 A） 将保藏编号为CGMCC No. 11032的克罗诺杆菌接种至LB培养基， 30划线、 挑单 菌落培养两次后， 挑取单菌落于菌种活化培养基中， 30， 150-200 rpm摇床振荡培养12- 24h， 获得活化菌种； 0010 B） 向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种， 接种量为种子培养基体积的1， 25-38， 通空气培养16-24h， 得到液体种子； 0011 C） 向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子， 接种量为种子培养基体积的1%， 30- 35， 150 rpm下避光培养至对数生长期， 得到活菌体培养物； 0012 D） 取活菌。
12、体培养物50 ml于4 、 5000 rpm下离心15 min， 取沉淀菌体用无菌生理 盐水冲洗3次， 再用无菌生理盐水调节至菌含量为1010cfu/mL， 即获得XFP-gy菌剂； 0013 LB培养基： 胰蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 琼脂20g， 加水至1L， 121灭菌20 min； 0014 菌种活化培养基： 胰蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 加水至1L， 121灭菌20 min； 0015 种子培养基： K2HPO4 4.8g， KH2PO4 3.5g，（NH4）2SO4 2g， MgCl2 0.16g， CaCl2 0.02g， Na2MoO4.2H。
13、2O 0.0024g， FeCl3 0.0018g， MnCl2.2H2O 0.0015g， pH=7.0， 加水至1L， 121灭菌 20 min。 0016 进一步， 本发明所述应用， 是将发芽的种子或农作物根系浸没于XFP-gy菌剂稀释 液中， 浸泡24h后再进行田间移栽； 0017 所述XFP-gy菌剂稀释液是由无菌生理盐水将XFP-gy菌剂稀释至含菌量为103- 104cfu/mL后获得。 0018 相对于现有降解作物中农药毒死稗残留的技术， 本发明获得的克罗诺杆菌可效降 解环境中毒死蜱残留， 并长期定植于农作物根部， 可增强农作物降解残留毒死蜱的活性， 在 不影响农作物品质的前提下。
14、， 高效降解农药残留， 绿色无污染； 该菌株对毒死蜱的降解能力 极强， 培养方法简单， 生长速度快， 不易变异， 既可以直接用于土壤和农药生产废水中毒死 蜱的降解， 也可以接种水稻等作物作为内生菌用于毒死蜱的农残控制， 适宜广泛推广使用。 附图说明 0019 图1为克罗诺杆菌XFP-gy菌落形貌图片； 0020 其中，（a） 为加富培养基培养，（b） 为MSM培养基； 0021 图2为克罗诺杆菌XFP-gy的16S rDNA系统发育示意图。 具体实施方式 0022 以下通过具体实施例详细说明本发明的实施， 目的在于更好地理解本发明的技术 方案， 但不作为对本发明实施范围的限定。 0023 实施。
15、例中所涉及的培养基: 0024 LB培养基： 10 g胰蛋白胨， 5 g酵母膏， 10 g氯化钠， 去离子水 1000 mL； 121灭菌 20 min。 0025 无机盐培养基 （MSM） ： 0.4 g MgSO47H2O， 0.2 g FeSO47H2O， 0.2 g K2HPO4， 0.2 g (NH4)2SO4， 0.08 g CaSO4， 去离子水1000 mL， pH 7.0-7.2。 ， 121灭菌20 min； 说明书 2/5 页 4 CN 105238726 B 4 0026 加富培养基 （固体， 1L） : 0.4 g MgSO47H2O， 0.2 g FeSO47H2O。
16、， 0.2 g K2HPO4， 0.2 g (NH4)2SO4， 0.08 g CaSO4， 1000 mg蛋白胨， 1000 mg牛肉膏， 琼脂20g， 去离子水1000 mL， pH 7.0-7.2， 121灭菌20 min， 用于菌株的斜面保存和平板培养。 0027 菌种保藏培养基 （固体， 1L） ： 胰蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 琼脂20g， 加水至 1L， pH 7.0-7.5； 121灭菌20 min。 0028 菌种活化培养基 （液体， 1L） ： 胰蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 加水至1L， pH 7.0-7.5； 121灭菌20 min。 。
17、0029 种子培养基 （液体， 1L） ： K2HPO4 4.8g， KH2PO4 3.5g，（NH4）2SO4 2g， MgCl2 0.16g， CaCl2 0.02g， Na2MoO4.2H2O 0.0024g， FeCl3 0.0018g， MnCl2.2H2O 0.0015g， pH=7.0； 121 灭菌20 min。 0030 实施例1 筛选菌株 0031 1、 菌株的获得 0032 (1) 样品采集： 0033 2013年6月， 在江苏省农业科学院内废液池旁生长的菊科植物小飞蓬新鲜植株样 本， 用自来水将植株表面附带灰尘泥土冲洗干净， 自然风干， 进行表面消毒： 75%酒精浸泡3。
18、- 5 min， 然后用无菌水冲洗3-4次， 用2.5% NaClO2漂洗2-5 min， 无菌水清洗5次； 0034 (2)菌株分离筛选： 分别取小飞蓬根茎叶进行组织研磨， 吸取汁液均匀涂布于加富 培养基平板上， 于30条件下避光培养2-7天。 0035 (3)菌株富集培养： 待长出菌落后， 挑取单菌落进一步划线于含毒死蜱的无机盐培 养基 （MSM） （毒死蜱含量50mg/L， 该培养基是以毒死蜱为单一碳源） ， 于30条件下避光培养 2-7天， 选取能连续5次在只含毒死蜱 （50mg/L） 作为唯一碳源的MSM上生长的菌株； 0036 (4)毒死蜱降解菌纯化： 采用平板划线分离法纯化， 挑。
19、取在最高浓度下 （毒死蜱 100mg/L） 生长的菌落在富集培养基上划线， 直到分离获得纯培养物。 0037 经上述方法筛选获得1株高效毒死蜱降解菌， 申请人将其自命名为菌株XFP-gy， 其 生理生化特征见表1： 0038 表 1 菌株XFP-gy的生理生化特性 0039 测试项目结果测试项目结果 菌株形态杆状葡萄糖酸盐+ 革兰氏反应-*L-阿拉伯糖+ 接触酶+甘露醇+ 氧化酶-蔗糖+ V-P试验+丙二酸盐- M.R试验-硫化氢生成- 硝酸盐还原-柠檬酸盐+ 明胶液化-吲哚- 苯丙氨酸脱氨酶+精氨酸双水解酶+ 鸟氨酸脱羧酶+赖氨酸脱羧酶+ 0040 *+代表反应呈阳性， -代表反应呈阴性。 。
20、说明书 3/5 页 5 CN 105238726 B 5 0041 经检测该菌株为革兰氏阴性， 杆状菌， 在以毒死蜱为唯一碳源的MSM培养基上 （含 毒死蜱50 mg/L） ， 生长缓慢， 48 h后才可见菌落 （如图1B所示） ， 且菌落细小稀薄， 白色半透 明， 透明水解带清晰可见； 在加富培养基 （含毒死蜱100 mg/L） 上生长较快， 24 h即可见菌落 （如图1A所示） ， 白色半透明， 随培养时间延长， 菌落渐变为黄色， 部分地方呈放射状， 质地光 滑粘稠。 0042 菌株XFP-gy的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库， 登记号为： ： KJ871339，。
21、 其16S rDNA系统发育如图2所示， 在http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用 blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较， 结果表明其与克罗诺杆菌 （Cronobacter sp.） 相似性最高， 可以达到99%以上， 因此确定其为克罗诺杆菌。 0043 申请人于2015年7月2日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 （CGMCC） ， 地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中， 国科学院微生物研究所， 邮 编100101； 其保藏编号为CGMCC No.11032， 分类命名为克罗诺杆菌Cronobactersp.。 0。
22、044 实施例2 制备XFP-gy菌剂 0045 1、 菌种活化： 挑取实施例1获得的克罗诺杆菌XFP-gy至菌种保藏培养基， 30连续 划线、 挑单菌落培养 （每次培养24 h） 两次后， 再挑取单菌落在菌种活化培养基中， 于30， 150-200 rpm摇床振荡培养12-24 h； 0046 2、 液体种子制备： 向装有种子培养基的发酵罐中， 按照种子培养基体积的1接种 量接种步骤1活化后的菌种， 于25-38， 通空气培养16-24 h， 得到液体种子； 0047 3、 液态发酵： 向装有种子培养基的发酵罐中， 接种液体种子， 接种量为培养基体积 的1%， 于30-35， 150 rpm。
23、条件下避光培养4-6h， 得到活菌体培养物； 0048 4、 菌剂制备： 取活菌体培养物50 ml于4 、 5000 rpm下离心15 min， 弃上清液， 取 沉淀菌体， 用0.85%的无菌生理盐水冲洗3次， 用无菌生理盐水调节至含菌量为1010cfu/mL， 即获得XFP-gy菌剂； 加入无菌甘油 （体积分数50%） ， 灌装保藏， 使用时稀释500-1000倍。 0049 实施例3 XFP-gy菌剂离体条件下降解毒死稗 0050 1、 将2ml实施例2获得的XFP-gy菌剂接种于100ml MSM培养基中， 添加毒死蜱至终 浓度为20 mg/L， 测定培养基初始OD600值和毒死蜱含量；。
24、 同时以不接种XFP-gy菌剂 （加入与 菌剂等体积的无菌生理盐水） 的培养基作为对照组， 每个处理重复3次； 0051 将对照组与实验组均于30、 200 rpm避光培养， 9d后间取样测定OD600值及毒死蜱 残留量， 发现实验组第9天毒死蜱的残留量为4.43 mg/L， 降解率达77.28%； 而在未接菌的对 照处理中， 残留量是19.84 mg/L， 9天毒死蜱的降解率仅为0.8%。 0052 实施例4 克罗诺杆菌XFP-gy增强韭菜中残留毒死蜱降解试验 0053 1、 韭菜浸根接种克罗诺杆菌XFP-gy： 将实施例2获得的XFP-gy菌剂用无菌生理盐 水稀释， 使克罗诺杆菌XFP-g。
25、y含菌量在103-104cfu/mL； 于韭菜移栽前将韭菜根全部浸泡的 稀释后的克罗诺杆菌菌液内， 浸泡24小时以接种， 接种好克罗诺杆菌XFP-gy的韭菜幼苗进 行田间移栽， 正常浇水、 施肥管理； 0054 2、 毒死蜱施用处理： 接种克罗诺杆菌韭菜幼苗生长7天后进行施药处理， 即将48% 毒死蜱乳油稀释500倍药液， 按每盆韭菜 （3株/盆） 灌根10 ml， 于施药后15天取样检测土壤 和植株中毒死蜱残留情况； 同时以未接种克罗诺杆菌XFP-gy的韭菜作对照， 每个处理重复 三次； 说明书 4/5 页 6 CN 105238726 B 6 0055 3、 韭菜植株及土壤中毒死蜱残留检测。
26、： 韭菜植株分地上部分和地下部分， 匀浆后 用乙腈提取， 过Florisil SPE柱净化后， 气相色谱检测毒死蜱残留量； 土壤样品用乙腈提 取， 氮气吹干后用1 mL正己烷定容， 气相色谱检测毒死蜱残留量； 0056 4、 毒死蜱残留检测结果： 克罗诺杆菌XFP-gy接种处理韭菜茎叶内毒死蜱残留量为 2.79 mg/kg， 而未接种内生菌韭菜植株毒死蜱残留量为6.36 mg/kg。 即在相同施药量条件 下， 接种内生菌韭菜茎叶中毒死蜱残留量较未接菌韭菜降低了56%， 这说明克罗诺杆菌XFP- gy接种韭菜后， 能够显著增强韭菜降解毒死稗的能力， 具有良好的田间应用价值。 0057 实施例5 。
27、克罗诺杆菌XFP-gy增强水稻中残留毒死蜱降解、 促进水稻生长试验 0058 1、 浸种接种克罗诺杆菌XFP-gy： 将实施例2获得的XFP-gy菌剂用无菌生理盐水稀 释制备浸种菌液， 使克罗诺杆菌XFP-gy含菌量在103-104cfu/mL； 水稻种子按常规方法浸种 催芽， 待露白后转移至上述浸种菌液中浸种24h； 同时设置以清水代替克罗诺杆菌XFP-gy浸 泡的对照组； 0059 2、 接种克罗诺杆菌XFP-gy对水稻生长的影响： 将发芽水稻种子播种于盆钵内， 于 光照培养箱内培养， 定期补充盆钵里的水， 光照 （光/暗： 16h/8h） ， 温度： 25， 生长30天后取 样测定水稻植。
28、株干重、 叶长和根长等指标， 同时以未接种克罗诺杆菌XFP-gy的水稻植株作 为对照， 每处理重复三次。 0060 3、 毒死蜱施用处理： 室内生长30d后将稻苗移至室外培养， 将48%毒死蜱乳油稀释 500倍后， 按每次毒死蜱100g/亩的施用量喷施毒死蜱， 每6天施一次， 连续施一个月。 分别在 停止用药后第7、 14和30天取水稻植株， 测定毒死蜱残留。 并在水稻结穗后收集水稻谷粒 （稻 米+谷壳） ， 检测水稻果实中的毒死蜱残留。 以未接种克罗诺杆菌XFP-gy的水稻植株作为对 照。 每处理重复三次。 0061 4、 水稻植株及谷粒中毒死蜱残留检测： 水稻植株和谷粒匀浆， 后用乙腈提取。
29、， Florisil SPE柱净化后， 气相色谱检测毒死蜱残留量。 0062 5、 水稻生长指标测定结果： 与未接菌水稻植株相比， 接种克罗诺杆菌XFP-gy的水 稻在外观上长势更好， 叶片更长更宽， 根系更发达。 接种克罗诺杆菌XFP-gy的水稻植株干重 为0.230.15 (g/株)， 平均叶长： 37.732.41 cm,根长： 15.710.37cm； 水稻植株干重为 0.140.006 (g/株)， 平均叶长： 32.342.65 cm,根长： 8.370.92cm。 表明接种内生菌克 罗诺杆菌XFP-gy对水稻幼苗有明显的促进生长作用。 0063 6、 毒死蜱残留检测结果： 停止用。
30、药后第7、 14和30d分别取样测定， 克罗诺杆菌XFP- gy接种处理水稻植株内毒死蜱残留量分别为0.87 mg/kg、 0.43 mg/kg和0.22mg/kg， 水稻谷 粒中毒死蜱残留量为0.72mg/kg； 而未接种内生菌水稻植株用药后第7、 14和30d毒死蜱残留 量分别为1.75 mg/kg、 1.02 mg/kg和0.97 mg/kg， 水稻谷粒中毒死蜱残留量为2.89mg/kg。 表明接种克罗诺杆菌XFP-gy不仅可加速水稻植株内残留毒死蜱的降解， 同时也降低了稻谷 中毒死蜱的最终残留量70%左右。 0064 说明克罗诺杆菌XFP-gy接种水稻后， 不仅能够显著促进水稻幼苗的生长， 同时也 加速了水稻植株内残留毒死蜱的降解， 降低稻谷中毒死蜱最终残留量， 具有良好的应用前 景。 说明书 5/5 页 7 CN 105238726 B 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 105238726 B 8 。