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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610059545.9 (22)申请日 2016.01.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105506150 A (43)申请公布日 2016.04.20 (73)专利权人 广州伯信生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市广州高新技术 产业开发区科学城掬泉路3号广州国 际企业孵化器D区D1008号 (72)发明人 董先辉王晓香曾健张娟 杨嘉杰周剑 (74)专利代理机构 北京市盈科律师事务所 11344 代理人 马丽丽 (51)Int.Cl. C。
2、12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/6811(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) G01N 33/53(2006.01) G01N 33/561(2006.01) (56)对比文件 CN 104404142 A,2015.03.11, CN 102643910 A,2012.08.22, EP 1690947 A2,2006.08.16, 袁方.膀胱癌中DNA聚合酶Pol转录调控机 制及其作用初步研究. 中国博士学位论文全文 数据库 医药卫生科技辑 .2014, (第5期), 审查员 蒋红云 (54)发明名称 一种。
3、EMSA方法及其探针和该探针的制备方 法 (57)摘要 本发明公开了一种EMSA方法及其探针和该 探针的制备方法。 EMSA探针所述包含第一条链， 所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其 5 及3 端的接头序列。 所述EMSA探针的制备方 法， 包含以下步骤： 合成模板链和生物素标记且 LNA修饰的引物， 所述模板链包含转录因子结合 序列和位于其5 及3 端的接头序列， 所述接头序 列为回文序列， 所述引物的核苷酸序列与接头序 列的核苷酸序列相同； 采用该引物以模板链为模 板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。 使用所述的 EMSA探针可进行EMSA。 本发明由单链探针经PCR 制得双链探针。
4、， 不会出现由于复性不彻底造成的 假阴性， 还克服了单链自由探针带来的显影误 差。 权利要求书1页 说明书8页 序列表7页 附图6页 CN 105506150 B 2018.09.25 CN 105506150 B 1.一种EMSA探针的制备方法， 其特征在于， 包含以下步骤： 合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物， 所述模板链包含转录因子结合序列和位 于其5 及3 端的接头序列， 所述接头序列为回文序列， 所述引物的核苷酸序列与接头序列 的核苷酸序列相同； 采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。 2.根据权利要求1所述的EMSA探针的制备方法， 其特征在于， 所述P。
5、CR反应体系为： 1 M 模板链1 L， 10 M Biotin-LNA-Oligo2 L， dNTP Mix 4 L， DNA Polymerase 0.25 L， 10PCR reaction buffer 5 L， ddH2Oto 50 L； 所述PCR反应条件为： 945min； 9510sec， 55 20sec， 728sec， 35循环； 7210min。 3.一种根据权利要求1所述的EMSA探针的制备方法制得的EMSA探针， 其特征在于， 包含 第一条链， 所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5 及3 端的接头序列， 所述接头 序列为回文序列； 所述EMSA探针还包含与第一。
6、条链探针互补的第二条链， 所述接头序列经生物素标记和 LNA修饰。 4.根据权利要求3所述的EMSA探针， 其特征在于， 所述接头序列的长度为8-15nt。 5.根据权利要求4所述的EMSA探针， 其特征在于， 所述接头序列为GGGTCTAGACCC、 GCATCATGATGC或GGGCTAGCCC。 6.根 据权 利要求 5所 述的 E M S A探 针 ， 其 特 征 在于 ， 所 述 第一 条 链的 序 列为 G G G T C T A G A C C C G T G T C H G K C T R G G G T C T A G A C C C 、 G C A T C A T G A 。
7、T G C A G T T G G A A A T Y C C T C C C A G G C G C A T C A T G A T G C 或 GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTCGGGCTAGCCC， 其中HA/C/T， KG/T， RA/G， Y C/T。 7.根据权利要求3所述的EMSA探针， 其特征在于， 所述转录因子结合序列含有简并序 列。 8.一种非诊断目的的EMSA方法， 使用权利要求3所述的EMSA探针进行EMSA。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506150 B 2 一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方法 技术领域 00。
8、01 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种EMSA方法及其探针和该探针的制备方 法。 背景技术 0002 凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic mobility shift assay， EMSA)是 研究启动子结合蛋白的经典方法， 是一种用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技术。 EMSA基本过程是将32P或33P标记或非放射性标记的包含特异的DNA位点的DNA片段与DNA结 合蛋白共同孵育后进行电泳分析， 蛋白-DNA复合物通过EMSA与游离DNA分离开来， 蛋白质阻 碍与其所结合的DNA片段的移动性。 因此， 游离DNA比DNA-蛋白质复合物移动的更快， 凝胶的 图。
9、像可以揭示游离和结合的标记的DNA的位置。 EMSA不仅简单、 迅速、 灵敏度高； 且可以用竞 争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。 目前， EMSA可以用于检测DNA结合蛋白、 RNA结合蛋 白， 并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质， EMSA还可以结合蛋白双向电泳及质谱 技术进行未知蛋白的鉴定分析。 0003 随着EMSA技术的不断完善， 其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重 要。 Jiang X等用EMSA方法证明了AP1能够结合在启动子的功能区域， 并且调控LoVo细胞的 PPARdelta的表达(Jiang,X.,et al.,Transcription factor 。
10、AP1 binds the functional region of the promoter and regulates gene expression of human PPARdelta in LoVo cell.Tumour Biol,2013.6(34):p.3619-3625)。 Katanin是参与微管切断ATP酶家族 成员的蛋白质， 它的两种异源二聚体结构由KATNA1和KATB1编码， 而Elk1能够与微管相互作 用， Selcuk E等用EMSA方法证明Elk1能够结合KATB1启动子， 调控其表达(Selcuk,E., D.Canbaz and A.Et,Katanin-。
11、p80gene promoter characterization and regulation via Elk1.PLoS One,2013.7(8):p.e69423)。 凝胶阻滞电泳分析显示青蒿素激活PXR与 CYP3A4 DNA 结合的能力， 表明CYP3A4的诱导是由青蒿素通过PXR的活化所介导(Hu,D.,et al.,Artemisinin protects against dextran sulfate-sodium-induced inflammatory bowel disease ,which is associated with activation of the pr。
12、egnane X receptor.Eur J Pharmacol,2014(738C):p.273-284)。 0004 现如今的研究中， EMSA探针主要是合成生物素标记的单链探针， 再通过变性、 复性 实验得到的双链探针。 如Kim JR等运用生物公司合成的3 末端被生物素标记的正、 反单链 EMSA探针， 并在室温下复性得到双链探针(Kim,J.,S.Mathew and P.Mathew,Blimp-1/ PRDM1regulates the transcription of human CS1(SLAMF7)gene in NK and B cells.Immunobiology,。
13、2015.221(1):p.31-39)。 又如GrycovA等、 Hsu FT等亦分别通过设 计合成包含转录因子结合位点的单链EMSA探针， 之后通过低温复性得到双链探针， 进而开 展凝胶迁移率实验(Aneta,G.,D.Aneta and D.Zdenek,Impurities contained in antifungal drug ketoconazole are potent activators of human aryl hydrocarbon receptor.TOXICOLOGY LETTERS,2015.239(2):p.67-72； Hsu,F.,B.Chang and 。
14、C.John, 说明书 1/8 页 3 CN 105506150 B 3 Synergistic Effect of Sorafenib and Radiation on Human Oral Carcinoma in vivo.SCIENTIFIC REPORTS,2015.5)。 0005 上述EMSA探针的合成方法具有3点较明显的缺点： (1)通过复性得到的双链探针的 比例难以保证， 容易造成实验结果的假阴性； (2)复性不彻底的单链探针的显影亮度远高于 蛋白-DNA复合物结合条带的显影亮度， 造成假阴性， 且双链探针比例较低影响阳性结果的 显影； (3)需要合成大量的单链探针， 成本较。
15、高。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明的第一个目的是提供一种EMSA探针， 本发明的第二个目的是提 供该探针的制备方法， 本发明的第三个目的是提供使用该探针的EMSA方法。 0007 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 0008 一种EMSA探针， 包含第一条链， 所述第一条链包含转录因子结合序列和位于其5 及3 端的接头序列。 0009 优选地， 所述接头序列为回文序列。 0010 优选地， 所述接头序列的长度为8-15nt。 0011 优选地， 所述接头序列的长度为12nt。 0012 优选地， 所述接头序列经生物素标记和LNA修饰。 0013 优选地， 所述转录因子结合序。
16、列含有简并序列。 0014 更优选地， 所述接头序列为GGGTCTAGACCC。 0015 更优选地， 所述接头序列为GCATCATGATGC。 0016 更优选地， 所述接头序列为GGGCTAGCCC。 0017 更优选地， 所述第一条链的序列为GGGTCTAGACCCGTGTCHGKCTRGGGTCTAGACCC， 其中 HA/C/T， KG/T， RA/G。 0018 更优选地，所述第一条链的序列为 GCATCATGATGCAGTTGGAAATYCCTCCCAGGCGCATCATGATGC。 0019 更优选地，所述第一条链的序列为 GGGCTAGCCCTCCGTGTTCTGACTCTT。
17、GAGGGTCTTCGGGCTAGCCC。 0020 优选地， 所述EMSA探针包含与第一条链探针互补的第二条链。 0021 一种EMSA探针的制备方法， 包含以下步骤： 0022 合成模板链和生物素标记且LNA修饰的引物， 所述模板链包含转录因子结合序列 和位于其5 及3 端的接头序列， 所述接头序列为回文序列， 所述引物的核苷酸序列与接头 序列的核苷酸序列相同； 采用该引物以模板链为模板进行PCR扩增合成双链EMSA探针。 0023 优选地， 所述PCR反应体系为： 1 M模板链1 L， 10 M Biotin-LNA-Oligo2 L， dNTP Mix 4 L， DNA Polymer。
18、ase 0.25 L， 10PCR reaction buffer 5 L， ddH2Oto 50 L； 所述 PCR反应条件为： 945min； 9510sec， 5520sec， 728sec， 35循环； 7210min。 0024 一种EMSA方法， 使用上述EMSA探针进行EMSA。 0025 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0026 (1)不采用传统的两条单链探针复性得到双链探针的方法， 而是由单链探针PCR制 得双链探针， 不会出现由于复性不彻底造成的假阴性， 也克服了单链自由探针带来的显影 说明书 2/8 页 4 CN 105506150 B 4 误差； 0027 。
19、(2)转录因子结合位点一般具有核苷酸序列多态性， 传统方法制备EMSA探针时需 要分开合成互补探针并分开退火， 成本高， 操作繁琐； 而本发明探针制备方法在保证碱基互 补配对的基础上， 通过设计合成简并碱基模板可以制备多类型探针组， 大大降低了探针的 制备成本， 简化了制备过程； 0028 (3)与需要合成大量单链探针、 每个单链探针都需要进行生物素标记的现有技术 相比， 本发明仅需合成少量单链探针和生物素标记的引物， 大大降低了成本， 缩短了标记时 间， 对于EMSA在生产、 研发中的应用及临床疾病检测上的运用具有非常重要的意义。 附图说明 0029 图1为EMSA探针中第一条链的结构示意图。
20、。 0030 图2为实施例1的EMSA探针电泳图。 0031 图3为实施例1的EMSA结果图。 0032 图4为对比例1的EMSA结果图。 0033 图5为实施例2的EMSA探针电泳图。 0034 图6为实施例2的EMSA结果图。 0035 图7为对比例2的EMSA结果图。 0036 图8为实施例3的EMSA探针电泳图。 0037 图9为实施例3的EMSA结果图。 0038 图10为对比例3的EMSA结果图。 0039 其中， P1为蛋白-探针-抗体超迁移条带， P2为蛋白-探针迁移条带， P3为自由探针 (未结合蛋白的探针)条带； Probe表示标记探针， NE表示目的转绿因子的核蛋白， W。
21、T Probe 表示未标记探针， Mut Probe表示未标记的突变探针， Anti-TF表示目的转录因子的特异抗 体。 具体实施方式 0040 为了更好的说明本发明， 下面结合附图和具体实施例做进一步说明。 本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得， 使用的检测方法等都是本领域所熟知的， 在此不再赘述。 0041 本发明中模板链中的转录因子结合序列是参考转录因子结合序列数据库 (transcription factor binding site， TFBS)， 包括TRANSFAC、 JASPAR、 TFDB、 TRRD、 TRED、 PAZAR、 MAPPER等， 区分物种特异性获得目的转录。
22、因子结合序列。 具体可通过以下三种方式 获得转录因子结合序列： 根据TFBS序列直接确定转录因子结合序列； 或根据TFBS序列与转 录因子目标基因调控序列开展序列比对确定靶基因结合调控位点， 以该靶基因结合调控位 点作为转录因子结合序列； 或直接使用转录调控数据库(如： PROMO、 JASPAR、 EpiTect ChIP、 MatInspector等)针对靶基因调控序列分析结合调控转录因子， 进而确定靶基因结合位点， 以该靶基因结合位点作为转录因子结合序列。 0042 实施例1、 SMAD2 0043 S1、 制备模板链 0044 根据HOCOMOCO或JASPAR数据库的SMAD2序列直。
23、接确定转录因子结合序列， 获得的 说明书 3/8 页 5 CN 105506150 B 5 转录因子结合序列为GTGTCHGKCTR(HA/C/T； KG/T； RA/G)。 在该转录因子结合序列的 5 及3 端分别添加接头序列(GGGTCTAGACCC， SEQ ID NO： 1)， 获得模板链(接头序列+转录因 子结合序列+接头序列， GGGTCTAGACCC+GTGTCHGKCTR+GGGTCTAGACCC,SEQ ID NO： 4)， 其结构 如图1所示， 该序列送交基因合成公司合成。 同时合成突变单链， 序列为GGGTCTAGACCC+ TCGRTTHGKCG+GGGTCTAGACC。
24、C(SEQ ID NO： 7)。 0045 S2、 合成引物 0046 化学合成生物素标记且LNA修饰的引物， 所述引物的核苷酸序列与接头序列的核 苷酸序列相同， 即为GgGTcTAgACcC(小写字母为LNA修饰锁核苷酸， 下同)， 记为Biotin-LNA- Oligo， 该序列送交基因合成公司完成。 同时合成未生物素标记的LNA修饰的寡核苷酸回文 序列GgGTcTAgACcC， 记为LNA-Oligo。 0047 S3、 PCR扩增合成双链探针 0048 将合成的Biotin-LNA-Oligo和LNA-Oligo分别用双蒸水稀释， 终浓度为10 M； 将合 成的模板链用双蒸水稀释， 终。
25、浓度为1 M。 以模板链为模板， 以步骤S2中合成的引物为引物 进行PCR。 以Biotin-LNA-Oligo为引物， 以本发明中模板链为模板PCR得到的探针为野生型 标记探针。 以LNA-Oligo为引物， 以本发明中模板链为模板PCR得到的探针为野生型未标记 探针； 以LNA-Oligo为引物， 以本发明中突变单链为模板PCR得到的探针为未标记突变探针。 使用经LNA修饰的引物进行PCR反应， 可以增加退火温度， 使得短链引物获得长链引物的扩 增效率， 同时增加EMSA实验探针的特异性。 0049 按照如下所示分别配置标记探针组PCR反应体系： 模板(1 M)1 L， Biotin-LN。
26、A- Oligo(10 M)2 L， dNTP Mix 4 L， DNA Polymerase 0.25 L， 10PCR reaction buffer 5 L， ddH2O to 50 L。 0050 同时设置野生型竞争冷探针组， 其PCR反应体系如下： 模板链(1 M)1 L， LNA-Oligo (10 M)2 L， dNTP Mix 4 L， DNA Polymerase 0.25 L， 10PCR reaction buffer 5 L， ddH2O to 50 L。 0051 按照以下程序开展PCR扩增： 预变性： 945min； 35循环(变性： 9510sec； 退 火： 5。
27、520sec； 延伸： 728sec)； 延伸： 7210min； 保存： 12。 0052 PCR结果经3琼脂糖凝胶电泳， 100v恒压电泳15min， 凝胶成像系统检测扩增效 果， 如图2所示。 图中Maker为DNA标准品， a为野生型标记探针， b为野生型未标记型探针， c为 未标记突变探针， 探针大小约为4050bp。 0053 对上述PCR获得的EMSA探针进行纯化， 具体方法如下： 0054 在PCR反应终止后， 向标记探针及冷竞争探针(包括野生型未标记探针和未标记突 变探针)中加入1/10体积3M NaAO、 2倍体积无水乙醇、 3 L核酸助沉剂， 混匀； -70至-80 沉淀。
28、1小时， 或-20沉淀过夜； 4， 12,000g-16,000g离心30分钟， 小心去除上清； 室温微晾 干沉淀(约5min)； 加入50 L TE， 完全溶解沉淀； 标记好的探针及冷竞争探针， -20保存备 用。 0055 S4、 EMSA 0056 S41、 核蛋白提取 0057 实验操作参考伯信生物EMSA试剂盒说明书， 简要步骤为： 取107个细胞用PBS洗一 遍， 离心收集细胞， 尽最大努力吸尽上清， 留下细胞沉淀； 加入400L预冷含PMSF 说明书 4/8 页 6 CN 105506150 B 6 (Phenylmethanesulfonyl fluoride， 苯甲基磺酰氟)。
29、的蛋白抽提试剂A。 最高速剧烈振荡 (Vortex)5秒， 把细胞沉淀完全悬浮并分散开(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开， 可以 适当延长时间)。 412,000-16,000g离心5分钟。 完全吸尽上清， 向剩余沉淀中加入2.5倍体 积(50 L)添加了PMSF的蛋白抽提试剂C。 最高速剧烈振荡15-30秒， 把细胞沉淀完全悬浮并 分散开。 然后放回冰浴中， 每隔1-2分钟再高速剧烈振荡15-30秒， 共30分钟。 412,000-16, 000g离心10分钟。 立即吸取上清至一预冷的塑料管中， 即为抽提得到的细胞核蛋白。 可以立 即使用， 也可以-70冻存备用。 0058 S42、 结合反。
30、应 0059 结合反应组别设置如下： 0060 实验组(激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针)； 0061 阴性对照组(野生型标记探针)； 0062 野生型竞争组(含激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针+野生型标记 探针100倍量的野生型未标记探针)； 0063 突变型竞争组(含激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针+野生型标记 探针100倍量的未标记突变探针)； 0064 超迁移对照组(含激活的目的转录因子的核蛋白+野生型标记探针+目的转录因 子的特异抗体)。 0065 结合反应的简要步骤如下： 0066 在加入野生型标记探针前， 先将其他成分混匀， 消除可能发生的探针和蛋白。
31、的非 特异性结合， 或者让冷竞争探针优先反应， 然后加入野生型标记探针混匀， 室温(20-25) 放置20分钟。 0067 S43、 电泳分析 0068 向结合反应后的混合物中加入1 l EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色， 10)， 混 匀后立即上样； 用0.5TBE作为电泳液， 按照10V/厘米的电压预电泳10分钟； 按照10V/厘米 的电压电泳， 电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处， 停 止电泳。 本实施例中电泳使用的是6.5非变性PAGE胶， 按照以下成分及用量配制： 10TBE 1.0ml， 40Acrylamide 3.3ml。
32、， 50Glycerol 1.0ml， dH2O 14.8ml， TEMED 20 l， 10AP 120 l。 0069 S44、 电转运及紫外交联 0070 取和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜及两片滤纸， 用0.5TBE浸泡至少1015分 钟； 采用湿法电转膜装置， 以0.5TBE为转膜液， 4， 380mA(约100V)转膜50分钟。 用紫外交 联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长， 120mJ/cm2， 交联1-5分钟。 0071 S45、 信号检测 0072 实验操作参考伯信生物EMSA试剂盒说明书， 简要步骤如下： 37-50水浴溶解封闭 液和。
33、洗涤液， 交联过的尼龙膜加入15ml封闭液， 缓慢摇动15分钟。 封闭液封闭的尼龙膜， 转 入15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液， 缓慢摇动15分钟。 尼龙膜转移至15- 20ml洗涤液， 缓慢摇动漂洗1分钟， 重复漂洗3次(共漂洗4次)。 尼龙膜转移至20-25ml检测平 衡液的容器内， 缓慢摇动5分钟； 取出尼龙膜在表面小心加上BeyoECL Plus Reagent工作 液， 使工作液完全覆盖尼龙膜， 室温静置2-3分钟。 将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的 说明书 5/8 页 7 CN 105506150 B 7 透光薄膜中间， 并固定于压片暗盒内。
34、。 用X光片压片15分钟， 显影定影。 结果如图3所示。 0073 由图3可知， 阴性对照反应组仅有自由探针条带， 实验组、 野生型竞争对照组和突 变型竞争对照组均有自由探针条带和蛋白-探针迁移条带， 超迁移对照组含有自由探针条 带、 蛋白-探针迁移条带和蛋白-探针-抗体超迁移条带。 使用本发明方法进行EMSA， 条带清 晰、 单一、 特异性高， 无拖尾现象， 无假阴性出现。 0074 对比例1 0075 本对比例针对SMAD2序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。 化学 合成的单链探针的序列为GTGTCHGKCTR(SEQ ID NO： 8)、 YAGMCDGACAC(SEQ 。
35、ID NO： 9)， 竞争 突变探针序列为TCGRTTHGKCG(SEQ ID NO： 10)、 CGMCDAAYCGA(SEQ ID NO： 11)(HA/C/T； K G/T； MA/C； YC/T； RA/G； DA/G/T)。 末端分别进行生物素标记， 然后95水浴5min， 自然冷却形成双链EMSA探针。 0076 用本对比例获得的EMSA探针按照实施例1所述的方法进行EMSA、 电泳分析、 电转运 及紫外交联和信号检测。 结果如图4所示。 由图4可知， EMSA结果拖尾严重， 显影模糊不清。 0077 对比传统探针制备方法(对比例1)与本发明探针制备法(实施例1)EMSA实验结果 。
36、可知， 传统探针制备方法制得的探针进行EMSA， 自由探针比例过高， 这是由于复性效率低所 引起； 本发明探针制备方法制得的探针进行EMSA， 自由探针条带与迁移阻止条带及超迁移 阻止条带相比， 比例比较均衡， 显影效果比较美观。 同时由于本发明方法基本不存在非复性 单链探针， 所以在探针加入量相较于传统方法更加易于计算及添加。 同时， 本实施例是针对 NFKB结合位点设计的， 根据转录因子结合位点核苷酸碱基多态性， 设计含兼并碱基的模板 序列， 其对转录因子整体活性检测结果将更加准确。 0078 以制备转录因子SMAD2的EMSA探针并用于检测100个位点为例， 对本发明方法和传 统方法的成。
37、本进行了比较。 采用传统方法合成单链并制备双链探针的成本为100000元(100 位点单链探针： 1001000)(参考上海生工生物合成价格)， 而采用本发明方法制备探针的 成本为7000元(模板50100+标记的引物1000+PCR10100)(参考上海生工生物合成价 格)。 若检测位点数越大， 本发明探针成本越低。 0079 实施例2、 NFKB3 0080 根据HOCOMOCO或JASPAR数据库的NFKB3序列直接确定转录因子结合序列， 获得的 转录因子结合序列为AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC。 在该转录因子结合序列的5 及3 端分别添 加接头序列(GCATCATGATGC。
38、， SEQ ID NO： 2)， 获得模板链(接头序列+转录因子结合序列+接 头序列， GCATCATGATGC+AGTTGGAAATYCCTCCCAGGC+GCATCATGATGC， SEQ ID NO： 5)。 该序列送 交 基 因 合 成 公 司 合 成 。 同 时 合 成 突 变 单 链 ， 其 序 列 为 G C A T C A T G A T G C + AGCTAGYCTGACATCACGCTG+GCATCATGATGC(SEQ ID NO： 12)。 0081 本实施例中的合成引物、 PCR扩增合成双链探针和EMSA的方法与实施例1相同。 引 物经LNA修饰后的序列为GcATc。
39、ATgATgC(小写字母为LNA修饰锁核苷酸)。 探针电泳图如图5， EMSA结果如图6所示。 0082 对比例2 0083 本对比例针对NFKB3序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMSA探针。 化学 合 成的 单 链 探 针的 序 列为 A G T T G G A A A T Y C C T C C C A G G C (S E Q I D N O ： 1 3) 、 GCCTGGGAGGRATTTCCAACT(SEQ ID NO： 14)， 竞争突变探针序列为AGCTAGYCTGACATCACGCTG 说明书 6/8 页 8 CN 105506150 B 8 (SEQ ID NO： 1。
40、5)、 CAGCGTGATGTCAGRCTAGCT(SEQ ID NO： 16)， 末端分别进行生物素标记， 然 后95水浴5min， 自然冷却形成双链EMSA探针， 复性率不高于80。 0084 用本对比例获得的EMSA探针按照实施例2所述的方法进行EMSA、 电泳分析、 电转运 及紫外交联和信号检测。 结果如图7所示。 0085 对比传统探针制备方法(对比例2)与本发明探针制备法(实施例2)EMSA实验结果 可知， 传统探针制备方法制得的探针进行EMSA， 自由探针存在双带现象， 这是由于复性效率 低所引起， 对结果的判定上容易引起假阳性误判； 本发明探针制备方法制备的探针进行 EMSA，。
41、 自由探针由于标记引物分子量相对于双链标记探针分子量差距明显且自身较小， 一 般会电泳出凝胶或通过探针纯化的方式去除， 所以一般不会引发双带现象， 而且条带间比 较均衡显影效果比较美观。 0086 实施例3、 C-JUN 0087 根据HOCOMOCO或JASPAR数据库的C-JUN序列直接确定转录因子结合序列， 获得的 转录因子结合序列为TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC。 在该转录因子结合序列的5 及3 端 分别添加接头序列(GGGCTAGCCC， SEQ ID NO： 3)， 获得模板链(接头序列+转录因子结合序列 +接头序列， GGGCTAGCCC+TCCGTGTT。
42、CTGACTCTTGAGGGTCTTC+GGGCTAGCCC， SEQ ID NO： 6)。 该序 列送交基因合成公司合成。 同时合成突变单链， 所述突变单链的具体序列为GGGCTAGCCC+ TCCTCGTCGTGTCAGTGGTCTTATGTC+GGGCTAGCCC(SEQ ID NO： 17)。 0088 本实施例中的合成引物、 PCR扩增合成双链探针方法和EMSA实施例1相同， 但是序 列不同。 引物经LNA修饰后的序列为GgGctAgCcC。 探针电泳图如图8， EMSA结果如图9所示。 0089 对比例3 0090 本对比例针对C-JUN序列采用传统的化学合成结合退火方式制备EMS。
43、A探针。 化学 合成的单链探针的序列为TCCGTGTTCTGACTCTTGAGGGTCTTC(SEQ ID NO： 18)、 GAAGACCCTCAAGAGTCAGAACACGGA (SEQ ID NO ： 19) ， 竞争突变探针序列为 TCCTCGTCGTGTCAGTGGTCTTATGTC(SEQ ID NO： 20)、 GACATAAGACCACTGACACGACGAGGA(SEQ ID NO： 21)， 末端分别进行生物素标记， 然后95水浴5min， 自然冷却形成双链EMSA探针， 复性 率不高于80。 0091 用本对比例获得的EMSA探针按照实施例3所述的方法进行EMSA、 电泳。
44、分析、 电转运 及紫外交联和信号检测。 结果如图10所示。 0092 对比传统探针制备方法(对比例3)与本发明探针制备方法(实施例3)EMSA实验结 果可知， 使用传统探针制备方法获得的探针进行EMSA， 条带不清， 拖尾严重； 使用本发明探 针制备方法的探针进行EMSA， 带型清晰明确， 更利于结果判断， 结果更加严谨准确。 0093 由上述各实施例和对比例可知， 本发明EMSA探针明显优于传统EMSA探针。 在制备 方法方面， 传统EMSA探针采用化学合成修饰的单链探针、 低温退火、 纯化检测等获得， 具有 探针标记效率低、 纯度不高、 降解程度大及结合效率不稳定等缺点， 进而导致拖尾、 。
45、模糊、 出 现多条结果条带等现象。 相较于传统EMSA探针， 本发明EMSA探针制备时采用生物素标记了 接头序列， 针对多样品多物种均能使用， 探针利用率高， 成本低。 同时， 由于探针纯度高， 显 影条带特异性强， 结果条带清晰、 单一， 且无拖尾现象， 无假阴性出现。 0094 分析转录因子结合位点矩阵时， 发现存在多个单核苷酸多态性， 因此， 传统EMSA探 针需要有针对性的设计多条探针。 在低温复性时， 需要根据序列逐个复性或者混合复性， 但 说明书 7/8 页 9 CN 105506150 B 9 是， 探针逐个复性会使成本大大增加， 而混合复性又会造成碱基错配现象， 导致探针特异性。
46、 低。 本发明直接根据矩阵序列合成简并序列模板， 添加生物素标记的接头序列， 并通过PCR 扩增得到特异性的EMSA探针， 成功的避免了传统探针带来的碱基错配现象， 特异性远超传 统EMSA探针。 0095 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 8/8 页 10 CN 105506150 B 10 0001 序列表 1。
47、/7 页 11 CN 105506150 B 11 0002 序列表 2/7 页 12 CN 105506150 B 12 0003 序列表 3/7 页 13 CN 105506150 B 13 0004 序列表 4/7 页 14 CN 105506150 B 14 0005 序列表 5/7 页 15 CN 105506150 B 15 0006 序列表 6/7 页 16 CN 105506150 B 16 0007 序列表 7/7 页 17 CN 105506150 B 17 图1 图2 图3 说明书附图 1/6 页 18 CN 105506150 B 18 图4 图5 说明书附图 2/6 页 19 CN 105506150 B 19 图6 说明书附图 3/6 页 20 CN 105506150 B 20 图7 图8 说明书附图 4/6 页 21 CN 105506150 B 21 图9 说明书附图 5/6 页 22 CN 105506150 B 22 图10 说明书附图 6/6 页 23 CN 105506150 B 23 。