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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610220636.6 (22)申请日 2016.04.11 (83)生物保藏信息 CGMCC No.11994 2016.01.12 (71)申请人 江苏师范大学 地址 221116 江苏省徐州市铜山区上海路 101号 (72)发明人 刘伟杰郝艳蒋继宏刘聪 董振 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 1/04(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂 的方法及菌株 (5。
2、7)摘要 本发明涉及一种转化花生壳水解物制备微 生物絮凝剂的方法及菌株， 属于微生物制剂领 域。 制备工艺如下 ： 将菌 种Pseud omonas sp.BWL918接种到种子液培养基中， 28摇床培 养制备种子液； 将种子液按1%比例转接到以花生 壳水解物为碳源的发酵培养基中， 28， 180rpm 摇床培养48h； 将发酵液在4， 10000rpm离心 10min后， 收集上清液即为液体微生物絮凝剂； 向液体发酵液中加入2倍体积预冷的无水乙醇， 离心收集沉淀物并冷冻干燥得到纯品微生物絮 凝剂。 本发明可以利用花生壳水解物作为发酵培 养基的碳源生产微生物絮凝剂， 能降低微生物絮 凝剂的生产。
3、成本， 适应大规模生产及工业化应 用。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106119144 A 2016.11.16 CN 106119144 A 1.一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的菌株P seudomonassp.BWL918， 保藏 于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 菌种保藏号为CGMCC11994。 2.一种如权利要求1所述的转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法， 该方法的工 艺步骤如下： 步骤1、 将花生壳粉碎， 并用60目网筛过筛， 按100g/L的浓度将花生壳粉加入1.7% （W/W） 的H2SO4溶液中， 于121水解120min， 冷却后， 离心10min， 收集。
4、上清液， 用Ca(OH)2调节pH 至7.0， 再次离心10min， 收集上清液得到花生壳水解物用于后续发酵培养基的碳源； 步骤2、 将菌种接种到种子液培养基中， 28摇床培养12h制备种子液； 步骤3、 将种子液按1%的比例转接到以花生壳水解物作为碳源的发酵培养基中， 摇床培 养48h； 步骤4、 将发酵培养基在4， 离心10min， 收集上清液即为液体微生物絮凝剂； 步骤5、 向液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇， 离心收集沉淀物， 并冷冻 干燥得到微生物絮凝剂产品。 3.根据权利要求1所述的一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法， 其特征在 于， 步骤2中所述的种子液培养基。
5、为葡萄糖1g/L， 可溶性淀粉1g/L， 酵母粉1g/L， 胰蛋白 胨1g/L， 酸水解酪蛋白1g/L， 七水硫酸镁0.1g/L， 磷酸氢二钾0.6g/L， 种子液的培养温 度为28。 4.根据权利要求1所述的一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法， 其特征在 于， 步骤3中的摇床培养条件为28， 180rpm摇床培养48h。 5.根据权利要求1所述的一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法， 其特征在 于， 步骤3中所述的发酵培养基为花生壳水解物300mL/L， 酵母粉3g/L， 七水硫酸镁0.1g/ L， 磷酸氢二钾0.6g/L， 发酵液初始pH为7.0。 6.根据权利要求1所述的一。
6、种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法， 其特征在 于， 步骤1和步骤4的离心转速为10000rpm。 7.根据权利要求1所述的一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法， 其特征在 于， 所述的步骤5中， 向步骤4获得的液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇， 10000rpm离心10min收集沉淀， 70%乙醇洗涤沉淀后， 冷冻干燥获得微生物絮凝剂纯品。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106119144 A 2 一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法及菌株 技术领域 0001 本发明涉及一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的方法及菌株， 具体涉及利 用P seudomona。
7、ssp.BWL918转化花生壳水解物发酵生产微生物絮凝剂的方法。 背景技术 0002 我国是农业大国， 每年农业生产过程中会产生大约7亿吨的农业废弃物， 如玉米秸 秆， 花生壳， 土豆渣和水稻壳等， 人们通常采取燃烧处理， 但这不仅浪费资源， 而且污染环 境。 这些残渣中含有丰富的纤维素类物质， 可以转化成糖类， 从而生产其他高附加值产品， 如何有效地将这些纤维素类农业废弃物转化为有价值的产品具有重要的经济意义。 0003 絮凝剂是一类可以聚集沉降溶液中悬浮颗粒的物质， 主要分为无机絮凝剂 （如硫 酸铝、 聚合硫酸铁等） 、 有机高分子絮凝剂 （如聚乙烯亚胺、 聚丙烯酰胺等） 和天然高分子絮 。
8、凝剂 （如改性淀粉、 壳聚糖、 海藻酸钠、 几丁质和微生物絮凝剂等） 。 无机絮凝剂在我国市场 上占重要份额， 每年有几十万吨的需求量， 主要以铁盐， 铝盐为代表。 铁盐具有腐蚀性， 容易 形成残留， 处理后的水带有颜色， 造成二次污染； 卫生学上发现铝盐在人体内的积累与当今 老年痴呆症有直接的关系。 有机高分子絮凝剂由于其良好的絮凝效果和低成本而被广泛应 用于实际生产中， 以聚丙烯酰胺为代表， 但其难降解， 单体丙烯酰胺是一种强致癌物质， 且 具有强烈的神经毒性， 残留于环境中的丙烯酰胺单体易造成二次污染， 对环境安全和人类 健康造成严重影响。 壳聚糖、 海藻酸钠、 几丁质等天然高分子絮凝剂。
9、虽然无毒、 能安全降解， 但其絮凝活性较弱、 成本较高， 限制了其广泛应用； 微生物絮凝剂是新型的第三代絮凝剂， 是由微生物产生的代谢产物， 如糖蛋白、 粘多糖、 蛋白质、 纤维素等， 具有无毒无害， 安全性 高， 生物易降解和无二次污染等特点， 因此微生物絮凝剂可以被广泛应用于污水处理， 尤其 是在食品和发酵工业的后处理等工艺中具有独特的优势， 其研究日益受到重视。 0004 目前已报到的微生物絮凝剂产生菌株有几十种， 如BacilluslicheniformisX14 所产的微生物絮凝剂主要有中性糖和蛋白质组成， 其最佳发酵培养基为葡萄糖20g/L,酵 母粉0.5g/L， 尿素0.5g/L。
10、；B a cillusf irmusS-14能产生一种多糖类生物絮凝剂， 其 最佳发酵培养基为葡萄糖10g/L,酵母粉0.5g/L；B acillussp.F19所产的生物絮凝剂 主要由中性糖、 糖醛酸、 氨基糖和蛋白质等组成， 其最佳发酵培养基为蔗糖20g/L,酵母粉 2.5g/L。 这些菌种所用培养基多以昂贵的糖类作为主要组分， 造成微生物絮凝剂生产成本 高， 限制了微生物絮凝剂的工业化应用。 0005 为了降低微生物絮凝剂的生产成本， Guo等利用玉米秸秆水解物作为菌株 R h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s的发酵碳源生产微生物絮凝剂 。
11、（Bioresource Technology .2015;177:393-397） ； Wa ng 等 利 用水 稻壳 水解物作为菌株 O c h r o b a c t i u m c i c e r iW2的发酵碳源生产微生物絮凝剂 （Bioresource technology,2013,145:259-263） ； Chin-HangShu等人也利用水稻壳水解物作为 S c h i z o p h y l l u m c o m m u n e的培养基生产微生物絮凝剂(JournaloftheTaiwan InstituteofChemicalEngineers,2011,42(3)。
12、:387-393)。 但目前未见利用花生壳水 说明书 1/4 页 3 CN 106119144 A 3 解物作为发酵培养基生产微生物絮凝剂的研究。 我国每年花生产量约1500余万吨， 居世界 第一， 每年产生大约500万吨的花生壳废弃物， 这些花生壳废弃物常常用作燃料， 造成资源 浪费和环境污染。 花生壳中含有丰富的纤维素、 淀粉等物质， 具有开发其他高附加值产品的 潜力。 本发明所用菌株为我们分离获得的假单胞菌P seudomonassp.BWL918， 该菌株能 利用花生壳水解物发酵生产微生物絮凝剂， 可以有效地降低微生物絮凝剂的生产成本， 变 废为宝， 实现花生壳的资源化利用。 发明内容。
13、 0006 本发明提供了一种P seudomonassp.BWL918菌株及其在中性条件下转化花生 壳水解物生产高活性微生物絮凝剂的方法。 该菌株具有生长速度快， 发酵周期短， 絮凝剂产 量高等优点， 能够有效地降低微生物絮凝剂的生产成本。 0007 本发明包括以下内容 ： 一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的菌株 Pseudomonas sp.BWL918， 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号， 菌种保藏号为CGMCC11994， 保藏日期2016.01.12。 0008 一种利用菌株P seudomonassp.BWL918转化花生壳水解物。
14、制备微生物絮凝剂 的方法， 该方法的工艺步骤如下： 步骤1、 将花生壳粉碎， 并用60目网筛过筛， 按100g/L的浓度将花生壳粉加入1.7% （W/W） 的H2SO4溶液中， 于121水解120min， 冷却后， 离心10min， 收集上清液， 用Ca(OH)2调节pH 至7.0， 再次离心10min， 收集上清液得到花生壳水解物用于后续发酵培养基的碳源； 步骤2、 将菌种接种到种子液培养基中， 28摇床培养12h， 制备种子液； 步骤3、 将种子液按1%的比例转接到以花生壳水解物作为碳源的发酵培养基中， 摇床培 养48h； 步骤4、 将发酵培养基在4， 离心10min， 收集上清液即为液体。
15、微生物絮凝剂； 步骤5、 向液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷的无水乙醇， 离心收集沉淀物， 并冷冻 干燥得到微生物絮凝剂产品。 0009 进一步的， 步骤2中所述的种子液培养基为葡萄糖1g/L， 可溶性淀粉1g/L， 酵母 粉1g/L， 胰蛋白胨1g/L， 酸水解酪蛋白1g/L， 七水硫酸镁0.1g/L， 磷酸氢二钾0.6g/L， 种子液的培养温度为28。 0010 进一步的， 步骤3中的摇床培养条件为28， 180rpm摇床培养48h。 0011 进一步的， 步骤3中所述的发酵培养基为花生壳水解物300mL/L， 酵母粉3g/L， 七 水硫酸镁0.1g/L， 磷酸氢二钾0.6g/L， 发酵。
16、液初始pH为7.0。 0012 进一步的， 步骤1和步骤4的离心转速为10000rpm。 0013 进一步的， 所述的步骤5中， 向步骤4获得的液体微生物絮凝剂中加入2倍体积预冷 的无水乙醇， 10000rpm离心10min收集沉淀， 70%乙醇洗涤沉淀后， 冷冻干燥获得微生物絮 凝剂纯品。 0014 本发明与现有技术相比， 具有以下优点： 本发明首次提出利用花生壳水解物生产 微生物絮凝剂， 可以实现对花生壳的资源化利用， 减少环境污染。 本发明所涉及菌株 Pse ud om ona s sp.BWL918生长速度快， 发酵周期短， 微生物絮凝产量高， 具有很好的应 用前景。 说明书 2/4 。
17、页 4 CN 106119144 A 4 具体实施方式 0015 一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的菌株P seudomonassp.BWL918， 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 菌种保藏号为CGMCC11994。 0016 一种转化花生壳水解物制备微生物絮凝剂的工艺步骤如下： 步骤1、 将菌种P seudomonassp.BWL918接种到种子液培养基中， 28摇瓶过夜培 养制备种子液； 步骤2、 将种子液按1%比例转接到以花生壳水解物为碳源的发酵培养基中， 28， 180 rpm摇床培养48h； 步骤3、 将发酵培养基在4， 10000rpm离心10min， 去除沉淀， 上清。
18、液即为液体生物絮 凝剂； 步骤4、 向液体发酵液中加入2倍体积预冷的无水乙醇， 离心收集沉淀物并冷冻干燥得 到纯品生物絮凝剂。 0017 所述的步骤1中， 所用菌种为假单胞菌P seudomonassp.BWL918， 专利菌种保藏 号为CGMCC11994， 能利用花生壳水解物生产微生物絮凝剂； 所述的步骤1中， 种子液培养基成分如下： 葡萄糖1g/L， 可溶性淀粉1g/L， 酵母粉1g/ L， 胰蛋白胨1g/L， 酸水解酪蛋白1g/L， 七水硫酸镁0.1g/L， 磷酸氢二钾0.6g/L； 所述的步骤2中， 花生壳水解物的制备过程如下： 将花生壳用粉碎机粉碎， 用60目网筛 过筛， 按100。
19、g/L的浓度将花生壳粉加入1.7% （W/W） 的H2SO4溶液中， 121水解120min， 冷却 后， 离心收集上清液， 用Ca(OH)2调节pH至7， 再次离心收集上清液获得花生壳水解物； 所述的步骤2中， 发酵培养基的成分如下： 花生壳水解物300mL/L、 酵母粉为氮源3g/ L、 七水硫酸镁0.1g/L、 磷酸氢二钾0.6g/L。 0018 具体实施例1： 微生物絮凝剂制备方法， 具体步骤如下： 1、 菌种分离与鉴定： 利用梯度稀释法分离筛选功能菌株， 所述的筛选培养基成分为： 葡 萄糖0.5g/L， 可溶性淀粉0.5g/L， 酵母粉0.5g/L， 胰蛋白胨0.5g/L， 酸水解酪。
20、蛋白0.5 g/L， 七水硫酸镁0.05g/L， 磷酸氢二钾0.3g/L。 菌种分离获得后， 通过四区划线法纯化法得 到纯种菌株， 经16SrRNA序列分析确定本发明所用菌种为假单胞菌 （P seudomonas sp.） ， 并将其命名为P seudomonassp.BWL918， 专利菌种保藏号为CGMCC11994。 0019 2、 种子液制备： 将假单胞菌P seudomonassp.BWL918接种至种子液培养基中， 种子液培养基组分如下： 葡萄糖1g/L， 可溶性淀粉1g/L， 酵母粉1g/L， 胰蛋白胨1g/L， 酸 水解酪蛋白1g/L， 七水硫酸镁0.1g/L， 磷酸氢二钾0.。
21、6g/L。 然后28， 180rpm摇床过夜 培养。 0020 3、 发酵制备微生物絮凝剂： 将步骤2获得的种子液按1%比例接种至发酵培养基中， 发酵培养基组分如下： 花生壳粉水解物300mL/L;酵母粉3g/L、 七水硫酸镁0.1g/L、 磷酸 氢二钾0.6g/L； 然后28， 180rpm摇床发酵培养48h。 0021 4、 微生物絮凝剂提取： 将步骤3获得的发酵液在10000rpm条件下离心10min， 收 集上清液； 向上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇， 10000rpm离心10min收集沉淀， 用 70%乙醇洗涤沉淀后， 冷冻干燥获得微生物絮凝剂纯品。 0022 5、 絮凝活性测定： 向60mL5g/L高岭土悬液中加入100 L发酵液； 快速搅拌2 说明书 3/4 页 5 CN 106119144 A 5 min， 然后缓慢搅拌1min， 静置沉降1min， 取上清液用722型分光光度计测定OD550值， 以加 入100 L蒸馏水作为对照， 通过计算絮凝率表示絮凝活性。 絮凝率=(A-B)/A100%， A代表 加蒸馏水时上清液的OD550值， B代表加发酵液时上清液的OD550值。 所获得的微生物絮凝剂对 高岭土悬浊液具有明显的絮凝效果。 说明书 4/4 页 6 CN 106119144 A 6 。