一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用.pdf

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs107401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、rs4344933、rs4488809等63个SNP的组合，该标志物可用于制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒。

1.一种检测与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物的特异性引物及荧光探针对的组合物，其特征在于，由下列特异性引物及荧光探针对组成，其特异性引物为：rs107401的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs465498的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs663414的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；rs622917的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs636586的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs741061的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs855641的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs948783的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs1544694的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs1663689的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2030378的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；rs2225588的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs2317683的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs2395166的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs2405271的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs2788713的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs3130975的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs4344933的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；rs4488809的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs4493136的引物序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；rs4669621的引物序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；rs4697406的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs4749794的引物序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；rs4809957的引物序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；rs6102795的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；rs6490820的引物序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；rs9317873的引物序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；rs9373105的引物序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；rs9397087的引物序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；rs9463490的引物序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；rs10066153的引物序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；rs11144475的引物序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；rs11155286的引物序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；rs11264579的引物序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；rs11907465的引物序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；rs12050469的引物序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；rs12992554的引物序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；rs13000907的引物序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；rs16883398的引物序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；rs16959825的引物序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；rs17058190的引物序列为SEQ ID No：161和SEQ ID No：162；rs17075390的引物序列为SEQ ID No：165和SEQ ID No：166；rs17728461的引物序列为SEQ ID No：169和SEQ ID No：170；rs1014588的引物序列为SEQ ID No：173和SEQ ID No：174；rs1039119的引物序列为SEQ ID No：177和SEQ ID No：178；rs1726744的引物序列为SEQ ID No：181和SEQ ID No：182；rs2285947的引物序列为SEQ ID No：185和SEQ ID No：186；rs2895680的引物序列为SEQ ID No：189和SEQ ID No：190；rs3969178的引物序列为SEQ ID No：193和SEQ ID No：194；rs4693311的引物序列为SEQ ID No：197和SEQ ID No：198；rs4766994的引物序列为SEQ ID No：201和SEQ ID No：202；rs4894545的引物序列为SEQ ID No：205和SEQ ID No：206；rs4940849的引物序列为SEQ ID No：209和SEQ ID No：210；rs6490294的引物序列为SEQ ID No：213和SEQ ID No：214；rs6780858的引物序列为SEQ ID No：217和SEQ ID No：218；rs9439527的引物序列为SEQ ID No：221和SEQ ID No：222；rs9556016的引物序列为SEQ ID No：225和SEQ ID No：226；rs12002185的引物序列为SEQ ID No：229和SEQ ID No：230；rs12793370的引物序列为SEQ ID No：233和SEQ ID No：234；rs1549058的引物序列为SEQ ID No：237和SEQ ID No：238；rs2736100的引物序列为SEQ ID No：241和SEQ ID No：242；rs6043705的引物序列为SEQ ID No：245和SEQ ID No：246；rs11699642的引物序列为SEQ ID No：249和SEQ ID No：250；其荧光探针对为：rs107401的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs465498的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；rs622917的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；rs636586的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs741061的荧光探针对序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs855641的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；rs948783的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs1544694的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs1663689的荧光探针对序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs2030378的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2225588的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs2317683的荧光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs2395166的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs2405271的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；rs2788713的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs3130975的荧光探针对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs4344933的荧光探针对序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；rs4488809的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；rs4493136的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs4669621的荧光探针对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs4697406的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；rs4749794的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs4809957的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs6102795的荧光探针对序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；rs6490820的荧光探针对序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；rs9317873的荧光探针对序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；rs9373105的荧光探针对序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；rs9397087的荧光探针对序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；rs9463490的荧光探针对序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；rs10066153的荧光探针对序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；rs11144475的荧光探针对序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128；rs11155286的荧光探针对序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；rs11264579的荧光探针对序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；rs11907465的荧光探针对序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；rs12050469的荧光探针对序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；rs12992554的荧光探针对序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：148；rs13000907的荧光探针对序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；rs16883398的荧光探针对序列为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；rs16959825的荧光探针对序列为SEQ ID No：159和SEQ ID No：160；rs17058190的荧光探针对序列为SEQ ID No：163和SEQ ID No：164；rs17075390的荧光探针对序列为SEQ ID No：167和SEQ ID No：168；rs17728461的荧光探针对序列为SEQ ID No：171和SEQ ID No：172；rs1014588的荧光探针对序列为SEQ ID No：175和SEQ ID No：176；rs1039119的荧光探针对序列为SEQ ID No：179和SEQ ID No：180；rs1726744的荧光探针对序列为SEQ ID No：183和SEQ ID No：184；rs2285947的荧光探针对序列为SEQ ID No：187和SEQ ID No：188；rs2895680的荧光探针对序列为SEQ ID No：191和SEQ ID No：192；rs3969178的荧光探针对序列为SEQ ID No：195和SEQ ID No：196；rs4693311的荧光探针对序列为SEQ ID No：199和SEQ ID No：200；rs4766994的荧光探针对序列为SEQ ID No：203和SEQ ID No：204；rs4894545的荧光探针对序列为SEQ ID No：207和SEQ ID No：208；rs4940849的荧光探针对序列为SEQ ID No：211和SEQ ID No：212；rs6490294的荧光探针对序列为SEQ ID No：215和SEQ ID No：216；rs6780858的荧光探针对序列为SEQ ID No：219和SEQ ID No：220；rs9439527的荧光探针对序列为SEQ ID No：223和SEQ ID No：224；rs9556016的荧光探针对序列为SEQ ID No：227和SEQ ID No：228；rs12002185的荧光探针对序列为SEQ ID No：231和SEQ ID No：232；rs12793370的荧光探针对序列为SEQ ID No：235和SEQ ID No：236；rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：239和SEQ ID No：240；rs2736100的荧光探针对序列为SEQ ID No：243和SEQ ID No：244；rs6043705的荧光探针对序列为SEQ ID No：247和SEQ ID No：248；rs11699642的荧光探针对序列为SEQ ID No：251和SEQ ID No：252。 2.权利要求1所述的组合物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。 3.一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs107401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、rs4344933、rs4488809、rs4493136、rs4669621、rs4697406、rs4749794、rs4809957、rs6102795、rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rs10066153、rs11144475、rs11155286、rs11264579、rs11907465、rs12050469、rs12992554、rs13000907、rs16883398、rs16959825、rs17058190、rs17075390、rs17728461、rs1014588、rs1039119、rs1726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rs12002185、rs12793370、rs1549058、rs2736100、rs6043705和rs11699642；该试剂盒含有权利要求1所述的组合物。 4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。

发明领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与原发性肺癌辅助诊断相关的 SNP标志物及其应用。

背景技术

肺癌是目前全球受累人数最多的恶性肿瘤。据国际癌症研究署(IARC)估计，2008 年肺癌新发病例160.7万人，死亡137.5万人，位居全球范围内肿瘤发病率和死亡率的 首位。由于持续增长的烟草消费、环境污染以及生活方式的改变，近二十年来，我国肺 癌发病和死亡一直呈上升趋势，仅2000年至2005年间，中国肺癌的发病人数和因肺癌 死亡的人数分别增加了12万和10万，据估计，2008年我国男性肺癌发病率为45.9/10 万，女性为21.3/10万，高于世界的平均水平并接近发达的工业化国家水平。英国著名 肿瘤学家R.Peto预言：如果中国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺 癌将超过100万，成为世界第一肺癌大国。由此可见，肺癌是威胁全球及我国居民生 命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生问题。

自20世纪60年代Doll和Hill通过病例-对照研究和队列研究首次发现吸烟与肺癌 的关系以来，烟草暴露已经被认为是肺癌发生的最主要环境危险因素。研究表明，吸烟 者发生肺癌的风险可比非吸烟者高出10倍。肺癌家庭聚集性的研究显示，遗传因素在 肺癌的发生中同样扮演重要角色。双生子研究表明，肺癌是遗传与环境共同作用的结果。 流行病学研究表明，80％以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20％的吸烟者发 生肺癌，说明在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。其中 单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)起重要作用。

SNP是一类基于单碱基变异引起的DNA多态性，被遗传学界称为第三代遗传标 记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基 转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性 标记，占大约90％。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体 对疾病，特别是复杂疾病的易感性和对环境因素、药物反应的差异。因此SNP可能 是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP 谱预测疾病的发生，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景，而且通过SNP 预测谱的构建，还可以对疾病作出前瞻性的诊断。近年来，利用SNP预测疾病的发 生发展已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾 病预测上的应用价值已初见端倪。

然而，目前还没有将SNP应用于原发性肺癌诊断的报道，若能筛选出原发性肺 癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国原发性肺癌诊断 现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP 标志物及其应用。

本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性荧光探针对。

本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和特异性荧光探针 在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第五个目的是提供原发性肺癌辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究原发性肺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中 的单核苷酸多态性，寻找一组与原发性肺癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研 制出可便于临床应用的原发性肺癌辅助诊断试剂盒，为原发性肺癌的筛查和诊断提供数 据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与原发性肺癌辅助诊断相关的SNP标志物，该标志物为rs107401、rs465498、 rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、 rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、 rs4344933、rs4488809、rs4493136、rs4669621、rs4697406、rs4749794、rs4809957、 rs6102795、rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rs10066153、 rs11144475、rs11155286、rs11264579、rs11907465、rs12050469、rs12992554、rs13000907、 rs16883398、rs16959825、rs17058190、rs17075390、rs17728461、rs1014588、rs1039119、 rs1726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、 rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rs12002185、rs12793370、 rs1549058、rs2736100、rs6043705和rs11699642的组合。

所述的SNP标志物的特异性引物，这些引物为：

rs107401的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs465498的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs663414的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10； rs622917的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs636586的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs741061的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22； rs855641的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs948783的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs1544694的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34； rs1663689的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2030378的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；rs2225588的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46； rs2317683的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs2395166的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs2405271的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58； rs2788713的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs3130975的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs4344933的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70； rs4488809的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs4493136的引物序列为 SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；rs4669621的引物序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；rs4697406的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs4749794的引物 序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；rs4809957的引物序列为SEQ ID No：93和 SEQ ID No：94；rs6102795的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；rs6490820 的引物序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；rs9317873的引物序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；rs9373105的引物序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；rs9397087的引物序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；rs9463490的引 物序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；rs10066153的引物序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；rs11144475的引物序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；rs11155286的引物序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；rs11264579的 引物序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；rs11907465的引物序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；rs12050469的引物序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；rs12992554的引物序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；rs13000907的 引物序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；rs16883398的引物序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；rs16959825的引物序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；rs17058190的引物序列为SEQ ID No：161和SEQ ID No：162；rs17075390的 引物序列为SEQ ID No：165和SEQ ID No：166；rs17728461的引物序列为SEQ ID No：169和SEQ ID No：170；rs1014588的引物序列为SEQ ID No：173和SEQ ID No：174；rs1039119的引物序列为SEQ ID No：177和SEQ ID No：178；rs1726744的引 物序列为SEQ ID No：181和SEQ ID No：182；rs2285947的引物序列为SEQ ID No：185 和SEQ ID No：186；rs2895680的引物序列为SEQ ID No：189和SEQ ID No：190； rs3969178的引物序列为SEQ ID No：193和SEQ ID No：194；rs4693311的引物序列为 SEQ ID No：197和SEQ ID No：198；rs4766994的引物序列为SEQ ID No：201和SEQ ID No：202；rs4894545的引物序列为SEQ ID No：205和SEQ ID No：206；rs4940849的引 物序列为SEQ ID No：209和SEQ ID No：210；rs6490294的引物序列为SEQ ID No：213 和SEQ ID No：214；rs6780858的引物序列为SEQ ID No：217和SEQ ID No：218； rs9439527的引物序列为SEQ ID No：221和SEQ ID No：222；rs9556016的引物序列为 SEQ ID No：225和SEQ ID No：226；rs12002185的引物序列为SEQ ID No：229和SEQ ID No：230；rs12793370的引物序列为SEQ ID No：233和SEQ ID No：234；rs1549058 的引物序列为SEQ ID No：237和SEQ ID No：238；rs2736100的引物序列为SEQ ID No：241和SEQ ID No：242；rs6043705的引物序列为SEQ ID No：245和SEQ ID No：246；rs11699642的引物序列为SEQ ID No：249和SEQ ID No：250。

所述的SNP标志物的特异性荧光探针对，这些荧光探针为：

rs107401的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs465498的荧光探针 对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No：11 和SEQ ID No：12；rs622917的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16； rs636586的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs741061的荧光探针对 序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs855641的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和 SEQ ID No：28；rs948783的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs1544694 的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs1663689的荧光探针对序列为 SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs2030378的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2225588的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs2317683的荧 光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs2395166的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs2405271的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60； rs2788713的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs3130975的荧光探针 对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs4344933的荧光探针对序列为SEQ ID No：71 和SEQ ID No：72；rs4488809的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76； rs4493136的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs4669621的荧光探针 对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs4697406的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；rs4749794的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92； rs4809957的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs6102795的荧光探针 对序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；rs6490820的荧光探针对序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；rs9317873的荧光探针对序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；rs9373105的荧光探针对序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；rs9397087 的荧光探针对序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；rs9463490的荧光探针对序列为 SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；rs10066153的荧光探针对序列为SEQ ID No：123和 SEQ ID No：124；rs11144475的荧光探针对序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128； rs11155286的荧光探针对序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；rs11264579的荧光 探针对序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；rs11907465的荧光探针对序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；rs12050469的荧光探针对序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；rs12992554的荧光探针对序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：148；rs13000907 的荧光探针对序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；rs16883398的荧光探针对序列 为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；rs16959825的荧光探针对序列为SEQ ID No：159 和SEQ ID No：160；rs17058190的荧光探针对序列为SEQ ID No：163和SEQ ID No：164； rs17075390的荧光探针对序列为SEQ ID No：167和SEQ ID No：168；rs17728461的荧光 探针对序列为SEQ ID No：171和SEQ ID No：172；rs1014588的荧光探针对序列为SEQ ID No：175和SEQ ID No：176；rs1039119的荧光探针对序列为SEQ ID No：179和SEQ ID No：180；rs1726744的荧光探针对序列为SEQ ID No：183和SEQ ID No：184；rs2285947 的荧光探针对序列为SEQ ID No：187和SEQ ID No：188；rs2895680的荧光探针对序列 为SEQ ID No：191和SEQ ID No：192；rs3969178的荧光探针对序列为SEQ ID No：195 和SEQ ID No：196；rs4693311的荧光探针对序列为SEQ ID No：199和SEQ ID No：200； rs4766994的荧光探针对序列为SEQ ID No：203和SEQ ID No：204；rs4894545的荧光探 针对序列为SEQ ID No：207和SEQ ID No：208；rs4940849的荧光探针对序列为SEQ ID No：211和SEQ ID No：212；rs6490294的荧光探针对序列为SEQ ID No：215和SEQ ID No：216；rs6780858的荧光探针对序列为SEQ ID No：219和SEQ ID No：220；rs9439527 的荧光探针对序列为SEQ ID No：223和SEQ ID No：224；rs9556016的荧光探针对序列 为SEQ ID No：227和SEQ ID No：228；rs12002185的荧光探针对序列为SEQ ID No：231 和SEQ ID No：232；rs12793370的荧光探针对序列为SEQ ID No：235和SEQ ID No：236； rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：239和SEQ ID No：240；rs2736100的荧光探 针对序列为SEQ ID No：243和SEQ ID No：244；rs6043705的荧光探针对序列为SEQ ID No：247和SEQ ID No：248；rs11699642的荧光探针对序列为SEQ ID No：251和SEQ ID No：252。

所述的SNP标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性荧光探针对在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应 用。

一种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs107401、 rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、 rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、 rs3130975、rs4344933、rs4488809、rs4493136、rs4669621、rs4697406、rs4749794、 rs4809957、rs6102795、rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、 rs10066153、rs11144475、rs11155286、rs11264579、rs11907465、rs12050469、rs12992554、 rs13000907、rs16883398、rs16959825、rs17058190、rs17075390、rs17728461、rs1014588、 rs1039119、rs1726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、 rs4894545、rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rs12002185、 rs12793370、rs1549058、rs2736100、rs6043705和rs11699642。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性引物和/或特异性荧光 探针。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性引物为：

rs107401的引物序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs465498的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；rs663414的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10； rs622917的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs636586的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；rs741061的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22； rs855641的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs948783的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；rs1544694的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34； rs1663689的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2030378的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；rs2225588的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46； rs2317683的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs2395166的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；rs2405271的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58； rs2788713的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs3130975的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；rs4344933的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70； rs4488809的引物序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs4493136的引物序列为 SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；rs4669621的引物序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；rs4697406的引物序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs4749794的引物 序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；rs4809957的引物序列为SEQ ID No：93和 SEQ ID No：94；rs6102795的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；rs6490820 的引物序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；rs9317873的引物序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；rs9373105的引物序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；rs9397087的引物序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；rs9463490的引 物序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；rs10066153的引物序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；rs11144475的引物序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；rs11155286的引物序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；rs11264579的 引物序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；rs11907465的引物序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；rs12050469的引物序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；rs12992554的引物序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；rs13000907的 引物序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；rs16883398的引物序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；rs16959825的引物序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；rs17058190的引物序列为SEQ ID No：161和SEQ ID No：162；rs17075390的 引物序列为SEQ ID No：165和SEQ ID No：166；rs17728461的引物序列为SEQ ID No：169和SEQ ID No：170；rs1014588的引物序列为SEQ ID No：173和SEQ ID No：174；rs1039119的引物序列为SEQ ID No：177和SEQ ID No：178；rs1726744的引 物序列为SEQ ID No：181和SEQ ID No：182；rs2285947的引物序列为SEQ ID No：185 和SEQ ID No：186；rs2895680的引物序列为SEQ ID No：189和SEQ ID No：190； rs3969178的引物序列为SEQ ID No：193和SEQ ID No：194；rs4693311的引物序列为 SEQ ID No：197和SEQ ID No：198；rs4766994的引物序列为SEQ ID No：201和SEQ ID No：202；rs4894545的引物序列为SEQ ID No：205和SEQ ID No：206；rs4940849的引 物序列为SEQ ID No：209和SEQ ID No：210；rs6490294的引物序列为SEQ ID No：213 和SEQ ID No：214；rs6780858的引物序列为SEQ ID No：217和SEQ ID No：218； rs9439527的引物序列为SEQ ID No：221和SEQ ID No：222；rs9556016的引物序列为 SEQ ID No：225和SEQ ID No：226；rs12002185的引物序列为SEQ ID No：229和SEQ ID No：230；rs12793370的引物序列为SEQ ID No：233和SEQ ID No：234；rs1549058 的引物序列为SEQ ID No：237和SEQ ID No：238；rs2736100的引物序列为SEQ ID No：241和SEQ ID No：242；rs6043705的引物序列为SEQ ID No：245和SEQ ID No：246；rs11699642的引物序列为SEQ ID No：249和SEQ ID No：250。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的SNP标志物的特异性荧光探针对为：

rs107401的荧光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs465498的荧光探针 对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No：11 和SEQ ID No：12；rs622917的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16； rs636586的荧光探针对序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs741061的荧光探针对 序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；rs855641的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和 SEQ ID No：28；rs948783的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs1544694 的荧光探针对序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs1663689的荧光探针对序列为 SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；rs2030378的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；rs2225588的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs2317683的荧 光探针对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs2395166的荧光探针对序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；rs2405271的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60； rs2788713的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs3130975的荧光探针 对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs4344933的荧光探针对序列为SEQ ID No：71 和SEQ ID No：72；rs4488809的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76； rs4493136的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs4669621的荧光探针 对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs4697406的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；rs4749794的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92； rs4809957的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs6102795的荧光探针 对序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；rs6490820的荧光探针对序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；rs9317873的荧光探针对序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；rs9373105的荧光探针对序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；rs9397087 的荧光探针对序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；rs9463490的荧光探针对序列为 SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；rs10066153的荧光探针对序列为SEQ ID No：123和 SEQ ID No：124；rs11144475的荧光探针对序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128； rs11155286的荧光探针对序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；rs11264579的荧光 探针对序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；rs11907465的荧光探针对序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；rs12050469的荧光探针对序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；rs12992554的荧光探针对序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：148；rs13000907 的荧光探针对序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；rs16883398的荧光探针对序列 为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；rs16959825的荧光探针对序列为SEQ ID No：159 和SEQ ID No：160；rs17058190的荧光探针对序列为SEQ ID No：163和SEQ ID No：164； rs17075390的荧光探针对序列为SEQ ID No：167和SEQ ID No：168；rs17728461的荧光 探针对序列为SEQ ID No：171和SEQ ID No：172；rs1014588的荧光探针对序列为SEQ ID No：175和SEQ ID No：176；rs1039119的荧光探针对序列为SEQ ID No：179和SEQ ID No：180；rs1726744的荧光探针对序列为SEQ ID No：183和SEQ ID No：184；rs2285947 的荧光探针对序列为SEQ ID No：187和SEQ ID No：188；rs2895680的荧光探针对序列 为SEQ ID No：191和SEQ ID No：192；rs3969178的荧光探针对序列为SEQ ID No：195 和SEQ ID No：196；rs4693311的荧光探针对序列为SEQ ID No：199和SEQ ID No：200； rs4766994的荧光探针对序列为SEQ ID No：203和SEQ ID No：204；rs4894545的荧光探 针对序列为SEQ ID No：207和SEQ ID No：208；rs4940849的荧光探针对序列为SEQ ID No：211和SEQ ID No：212；rs6490294的荧光探针对序列为SEQ ID No：215和SEQ ID No：216；rs6780858的荧光探针对序列为SEQ ID No：219和SEQ ID No：220；rs9439527 的荧光探针对序列为SEQ ID No：223和SEQ ID No：224；rs9556016的荧光探针对序列 为SEQ ID No：227和SEQ ID No：228；rs12002185的荧光探针对序列为SEQ ID No：231 和SEQ ID No：232；rs12793370的荧光探针对序列为SEQ ID No：235和SEQ ID No：236； rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：239和SEQ ID No：240；rs2736100的荧光探 针对序列为SEQ ID No：243和SEQ ID No：244；rs6043705的荧光探针对序列为SEQ ID No：247和SEQ ID No：248；rs11699642的荧光探针对序列为SEQ ID No：251和SEQ ID No：252。

所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、 dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库： 以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。(2)基因型检测：选择原发性肺癌病例，与原发性肺癌病例年龄、性别匹配的对 照，利用高密度SNP芯片，在全基因组范围内找出与原发性肺癌相关的SNP。(3)对 筛选出的阳性关联SNP，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4) 原发性肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据原发性肺癌病例和健康对照中基因型分布频率 有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，TaqMan基因分 型进行单个位点的检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)临床确诊为原发性肺癌；

(2)与病例年龄、性别匹配的对照；

本研究共采用9934例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.Affymetrix 6.0芯片检测

(1)取受试者全基因组DNA样本；

(2)在Affymetrix 6.0芯片(购于美国昂飞公司，下同)上进行全基因组扫描；

(3)检测并比较各基因型在原发性肺癌病例与健康对照中的分别差异。

4.单个SNP的TaqMan基因分型

(1)取受试者DNA样本；

(2)设计单个SNP的特异性引物和特异性荧光探针对；

(3)进行PCR反应；

(4)检测并比较原发性肺癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。

5.诊断试剂盒制备方法

Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描和单个SNP检测后确定原发性肺癌病例与 健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP，作为原发性肺癌诊断的指标。最后 筛选出的与原发性肺癌发病有关的SNP组成辅助诊断试剂盒rs107401、rs465498、 rs663414、rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、 rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、 rs2788713、rs3130975、rs4344933、rs4488809、rs4493136、rs4669621、 rs4697406、rs4749794、rs4809957、rs6102795、rs6490820、rs9317873、 rs9373105、rs9397087、rs9463490、rs10066153、rs11144475、rs11155286、 rs11264579、rs11907465、rs12050469、rs12992554、rs13000907、rs16883398、 rs16959825、rs17058190、rs17075390、rs17728461、rs1014588、rs1039119、 rs1726744、rs2285947、rs2895680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、 rs4894545、rs4940849、rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、 rs12002185、rs12793370、rs1549058、rs2736100、rs6043705和rs11699642)。 诊断试剂可以包括这些SNP的特异性引物和特异性荧光探针对，以及Taq酶、dNTP 等试剂。

6.统计分析方法

运用χ2检验(用于分类变量)或者student检验(用于连续性变量)比较人口 学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联 分析。

为了进一步研究这63个SNP构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了 一个数学公式，综合考虑每个SNP与原发性肺癌发病的正、负关联情况和联系强度。 具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”， 变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑 每个SNP的情况给每个研究研究对照确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下： 危险分值＝(-0.15×rs9439527的评分)+(0.33×rs17728461的评分)+(0.14×rs2225588 的评分)+(0.25×rs510321的评分)+(-0.12×rs663414的评分)+(0.14×rs4669621的 评分)+(0.25×rs6490294的评分)+(0.13×rs4894545的评分)+(0.14×rs6780858的 评分)+(-0.16×rs107401的评分)+(-0.16×rs1663689的评分)+(0.16×rs4697406的 评分)+(0.18×rs1014588的评分)+(-0.13×rs2405271的评分)+(-0.16×rs6490820的评 分)+(-0.20×rs9463490的评分)+(0.27×rs2788713的评分)+(0.22×rs855641的评分)+ (-0.22×rs3130975的评分)+(-0.16×rs9397087的评分)+(0.20×rs622917的评分)+ (0.20×rs12793370的评分)+(0.14×rs11155286的评分)+(0.15×rs2285947的评分) +(0.21×rs2395166的评分)+(0.22×rs741061的评分)+(-0.17×rs17058190的评分) +(-0.17×rs11144475的评分)+(-0.14×rs12002185的评分)+(0.16×rs4749794的评 分)+(-0.14×rs16883398的评分)+(0.13×rs1726744的评分)+(-0.17×rs2030378 的评分)+(0.19×rs2895680的评分)+(0.25×rs4940849的评分)+(-0.22×rs3969178 的评分)+(0.19×rs6102795的评分)+(-0.15×rs17075390的评分)+(0.14×rs9317873 的评分)+(0.13×rs9556016的评分)+(0.17×rs4809957的评分)+(-0.24×rs12050469 的评分)+(0.14×rs16959825的评分)+(0.26×rs9373105的评分)+(0.12×rs948783 的评分)+(-0.13×rs11907465的评分)+(-0.22×rs6043705的评分)+(0.16×rs2317683 的评分)+(0.17×rs11264579的评分)+(0.17×rs636586的评分)+(-0.14×rs13000907 的评分)+(-0.17×rs1544694的评分)+(0.25×rs12992554的评分)+(0.18×rs11699642 的评分)+(-0.17×rs4493136的评分)+(0.18×rs4766994的评分)+(0.26×rs4344933 的评分)+(0.18×rs4488809的评分)+(0.28×rs1039119的评分)+(-0.15×rs4693311 的评分)+(0.16×rs2736100的评分)+(-0.28×rs465498的评分)+(-0.17×rs10066153 的评分))，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的5408 例样本中。

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平 P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述2331例符合条件的原发性肺癌病例及3077例健康对照中，两组年龄、性 别均衡可比。我们将这两组人群经Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描获得相关结 果。

根据Affymetrix6.0芯片检测，本发明人检测到在“原发性肺癌病例”组和“健 康对照”组中基因型分布频率存在差异的SNP包括：rs107401、rs465498、rs663414、 rs622917、rs636586、rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、rs2030378、 rs2225588、rs2317683、rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、rs4344933、 rs4488809、rs4493136、rs4669621、rs4697406、rs4749794、rs4809957、rs6102795、 rs6490820、rs9317873、rs9373105、rs9397087、rs9463490、rs10066153、rs11144475、 rs11155286、rs11264579、rs11907465、rs12050469、rs12992554、rs13000907、rs16883398、 rs16959825、rs17058190、rs17075390、rs17728461、rs1014588、rs1039119、rs1726744、 rs2283947、rs2893680、rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894343、rs4940849、 rs6490294、rs6780858、rs9439527、rs9556016、rs12002185、rs12793370、rs1549058、 rs2736100、rs6043705和rs11699642。

根据上述检测结果，我们将这63个与原发性肺癌发病相关的SNP在另外2283 例原发性肺癌病例和与其年龄、性别匹配的2243例健康对照中进行了单个SNP的检 测，结果与芯片检测一致。

单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这63个SNP与原发性肺癌的发 病存在着显著关联。

进一步分析这63个SNP的组合用于原发性肺癌诊断的效果，发现其组合能够很 好的区分病例与对照。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于原发性肺癌辅助诊断的试剂盒， 包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物、特异性荧光探针对和其他检 测试剂。

具体而言，这63个SNP的组合，或者这63个SNP的特异性引物及特异性荧光探 针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于原发性肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准 确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的SNP标志物作为原发性肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、 易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为原 发性肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于原发性肺癌的辅助诊断， 有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化 的防治方案提供支持。

(3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组芯片扫描以获取疾 病相关的SNP谱，并应用TaqMan基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策 略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病 生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄、性别、吸烟等对疾病发展的影响因素，研究SNP在原发性 肺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于原发性肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。 因此，本发明获得了原发性肺癌发病相关SNP谱和特异性标志物；通过SNP生物标志 物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得原发性肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快 速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新 型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1：显示全基因组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。

显示原发性肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。

具体实施方式

实施例1  样品的收集和样品资料的整理

发明人于2005月4月开始至2011年1月从南京医科大学肿瘤中心收集了大量的 原发性肺癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了9934例符合下 列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP TaqMan基因分型的实验样品：

1、病理组织学确诊的原发性肺癌患者；

2、与病例年龄、性别匹配的健康对照；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2  外周血DNA中SNP的全基因组扫描

在上述符合条件的2331例原发性肺癌患者和3077例健康对照中，两组年龄、性 别匹配。将这两组人群经Affymetrix6.0芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心 10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm 离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠， 14.4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同) 和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10 分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液 (氯仿∶异戊醇＝24∶1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离 心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的 冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清 后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、进行全基因组扫描；

9、数据分析与处理：在“原发性肺癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布 频率有显著差异的SNP在上文中已经罗列出，结果见表1。

表1 病例组与对照组全基因组关联分析结果

实施例  3单个SNP的TaqMan基因分型

将上述全基因组扫描发现与原发性肺癌发病有关的SNP在另外2283原发性肺癌 病例和2243健康对照中进行检测，具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心 10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm 离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀， 37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10 分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液 (氯仿∶异戊醇＝24∶1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟， 取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的 冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清 后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值) 在1.6-2.0。

8、进行TaqMan基因分型。对全基因组扫描发现的63个阳性关联的SNP设计 特异性引物和特异性荧光探针对。反应体系包括2.5μl 2X TaqMan基因分型Master  Mix、每对正向和反向引物的混合物0.25μl(20pmol/μl)、0.125μl TaqMan荧光探针 (10pmol/μl，同时含有相应的两种等位基因的荧光探针)和1.25μl双蒸水。加入0.5μl DNA。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR反应条件为：95℃、5 分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。

9、基因型判读：采用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪进行。

10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的addtive模型比较每个SNP的 三种基因型在病例组合对照组中分布频率的差异，结果与全基因组扫描类似不再列 出。

实施例4  利用危险度评分方法进一步分析SNP与原发性肺癌发病

根据上述结果，本发明人通过对2组样品(“原发性肺癌病例组”和“健康对照组”) 基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回 归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进 而评估这些SNP对原发性肺癌发病的判断能力。对63个SNP标志物的联合分析发 现，这63个SNP以72.47％的AUC将健康对照组和原发性肺癌病例组分开，最佳临 界点的灵敏度为64.41％，特异度：69.71％(图1)。

因此，本发明人证明了采用rs107401、rs465498、rs663414、rs622917、rs636586、 rs741061、rs855641、rs948783、rs1544694、rs1663689、rs2030378、rs2225588、rs2317683、 rs2395166、rs2405271、rs2788713、rs3130975、rs4344933、rs4488809、rs4493136、 rs4669621、rs4697406、rs4749794、rs4809957、rs6102795、rs6490820、rs9317873、 rs9373105、rs9397087、rs9463490、rs10066153、rs11144475、rs11155286、rs11264579、 rs11907465、rs12050469、rs12992554、rs13000907、rs16883398、rs16959825、rs17058190、 rs17075390、rs17728461、rs1014588、rs1039119、rs1726744、rs2285947、rs2895680、 rs3969178、rs4693311、rs4766994、rs4894545、rs4940849、rs6490294、rs6780858、 rs9439527、rs9556016、rs12002185、rs12793370、rs1549058、rs2736100、rs6043705和 rs11699642的组合能够很好地将健康对照和原发性肺癌患者区分。

实施例5  用于原发性肺癌辅助诊断SNP试剂盒的制作

SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和TaqMan基因分 型技术。试剂盒含有一批SNP特异性引物(包括下列引物：rs107401的引物序列为 SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；rs465498的引物序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6； rs663414的引物序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；rs622917的引物序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；rs636586的引物序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18； rs741061的引物序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；rs855641的引物序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；rs948783的引物序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30； rs1544694的引物序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；rs1663689的引物序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；rs2030378的引物序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42； rs2225588的引物序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；rs2317683的引物序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；rs2395166的引物序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54； rs2405271的引物序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；rs2788713的引物序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；rs3130975的引物序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66； rs4344933的引物序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；rs4488809的引物序列为 SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；rs4493136的引物序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；rs4669621的引物序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；rs4697406的引物 序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；rs4749794的引物序列为SEQ ID No：89和 SEQ ID No：90；rs4809957的引物序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；rs6102795 的引物序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；rs6490820的引物序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；rs9317873的引物序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；rs9373105的引物序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；rs9397087的引 物序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；rs9463490的引物序列为SEQ ID No：117 和SEQ ID No：118；rs10066153的引物序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122； rs11144475的引物序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；rs11155286的引物序列 为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；rs11264579的引物序列为SEQ ID No：133和 SEQ ID No：134；rs11907465的引物序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138； rs12050469的引物序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；rs12992554的引物序列 为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；rs13000907的引物序列为SEQ ID No：149和 SEQ ID No：150；rs16883398的引物序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154； rs16959825的引物序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；rs17058190的引物序列 为SEQ ID No：161和SEQ ID No：162；rs17075390的引物序列为SEQ ID No：165和 SEQ ID No：166；rs17728461的引物序列为SEQ ID No：169和SEQ ID No：170； rs1014588的引物序列为SEQ ID No：173和SEQ ID No：174；rs1039119的引物序列为 SEQ ID No：177和SEQ ID No：178；rs1726744的引物序列为SEQ ID No：181和SEQ ID No：182；rs2285947的引物序列为SEQ ID No：185和SEQ ID No：186；rs2895680的引 物序列为SEQ ID No：189和SEQ ID No：190；rs3969178的引物序列为SEQ ID No：193 和SEQ ID No：194；rs4693311的引物序列为SEQ ID No：197和SEQ ID No：198； rs4766994的引物序列为SEQ ID No：201和SEQ ID No：202；rs4894545的引物序列为 SEQ ID No：205和SEQ ID No：206；rs4940849的引物序列为SEQ ID No：209和SEQ ID No：210；rs6490294的引物序列为SEQ ID No：213和SEQ ID No：214；rs6780858的引 物序列为SEQ ID No：217和SEQ ID No：218；rs9439527的引物序列为SEQ ID No：221 和SEQ ID No：222；rs9556016的引物序列为SEQ ID No：225和SEQ ID No：226； rs12002185的引物序列为SEQ ID No：229和SEQ ID No：230；rs12793370的引物序列 为SEQ ID No：233和SEQ ID No：234；rs1549058的引物序列为SEQ ID No：237和SEQ ID No：238；rs2736100的引物序列为SEQ ID No：241和SEQ ID No：242；rs6043705 的引物序列为SEQ ID No：245和SEQ ID No：246；rs11699642的引物序列为SEQ ID No：249和SEQ ID No：250)、特异性荧光探针对(包括下列荧光探针：rs107401的荧 光探针对序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；rs465498的荧光探针对序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；rs663414的荧光探针对序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12； rs622917的荧光探针对序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；rs636586的荧光探针对 序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；rs741061的荧光探针对序列为SEQ ID No：23 和SEQ ID No：24；rs855641的荧光探针对序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28； rs948783的荧光探针对序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；rs1544694的荧光探针对 序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；rs1663689的荧光探针对序列为SEQ ID No：39 和SEQ ID No：40；rs2030378的荧光探针对序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44； rs2225588的荧光探针对序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；rs2317683的荧光探针 对序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；rs2395166的荧光探针对序列为SEQ ID No：55 和SEQ ID No：56；rs2405271的荧光探针对序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60； rs2788713的荧光探针对序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；rs3130975的荧光探针 对序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；rs4344933的荧光探针对序列为SEQ ID No：71 和SEQ ID No：72；rs4488809的荧光探针对序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76； rs4493136的荧光探针对序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；rs4669621的荧光探针 对序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；rs4697406的荧光探针对序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；rs4749794的荧光探针对序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；rs4809957的荧光探针对序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；rs6102795的 荧光探针对序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；rs6490820的荧光探针对序列为 SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；rs9317873的荧光探针对序列为SEQ ID No：107和 SEQ ID No：108；rs9373105的荧光探针对序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112； rs9397087的荧光探针对序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；rs9463490的荧光探 针对序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；rs10066153的荧光探针对序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；rs11144475的荧光探针对序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128；rs11155286的荧光探针对序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132； rs11264579的荧光探针对序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；rs11907465的荧光 探针对序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；rs12050469的荧光探针对序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；rs12992554的荧光探针对序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：148；rs13000907的荧光探针对序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152； rs16883398的荧光探针对序列为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；rs16959825的荧光 探针对序列为SEQ ID No：159和SEQ ID No：160；rs17058190的荧光探针对序列为SEQ ID No：163和SEQ ID No：164；rs17075390的荧光探针对序列为SEQ ID No：167和SEQ ID No：168；rs17728461的荧光探针对序列为SEQ ID No：171和SEQ ID No：172； rs1014588的荧光探针对序列为SEQ ID No：175和SEQ ID No：176；rs1039119的荧光探 针对序列为SEQ ID No：179和SEQ ID No：180；rs1726744的荧光探针对序列为SEQ ID No：183和SEQ ID No：184；rs2285947的荧光探针对序列为SEQ ID No：187和SEQ ID No：188；rs2895680的荧光探针对序列为SEQ ID No：191和SEQ ID No：192；rs3969178 的荧光探针对序列为SEQ ID No：195和SEQ ID No：196；rs4693311的荧光探针对序列 为SEQ ID No：199和SEQ ID No：200；rs4766994的荧光探针对序列为SEQ ID No：203 和SEQ ID No：204；rs4894545的荧光探针对序列为SEQ ID No：207和SEQ ID No：208； rs4940849的荧光探针对序列为SEQ ID No：211和SEQ ID No：212；rs6490294的荧光探 针对序列为SEQ ID No：215和SEQ ID No：216；rs6780858的荧光探针对序列为SEQ ID No：219和SEQ ID No：220；rs9439527的荧光探针对序列为SEQ ID No：223和SEQ ID No：224；rs9556016的荧光探针对序列为SEQ ID No：227和SEQ ID No：228；rs12002185 的荧光探针对序列为SEQ ID No：231和SEQ ID No：232；rs12793370的荧光探针对序列 为SEQ ID No：235和SEQ ID No：236；rs1549058的荧光探针对序列为SEQ ID No：239 和SEQ ID No：240；rs2736100的荧光探针对序列为SEQ ID No：243和SEQ ID No：244； rs6043705的荧光探针对序列为SEQ ID No：247和SEQ ID No：248；rs11699642的荧光 探针对序列为SEQ ID No：251和SEQ ID No：252)，还可以有相应PCR技术所需的常 用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，荧光探针，Taq酶等，这些常用试剂都是本 领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白 对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和 特异的引物及荧光探针对检测SNP，再通过SNP谱辅助判断原发性肺癌，不仅稳定， 检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践， 可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。