技术领域
本发明涉及一种冠心病遗传风险因子检测方法，特别涉及一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针、试剂盒及其应用，属于分子生物学和医学领域。
背景技术
冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。大量的流行病学调查研究表明血浆同型半胱氨酸水平升高与动脉粥样硬化性血管疾病危险增加有关，且血浆同型半胱氨酸与动脉粥样硬化性血管疾病之间存在着一种强烈的剂量依赖关系，这种关系不依赖于传统的致动脉粥样硬化性血管疾病的危险因子。造成高半胱氨酸的原因基本上分为遗传性代谢和获得性代谢障碍两大类。其中遗传性代谢可归因于血浆同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶的基因突变，这会导致酶活性下降，使甲硫氨酸代谢障碍，导致血浆同型半胱氨酸在体内蓄积。
目前研究中，MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。而同型半胱氨酸、叶酸代谢与许多疾病(Down综合症-先天愚型、神经管疾病、心血管疾病等)相关。MTHFR为5，10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)，亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入 甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平，高浓度的同型半胱氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的心脑血管致病因素。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。现已发现MTHFR基因有多种突变类型，不同的基因突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响，表现出各种不同的酶活性和热稳定性。一般说来，涉及进化上保守序列的突变会引起酶活性的急剧下降，危害性比较大；相反，处于非保守序列的突变对酶的活性影响较小，危害性也较小。rs1801133为MTHFR基因中的一个SNP位点MTHFR C677T，是一个常见的不耐热错义突变。MTHFR基因第677位密码子C被T置换，从而使一个高度保守的丙氨酸变成了缬氨酸，同时产生了一个HInfI和TaqI限制性酶切位点。C677T位于MTHFR催化区域，该突变直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐热性降低。
为实现对冠心病遗传风险因子的检测，研究人员发展出了多种方法，其中较为常见的一种方式是构建对应于这些风险因子的试剂盒，但是现有的此类试剂盒在应用时往往存在准确性较差等问题，且通量较低，难以进行实际应用。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针、试剂盒及其应用，以克服现有技术中不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针，其中：所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
进一步的，所述第一引物对和第二引物对中各引物的末端还连接有荧光标记物，所述荧光标记物包括FAM或VIC。
本发明实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂中的用途。
本发明实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒中的用途。
本发明实施例还提供了一种用于检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂，其包含所述的引物和探针。
本发明实施例还提供了一种用于MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒，其包含所述的引物和探针。
进一步的，所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。
本发明实施例还提供了所述的引物和探针、所述的试剂、或者所述的试剂盒于制备冠心病遗传风险因子检测试剂或试剂盒中的用途。
与现有技术相比较，本发明通过设计特异性的引物对和探针对，能实现对MTHFR基因中rs1801131、rs1801133位点进行快速、准确地检测，操作简单、成本低，结果精确，可以实现高通量检测，具有广泛应用前景。
具体实施方式
下面结合一些典型实施例进一步阐述本发明的技术方案。
需要说明的是，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照Sambrook等人、分子克隆、实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
在本发明的如下实施例主要提供了一种检测冠心病遗传风险因子的引物对、试剂、试剂盒等。更具体的说，如下实施例提供了一种检测MTHFR酶活性或者叶酸代谢能力的引物和探针、试剂、试剂盒，其涉及的基因位点主要为MTHFR基因中的rs1801131位点及rs1801133位点。
其中，该MTHFR基因单核苷酸多态性位点rs1801131位点、rs1801133位点均与冠心病密切相关。而MTHFR基因的详细序列可参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/。
进一步的，本发明实施例提供的一种检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的引物和探针中，所述引物包括第一引物对和第二引物对，所述探针包括第一探针对和第二探针对，其中所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述第一探针对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第二探针对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列
其中，所述第一引物对对应于rs1801131位点，其包含的两条引物可分别命名为rs1801131-fp(SEQ ID NO.1)和rs1801131-rp(SEQ ID NO.2)。
其中，所述第二引物对对应于rs1801133位点，其包含的两条引物可分别命名为rs1801133-fp(SEQ ID NO.3)和rs1801133-rp(SEQ ID NO.4)。
其中，所述第一探针对对应于rs1801131位点，其包含的两条探针可分别命名为rs1801131-FAM(SEQ ID NO.5)和rs1801131-VIC(SEQ ID NO.6)。
其中，所述第二探针对对应于rs1801133位点，其包含的两条探针可分别命名为rs1801133-FAM(SEQ ID NO.7)和rs1801133-VIC(SEQ ID NO.8)。
其中，FAM(羧基荧光素)、VIC为连接于各探针尾端的荧光基团。
本发明实施例还提供了所述的引物和探针在制备检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂或试剂盒中的用途。
相应的，本发明实施例还提供了一种用于检测MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂，其包含所述的引物和探针。
相应的，本发明实施例还提供了一种用于MTHFR酶活性或叶酸代谢能力的试剂盒，其包含所述的引物和探针。
进一步的，所述试剂盒还包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。
本发明实施例还提供了所述的引物和探针、所述的试剂、或者所述的试剂盒于制备冠心病遗传风险因子检测试剂或试剂盒中的用途。
本发明实施例还提供了基于前述引物和探针、试剂或试剂盒的检测冠心病易感位点的方法，其可以包括如下步骤：
(1)提取样品的基因组DNA；
(2)以待测牛的基因组DNA为模板，用上述引物对和探针对进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)的扩增产物进行基因型判定：如果探针所标记荧光染料(FAM，其激发波长465nm，发射波长510nm)的荧光强度增长，而探针所标记荧光染料(VIC，其激发波长533nm，发射波长580nm)的荧光强度无增长，表示被测样本基因型存在突变；反之，如果探针所标记荧光染料(VIC)的荧光强度增长，而探针所标记荧光染料(FAM)的荧光强度无增长，表示被测样本基因型无突变；如果两种荧光强度均增长，则被测样本基因型存在突变。
(4)最后可以通过专门的分析软件，进行等位基因分型。
为了便于检测结果分析，可在PCR扩增步骤中增加已知基因型的阳性对照和阴性对照。
较之现有技术，本发明所设计的引物和探针具有良好的特异性，能够灵敏地检测MTHFR基因rs1801131位点、rs1801133位点突变，检测过程只经一个反应步骤，即可得出判型结果，无需PCR后反应，步骤简单、耗时短，污染少，且所用的反应体系和反应条件稳定，检测结果可靠。而且，本发明工作流程简单，只需混合DNA模板、引物和探针试剂即可进行仪器检测，易于掌握，且灵敏性高，对DNA的浓度要求低(可低至1ng)，适于对体液样本进行高通量的快速检测。
实施例：
一、荧光PCR检测
1、实验材料
LightCycler480荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏(Roche)公司，聚合酶链反应液(LightCycler480High Resolution Melting Master)由瑞士罗氏(Roche)公司定制合成。
2、引物及探针设计与合成：
以MTHFR基因外显子的部分序列为模板，使用Primer Premier5软件分析引物、探针，并由上海生工生物工程有限公司定制合成。
检测用引物：
MTHFR基因rs1801131上游引物序列rs1801131-fp：
5′-AGAGCAAGTCCCCCAAGGA-3′(SEQ ID NO.1)；
MTHFR基因rs1801131下游引物序列rs1801131-rp：
5′-GAGGTAAAGAACGAAGACTTCAAAGAC-3′(SEQ ID NO.2)。
MTHFR基因rs1801133上游引物序列rs1801133-fp：
5′-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3′(SEQ ID NO.3)；
MTHFR基因rs1801133下游引物序列rs1801133-rp：
5′-CGGTGCATGCCTTCACAA-3′(SEQ ID NO.4)。
检测用探针：
MTHFR基因rs1801131探针rs1801131-FAM：
5′-ACCAGTGAAGAAAG-3′(SEQ ID NO.5)；
MTHFR基因rs1801131探针rs1801131-VIC：
5′-ACCAGTGAAGCAAG-3′(SEQ ID NO.6)；
MTHFR基因rs1801133探针rs1801133-FAM：
5′-CTGCGGGAGTCGA-3′(SFQ ID NO.7)；
MTHFR基因rs1801133探针rs1801133-VIC：
5′-CTGCGGGAGCCGA-3′(SEQ ID NO.8)。
3、样本检测：实验共检测50例冠心病病例和50例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(Themo Fisher公司)检测。
按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用roche LC480software1.5扫描并聚类分析：
5μL 2X Light Cycler480High Resolution Melting Master Mix
1.2μL25mM MgCl2溶液
1μL 2μM Primer Mix
1μL 5ng/μL左右DNA
1.8μLH2O
反应总体积10μL，其可在384孔板中进行。
4、基因组DNA抽提的检测结果：所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280＞1.8，浓度＞10ng/μL)。
二、Taqman法检测冠心病rs1801131、rs1801133位点的基因型
用Taqman法检测冠心病遗传风险基因MTHFR基因的rs1801131、rs1801133位点。挑选上述冠心病病例-对照组样本各10例进行Taqman分型实验，判断rs1801131、rs1801133的基因型。
1、实验方法
Taqman探针方法使用美国应用生物系统公司的Taqman探针，苏州新海生物科技有限公司的Taqman Mix。
按如下体系进行PCR扩增，最后用roche LC480software1.5扫描并聚类分析：
5μLTaqman Mix
0.1μL Taqman Probe
1μL 2μM Primer Mix
1μL5ng/μL左右DNA
3.9μLH2O
反应总体积10μL，其可在384孔板中进行。
2、实验结果：20例Taqman分型结果与LightCycler480荧光PCR的HRM分析结果完全一致。
3、MTHFR基因rs1801131、rs1801133基因型和冠心病易感的关联分析
MTHFR基因rs1801131、rs1801133在冠心病病人和对照中分布的比较采用RxCx2检验。用SPSS软件进行统计分析，检测结果证实，rs1801131、rs1801133基因型和冠心病易感存在显著关联。
三、该实施例还提供了一类冠心病易感位点的检测试剂盒，其可以对MTHFR基因外显子中包含rs1801131、rs1801133位点的区域进行扩增及分析，该检测试剂盒可以检测冠心病的易感性，其包含有可扩增出MTHFR基因外显子中包含rs1801131、rs1801133位点的特异性引物及探针和其他PCR反应所需辅助试剂。
检测试剂盒供50人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分及含量包括：
5μL2X Light Cycler 480High Resolution Melting Master Mix
1.2μL25mM MgCl2溶液
1μL2μM Primer Mix
1μL5ng/μl左右DNA
1.8μL H2O
具有SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示序列的特异性引物各0.2uM；
具有SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8所示序列的探针各0.2uM。
籍由该试剂盒，利用前述的方法检测不同人群的MTHFR基因中rs1801131、rs1801133位点的基因型，以此判断不同个体患冠心病的发病风险，并将检测结果与其它方法(例如PCR-单链构象多态性(single-strand conformationalpolymorphism，SSCP)法)的检测结果对照，证实该试剂盒可用于精确(检测限可达1ng)、快速的检测。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。