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分离类似的有机化合物的方法
    【技术领域】

    本发明涉及分离类似的化合物的方法，更尤其是通过使用经银离子预处理过的含磺酸基团的强阳离子交换树脂将具有烷基作为侧链的含内酯的高分子量化合物与具有链烯基作为侧链的含内酯的高分子量化合物分离的方法。背景技术

    通常已知使用银离子来分离有相同碳原子数的不饱和脂肪酸的顺反异构体(J.Chromatography，149(1978)417-)。但是，尚未发现如何将在一部分分子结构上稍有不同的化合物有效地分离的方法，例如具有烷基作为侧链的化合物与具有链烯基作为侧链的化合物的分离。这是因为这类化合物具有相同或几乎相同地碳原子数和彼此类似的物理性质，诸如在溶剂中的溶解性和对溶剂的亲和力。发明概述

    本发明的发明人对有效地分离物理性质彼此类似的化合物而不改变化合物其本身的方法已经进行了广泛的研究。他们出乎意料地发现了通过使用经银离子预处理过的含有磺酸基团的强阳离子交换树脂来分离物理性质彼此类似的化合物的方法，即，具有烷基作为侧链的含内酯的高分子量化合物与具有链烯基作为侧链的含内酯的高分子量化合物的分离，含内酯的高分子量化合物具有共同的基础化学结构。

    作为含磺酸基团的强阳离子交换树脂的适合实例，可述及的是合成的基质(base)或硅胶基质，诸如凝胶型树脂和可与极性溶剂一起使用但不可和非极性溶剂一起使用的多孔树脂；以及极性和非极性溶剂均可与之一起使用的高度多孔树脂。这些树脂可根据使用的洗脱剂的极性选择。

    含有磺酸基团的强阳离子交换树脂可以是在末端具有苯磺酸基团的含苯磺酸基团的强阳离子交换树脂。例如，树脂可以是苯乙烯单体和二乙烯基苯(DVB)的共聚物基质或硅胶基质。

    作为含有苯磺酸基团的强阳离子交换树脂，即，苯乙烯单体和DVB的磺化共聚物的例子，可述及的是Diaion(SK系列，RCP系列，HPK系列，PK系列如PK206)(商标，由日本的Mitsubishi化学公司生产)、Amberlite(IR120B，IR200)和Duolite(C20，C26)(商标，由Rohm&Haas公司生产)、Dowex(50W-X8，MSC-1)(商标，由陶氏化学公司生产)、Ionac(C-240)(商标，由Sybron化学公司生产)和Lewatit(S-100，SP系列)(商标，由拜耳公司生产)。

    作为具有硅胶作为基质的含苯磺酸基团的强阳离子交换树脂的例子可述及的是以含苯磺酸基团的硅氧烷聚合物涂覆的强阳离子交换树脂，诸如Capcell Pak(SCX系列)(商标，由日本的Shiseido有限公司生产)，其基质被硅氧烷聚合物的薄膜所涂覆，然后在其末端引入磺酸基团。

    在这些含有苯磺酸基团的强阳离子交换树脂中，特别优选Diaion(RCP系列和PK系列)和Capcell Pak(SCX系列)。

    可用于预处理含有磺酸基团的强阳离子交换树脂的银离子可优选由可在水中产生银离子的各种银盐提供，诸如硝酸银、高氯酸银等。

    含有磺酸基团的强阳离子交换树脂可用银离子预处理，方法是，如果树脂是H型的，就使银盐的水溶液通过之，或者如果是Na型的，就将其转化为H型，用水洗涤，调节到pH值3-4，并使银盐的水溶液通过之。这种使用银离子的预处理优选通过将银盐装料成1mol/L-R或更高来进行。

    本发明的提纯方法可通过下列步骤进行。

    (i)混合物，即，待分离的含有“具有烷基作为侧链的含内酯的高分子量化合物”和“具有链烯基作为侧链的含内酯的高分子量化合物”的原料，可将其溶解于适合的溶剂中，诸如丙酮等，并且加料到填充了用银离子预处理过的含有磺酸基团的强阳离子交换树脂的柱色谱中。

    (ii)并且，可用适当的洗脱剂如丙酮、乙酸乙酯与甲醇的混合物等进行洗脱。

    使用经银离子预处理过的含磺酸基团的强阳离子交换树脂的分离方法可通过固定床体系或连续床体系进行。从操作方法而言，固定床体系包括单床体系、多床体系、双床体系、混合床体系、离子交换过滤体系、循环体系等。从再生方法而言，固定床体系包括下流式再生体系、上流式再生体系、逆流上流式(countercurrent ascendingflow)再生体系、逆流再生体系、无塔(ex-column)再生体系等。另外，连续床体系包括流化床体系(逆流接触体系、多级间歇式体系)、移动床体系(上行型(单塔型、多塔型)、下行型(单塔型、多塔型)、模拟移动床体系、环形带体系(液-液萃取体系))等，其中模拟移动床体系有效并适合大量生产。

    于本发明的分离方法适用的含内酯的高分子量化合物是指在分子内具有至少一个内酯环并且分子量约400或更高的化合物。它们可以是单环的、双环的、三环的等。更优选它们由12或更多原子构成。这类单环化合物包括红霉素、柱晶白霉素、酒霉素等。这类三环化合物包括具有内酯环的化合物，诸如EP0184162中所述的三环化合物；EP0427680、EP0532088或WO93/04680中所述的含有杂原子的三环化合物。最优选的是1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环[22.3.1.04.9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。被作为侧链的烷基或链烯基取代的最优选的位置是其17位，并且当17位被烯丙基取代时为他克莫司，而在被乙基取代时为子囊霉素。此外，适合的例子还有rapamysin等。

    作为含内酯的高分子量化合物的烷基侧链，可述及的是碳原子数为1-6的直链或支链烷基，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等，其中优选碳原子数为1-4的烷基，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基。

    作为与上述化合物具有共同基础化学结构的含内酯的高分子量化合物的链烯基侧链，可述及的是碳原子数为2-6的直链或支链链烯基，诸如乙烯基、丙烯基(烯丙基或1-丙烯基)、丁烯基、异丁烯基、戊烯基、己烯基等，其中优选乙烯基和丙烯基。待分离的物质的制备

    将含有1％玉米淀粉、1％甘油、0.5％葡萄糖、1％的棉籽粉、0.5％干酵母、0.5％玉米浆和0.2％碳酸钙的培养基(100mL)调节到pH值6.5，倾入八个500mL锥形瓶中，并在120℃灭菌30分钟。将一铂环量的Streptomyces tsukubaensis No.9993(根据布达佩斯条约，在the National Institute of Bioscience and HumanTechnology，Agency of Industrial Science and Technology，Japan的保藏编号为No.FERM BP-927)的斜面培养物接种到每个瓶中的培养基上，并且在旋转式摇床上在30℃培养72小时。该培养物作为种母转移到160L相同的培养基中，该培养基装在预先经120℃灭菌30分钟的200L小型发酵罐中，并且已经向其添加了0.05％Adekanol(消泡剂，商标，由日本的Asahi Denka公司制造)和0.05％硅氧烷(由日本Shinetsu化学公司制造)。将其以200rpm搅拌在160升/分钟的通风下在30℃预培养48小时。将30L这种预培养物接种到在4吨罐中的、在120℃预先灭菌30分钟、pH值6.8的3000L生产培养基中，其含有3％可溶性淀粉、0.8％小麦胚、0.4％干酵母、0.6％玉米浆、0.1％碳酸钙、0.05％ Adekanol和0.05％硅氧烷，并且以140rpm搅拌在1500升/分钟的通风下在25℃发酵168小时。

    将这样得到的培养液用50kg硅藻土过滤。菌丝饼用1000L丙酮萃取得到1000L萃取液。从菌丝饼得到的丙酮萃取液和滤液(2700L)合并，并通过非离子型吸附树脂“Diaion HP-20”(商标，由日本的Mitsubishi化学公司制造)柱(200L)。用600L 50％含水丙酮洗涤后，用75％含水丙酮进行洗脱。在洗脱液中的溶剂通过减压蒸发除去，得到40L含水残留物。残留物用40L乙酸乙酯萃取两次。减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得到油状残留物。将油状残留物溶解在正己烷和乙酸乙酯(1∶1，v/v，3L)的混合物中，并进行柱色谱处理，色谱使用以相同的溶剂填充的70L硅胶(Merck & Co.，Ltd.制造，70-230目)。

    用正己烷和乙酸乙酯(1∶1，v/v，420L和1∶2，v/v，420L)的混合物、210L乙酸乙酯和随后用210L丙酮相继进行洗脱。收集洗脱体积为从350L至420L(第一洗脱液)、从490L至840L(第二洗脱液)和从980L至1190L(第三洗脱液)的各个部分。第二洗脱液在减压下浓缩，并加入丙酮以置换溶剂(50mg/mL)。这样得到有待用柱色谱分离的原料。附图简述

    图1表示通过使用经银离子预处理过的DiaionRCP160M的柱色谱进行分离而得到的图；和

    图2表示通过使用经银离子预处理过的Capcell PakSCX的柱色谱进行分离而得到的图。发明的最佳实施方式

    下面的实施例仅用于更详细地说明本发明。实施例1通过使用DiaionRCP160M(商标，由日本的Mitsubishi化学公司制造)的柱色谱进行分离(1)用银盐处理DiaionRCP160M离子交换树脂

    将1M硝酸银水溶液(3柱体积)通过DiaionRCP160M(H+型)，然后用水(4柱体积)洗涤以除去过量的硝酸银。离子交换树脂用甲醇(4柱体积)平衡，然后用乙酸乙酯和甲醇(1∶1)的混合物平衡。(2)使用单柱的分离试验

    将如上所述得到的有待用柱色谱分离的原料进行柱色谱处理，色谱使用经硝酸银水溶液处理过的DiaionRCP160M。使用20mm×500mH(425μm)(150mL)的柱并以乙酸乙酯和甲醇(1∶1)的混合物作为洗脱液，在换算成他克莫司为10g/L-R的负荷下、以流速sv＝1和在30℃的温度下进行分离。得到的分离流谱如图1所示。

    分离并鉴定出他克莫司、子囊霉素和17-丙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧杂-4-氮杂三环-[22.3.1.04.9]二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮(下文称为化合物A)。实施例2通过使用Capcell PakSCX UG80(商标，由日本的Shiseido有限公司制造)的柱色谱进行分离(1)使用单柱的分离试验

    将按与实施例1相同的方式得到的有待用柱色谱分离的原料进行柱色谱处理，柱色谱使用经银离子交换过的Capcell PakSCXUG80。使用20mm×250mH(20μm)(78mL)的柱并以丙酮作为洗脱液，在换算成他克莫司为5g/L-R的负荷下、以流速sv＝1.5和在30℃的温度下进行分离和提纯。得到的分离流谱如图2所示。(2)用小型模拟移动床装置进行连续分离

    将如上所述得到的有待用柱色谱分离的原料用小型模拟移动床装置(日本的Organo公司制造，小型的新型JO体系色谱分离器，TREZONE)进行分离，该装置配备了经硝酸银水溶液处理过的Capcell PakSCX UG80。在下述条件下进行分离和提纯：洗脱液-丙酮；装料浓度-25g/L；装料方法-24g/循环×4个循环；柱-(20μm)2.26L(280mL×8)；总负荷-42g/L-R(每批负荷)；有效部分(active fraction)中液体的量-1.5L/循环(相对于0.65柱体积)；和温度-20℃。有效部分中每种物质的纯度按如实施例1(3)所述相同的方式由HPLC分析确定。结果如表2所示。表2  原料中的纯度    (％)洗脱部分中的纯度    (％)    他克莫司    85.4    92.7    子囊霉素    5.45    0.11    化合物A    1.30    n.d.n.d.＝未检测到工业适用性

    通过将经银离子预处理过的含磺酸基团的强阳离子交换树脂用于分离具有烷基作为侧链的含内酯的高分子量化合物与具有链烯基作为侧链的含内酯的高分子量化合物，在分离中得到了意想不到的效果。

    本发明的分离方法因其重复性、大规模适用性和/或其经济效益而非常有用。因此，本发明可用于化学工业，特别是制药工业，其中目标化合物的大量生产和纯度很关键。