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1、(10)授权公告号 CN 102226213 B (45)授权公告日 2013.01.02 CN 102226213 B *CN102226213B* (21)申请号 201110100746.6 (22)申请日 2011.04.21 C12P 33/00(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 陈启和 刘婧 傅明亮 刘晓杰 何国庆 董亚晨 冯宇 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 一种漆酶催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了一。
2、种漆酶催化白桦脂醇合成白 桦脂酸的方法， 将白桦脂醇溶液、 漆酶和介体加 入 pH 2.0 5.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液中， 混合均匀得到反应液， 于 25 30， 转速 60 180rpm 摇床上反应 8 28h 后经分离纯化得到 白桦脂酸 ； 其中， 白桦脂醇溶液加入量以每升反 应液计为 1 20mL， 漆酶加入量以每升反应液 计为 7.667U 23U， 所述的介体选自 2， 2 - 联 氮-二(3-乙基苯并噻唑-6- 磺酸 ) 二铵盐， 紫脲 酸， 2-乙酰胺基苯酚和1-羟基苯并三唑中的一种 或多种， 每升反应液中介体的加入量为 0.015 0.067mmol。采用本方法。
3、催化白桦脂醇合成白桦 脂酸， 具有合成效率高、 操作简单、 便于控制、 周期 短、 安全可靠等特点。 (51)Int.Cl. 审查员 孙薇 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 一种漆酶催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法， 包括 ： 将白桦脂醇溶液与漆酶加入缓冲溶液中， 混合均匀得到反应液， 于 25 30条件下反 应 8 28h 后经分离纯化得到白桦脂酸 ； 其中， 所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇浓度达 7 9mg/mL 的二甲基亚砜溶液 ； 以每升 反应液计， 白桦脂醇溶液的加入量为 。
4、1 20mL ； 所述的漆酶的加入量以每升反应液计为 7.667U 23U ； 所述的缓冲溶液为 pH2.0 5.0 的 Na2HPO4柠檬酸缓冲液 ； 所述的反应液置于摇床中反应， 摇床转速为 60 180rpm。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的漆酶的加入量以每升反应液计为 15.33U。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 将白桦脂醇溶液、 漆酶和介体加入缓冲溶 液中， 混合均匀得到反应液， 于2530条件下反应828h后经分离纯化得到白桦脂酸 ； 其中， 所述的介体为 2,2 - 联氮 - 二 （3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸） 二铵盐，。
5、 紫脲酸， 2- 乙 酰氨基苯酚和 1- 羟基苯并三唑中的一种或多种。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的介体的加入量以每升反应液计为 0.015 0.067mmol。 5. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的介体为紫脲酸。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述的分离纯化包括 ： 将反应后的反应液 进行离心处理， 取上清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经浓缩得到白桦脂酸。 权 利 要 求 书 CN 102226213 B 2 1/6 页 3 一种漆酶催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及酶制剂和天然产物修饰领域。
6、， 尤其涉及一种漆酶催化白桦脂醇合成白 桦脂酸的方法。 背景技术 0002 漆酶 (Laccase， EC1.10.3.2)， 是一类可降解木质素的含铜多酚氧化酶， 具有特征 性吸收光谱， 早在 1883 年， 由日本学者 Yoshida 首先在漆树中发现。研究表明， 漆酶的催化 氧化反应需要氧气作为中间物， 漆酶在有氧条件下催化氧化底物， 同时分子氧被还原为水。 漆酶是一种作用底物广泛的酶， 可催化多种具有芳香环化合物的生物转化， 据初步统计， 可 被漆酶催化氧化的底物类型已达 250 个， 而且还有增加的趋势。根据底物的结构， 可将底 物归纳为六类 ： (1) 酚及其衍生物 ： 约占漆酶底。
7、物总数一半， 主要是邻、 对苯二酚等多元酚 及其衍生物 ； (2) 芳胺及其衍生物 ： 其结构特点与酚类底物相似， 主要是多氨基苯及其衍生 物 ； (3) 羧酸及其衍生物 ： 一般指在芳香酸底物中， 芳环羧基的邻、 对位连有羟基、 烷氧基或 氨基 ； 在非芳香羧酸中， 碳链上连有酚或芳胺类基团。如对香豆酸、 咖啡酸等 ； (4) 甾体激 素和生物色素 ： 在有机溶剂和磷酸盐缓冲液中， 真菌漆酶可催化氧化雌甾二醇、 雌激素三醇 等 ； (5) 金属有机化合物 ： 如二茂铁 (Fc-H) 及其衍生物 FcR(R CH2OH， COO-， CH2Fc 等 ) ； (6) 其他非酚底物 ： 除了早期发。
8、现的亚铁氰化钾、 抗坏血酸等外， 近年来还发现了 1- 苯 基 -2-(3， 4- 二甲氧基苯基 ) 己二醇和吲哚的衍生物等。 0003 由于漆酶的氧化还原电势较低， 在催化过程中仅能直接氧化降解一些低氧化还原 电势的底物， 因此常在漆酶反应体系中加入一些介体， 这些介体是一些低氧化还原电势的 化合物， 在漆酶催化氧化过程中作为电子传递的载体。介体在酶的作用下会形成活性高且 有一定稳定性的中间体， 这些中间体能从氧分子中获得电子传递给底物， 从而达到氧化底 物的目的。 0004 白桦脂醇 (betulin， lup-20(29)-ene-3， 28-diol) 和白桦脂酸 (betulinic。
9、acid， 3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid) 属羽扇烷型三萜类化合物， 在天然界中广泛存在， 尤其是白桦树 (Betula spp.) 中。近年科学研究发现， 白桦脂醇和白 桦脂酸表现出极高的药理活性， 特别是在抗 HIV 和癌症治疗等方面表现出巨大的潜能， 并 显示出与以往药物不同的作用机制。因此， 对白桦脂醇和白桦脂酸及其衍生物的研究已成 为近年来天然有机药物研究的热点。尤其是白桦脂酸， 具有宽范围的生物学以及药理学活 性， 具有抗疟性、 抗炎性和抗肿瘤活性， 在抗艾滋病活性及抗各种肿瘤细胞系细胞毒性方面 可与一些临床用药相比， 已被视为最有潜力的新。
10、型药物制剂。在我国， 白桦树分布范围广， 植物资源丰富， 但研究开发甚少。 0005 白桦脂酸在实际生产中的来源主要有两类 ： 一类是从天然植物中提取 ； 另一类是 化学合成。白桦脂酸广泛分布于多种植物中， 如五加科 ( 刺五加 )、 桦木科 ( 白桦外皮 )、 鼠 李科(酸枣仁)、 柿科(白黑柿叶)等。 因此， 早期的白桦脂酸提取大多采用直接提取法。 然 而， 白桦脂酸在植物中的含量极低， 据文献报道白桦树皮中白桦脂酸的含量仅为 0.025。 说 明 书 CN 102226213 B 3 2/6 页 4 直接提取法原料消耗量大， 成本高， 所得到的白桦脂酸杂质含量比较高， 且不易除去， 无法。
11、 满足商业需要。 目前， 以白桦脂醇为前体， 经过化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产 实践中， 虽然合成效果较好， 但存在操作复杂、 污染大、 合成成本高、 安全性低等问题， 限制 了其在实际中的应用。 0006 近年来利用生物转化法合成白桦脂酸逐渐引起重视， 发明专利 CN200810163820.7 中公开了一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法， 相比化学合成法具有操 作简便、 易于控制、 成本低廉、 安全可靠等特点， 但该方法利用微生物全细胞通过直接生长 法或静息细胞法或微乳液体系法对白桦脂醇底物进行催化转化， 操作过程中需要预培养菌 体或制备静息细胞等， 步骤较繁琐， 。
12、且转化周期较长。 发明内容 0007 本发明提供了一种漆酶催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法， 利用漆酶将白桦脂醇 底物生物转化成白桦脂酸， 该方法操作简便， 转化周期短， 转化效率高。 0008 一种漆酶催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法， 包括 ： 0009 将白桦脂醇溶液与漆酶加入缓冲溶液中， 混合均匀得到反应液， 于 25 30条件 下反应 8 28h 后经分离纯化得到白桦脂酸。 0010 所述的白桦脂醇可以为市售商品或自制产品， 纯度为 90。公开号 CN101328201A 中国专利公开了纯度 90左右的白桦脂醇提取物的制备方法， 采用此方法自制白桦脂醇作 为本发明的底物更具现实意义， 可。
13、以降低生产成本和综合利用资源。 0011 所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇的二甲基亚砜溶液， 即该溶液的溶剂为二甲基亚 砜。 二甲基亚砜是重要的极性非质子溶剂， 它可与许多有机溶剂及水互溶， 对某些反应具有 加速、 催化、 提高收率、 改革产品性能等作用， 本发明采用二甲基亚砜作为白桦脂醇底物的 溶剂， 更有利于底物与酶的接触。 0012 所述的白桦脂醇溶液中白桦脂醇浓度为 7 9mg/mL， 优选 8mg/mL ； 白桦脂醇溶液 的加入量以每升反应液计为 1 20mL， 优选 10mL。选择该添加浓度既能保证漆酶对底物 的充分催化， 又能有效减少二甲基亚砜和白桦脂醇对水相反应液中漆酶催化活性的负。
14、面影 响。 0013 所述的漆酶为市售商品， 来源于白腐真菌属变色栓菌 (Trametesversicolor)。酶 活的定义 ： 25条件下， pH 3.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液中， 每分钟使 1mol 2， 2 - 联 氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)氧化所需要的酶量为一个酶活单位。 本 发明中漆酶的加入量以每升反应液计为 7.667U 23U， 优选 15.33U。 0014 所述的缓冲溶液为 pH 2.0 5.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液， 优选 pH3.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液。反应体系 pH 值对漆酶酶活有较显著影响， 本。
15、发明在所选缓冲液条 件下， 漆酶催化活性最高。所述的 pH 2.0 5.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液采用本领域常规 的配制方法进行配制即可。 0015 介体是一些低氧化还原电势的化合物， 可在漆酶催化氧化过程中作为电子传递的 载体。 理想的介体必须是漆酶的良好底物， 它的氧化态和还原态必须是稳定的， 而且又不影 响漆酶的反应 ； 另外， 介体氧化还原的转化必须是循环的。常用的介体是一些酚型化合物 和杂环， 如卟啉类化合物等。 这些介体物质有的来源于真菌次生代谢产物或木素降解产物， 说 明 书 CN 102226213 B 4 3/6 页 5 如紫丁香醛、 乙酰香草酮和乙酰丁香酮等 ；。
16、 有的来自于人工合成化合物， 如 2， 2 - 联氮 - 二 (3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐、 1- 羟基苯并三唑、 紫尿酸、 N- 羟基 -N- 乙酰基苯胺、 N- 羟基丁酰苯胺等。本发明中， 在反应液中添加介体， 所述的介体选自 2， 2 - 联氮 - 二 (3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐 (ABTS)， 紫脲酸， 2- 乙酰胺基苯酚和 1- 羟基苯并三唑 中的一种或多种， 可直接采用市售产品， 如 Sigma 公司生产的相关产品。每升反应液中介体 的加入量为 0.015 0.067mmol。 0016 所述的介体优选紫脲酸， 紫脲酸的加入量以每升反应液计优选。
17、 0.067mmol， 此条件 下最有利于漆酶催化白桦脂醇合成白桦脂酸。 0017 所述的反应温度优选为 28 ； 所述的反应时间优选为 8h。 0018 所述的反应液置于旋转式摇床中反应， 摇床转速为 60 180rpm， 优选 120rpm， 便 于反应过程中底物， 漆酶和介体三者的充分混合。 0019 所述的分离纯化过程包括 ： 将反应后的反应液进行离心处理， 取上清液， 用乙酸乙 酯萃取， 萃取液经浓缩得到白桦脂酸。采用萃取的方法对产物进行分离纯化， 操作简单方 便， 并且能从反应液中有效分离出所合成的白桦脂酸产物， 便于后续定量分析。 0020 本发明方法中白桦脂醇和白桦脂酸的检测方。
18、法参照发明专利 CN200810163820.7 中公开的相关部分。白桦脂酸得率 ( ) 生成的白桦脂酸质量 (mg)/ 加入的白桦脂醇质 量 (mg)100。 0021 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 本发明方法利用漆酶催化白桦脂醇 合成白桦脂酸， 具有合成效率高、 操作简单、 便于控制、 周期短、 安全可靠等优点， 为工业化 生产白桦脂酸提供了理论依据和技术前提， 同时也为五环三萜类天然活性物质的结构修饰 提供了一条新思路。 具体实施方式 0022 实施例 1-4 不同介体条件下白桦脂酸得率比较 0023 向 30mL， pH 为 3.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液中。
19、依次加入 300L 白桦脂醇的二甲 基亚砜溶液 ( 浓度为 8mg/mL， 白桦脂醇纯度为 90 )， 50L 漆酶溶液 (Sigma 公司生产， 来 源于白腐真菌属变色栓菌 (Trametesversicolor)， 下同， 浓度为 4.6U/mL) 和 200L 不同 种类的介体溶液 ( 浓度为 5mmol/L)， 其中所用介体分别为 2， 2 - 联氮 - 二 (3- 乙基苯并 噻唑 -6- 磺酸 ) 二铵盐 (ABTS)， 紫脲酸， 2- 乙酰胺基苯酚或 1- 羟基苯并三唑， 混合均匀得 到反应液。反应液于 28， 转速 120rpm 旋转式摇床上反应 8h， 反应后的反应液经 300。
20、0rpm 冷冻离心 30 分钟， 取上清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂酸。采用 RP-HPLC 法对所得样品中白桦脂醇和白桦脂酸的含量进行定量同步检测， 结果见表 1。 0024 表 1 不同介体条件下白桦脂酸得率比较 0025 序号 介体 白桦脂酸得率 ( ) 实施例 1 ABTS 7.29 实施例 2 紫脲酸 7.35 说 明 书 CN 102226213 B 5 4/6 页 6 实施例 3 2- 乙酰胺基苯酚 7.02 实施例 4 1- 羟基苯并三唑 6.63 0026 从表 1 中可以看出， 添加不同种类的介体获得的产物得率不同。选用紫脲酸为介 体时， 产物白桦。
21、脂酸的得率最高 ； 选用 1- 羟基苯并三唑为介体时， 得率则较低。 0027 实施例 5-7 不同漆酶加入量下白桦脂酸得率比较 0028 向30mL， pH为3.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中依次加入300L白桦脂醇的二甲基 亚砜溶液 ( 浓度为 8mg/mL， 白桦脂醇纯度为 90 )， 漆酶溶液 ( 浓度为 4.6U/mL) 和 200L 介体紫脲酸溶液(浓度为5mmol/L)， 其中漆酶溶液加入量分别为50L， 100L， 150L， 混 合均匀得到反应液。反应液于 28， 转速 120rpm 旋转式摇床上反应 8h， 反应后的反应液经 3000rpm 冷冻离心 30 分钟， 取上。
22、清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂 酸。采用 RP-HPLC 法对所得样品中白桦脂醇和白桦脂酸的含量进行定量同步检测， 结果见 表 2。 0029 表 2 不同漆酶加入量下白桦脂酸得率比较 0030 序号 漆酶加入量 (U) 白桦脂酸得率 ( ) 实施例 5 0.23 7.35 实施例 6 0.46 12.84 实施例 7 0.69 7.94 0031 从表 2 中可以看出， 漆酶加入量对白桦脂酸得率有一定影响， 当 30mL 反应液中加 入漆酶量为 0.46U 时， 白桦脂酸得率达到最大。 0032 实施例 8-10 不同介体加入量下白桦脂酸得率比较 0033 向 30。
23、mL， pH 为 3.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液中依次加入 300L 白桦脂醇的二甲 基亚砜溶液 ( 浓度为 8mg/mL， 白桦脂醇纯度为 90 )， 100L 漆酶溶液 ( 浓度为 4.6U/mL) 和介体紫脲酸溶液 ( 浓度为 5mmol/L)， 其中介体紫脲酸溶液加入量分别为 0L， 200L， 400L， 混合均匀得到反应液。反应液于 28， 转速 120rpm 旋转式摇床上反应 8h， 反应后 的反应液经3000rpm冷冻离心30分钟， 取上清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发浓缩 得到白桦脂酸。采用 RP-HPLC 法对所得样品中白桦脂醇和白桦脂酸的含量进行定量。
24、同步检 测， 结果见表 3。 0034 表 3 不同介体加入量下白桦脂酸得率比较 0035 序号 介体加入量 (mmol) 白桦脂酸得率 ( ) 实施例 8 0 5.21 实施例 9 0.001 12.84 说 明 书 CN 102226213 B 6 5/6 页 7 实施例 10 0.002 13.40 0036 由表 3 可以看出， 加入介体后漆酶催化合成白桦脂酸能力显著增强， 同时， 介体加 入量对白桦脂酸得率也有一定影响， 当 30mL 反应液中加入介体量为 0.002mmol 时， 白桦脂 酸转化得率最大。 0037 实施例 11-13 不同底物加入量下白桦脂酸得率比较 0038 向。
25、30mL， pH为3.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中依次加入白桦脂醇的二甲基亚砜溶 液 ( 浓度为 8mg/mL， 白桦脂醇纯度为 90 )， 100L 漆酶溶液 ( 浓度为 4.6U/mL) 和 200L 介体紫脲酸溶液 ( 浓度为 5mmol/L)， 其中白桦脂醇溶液加入量分别为 37.5L， 300L， 562.5L， 混合均匀得到反应液。反应液于 28， 转速 120rpm 旋转式摇床上反应 8h， 反应 后的反应液经3000rpm冷冻离心30分钟， 取上清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发浓 缩得到白桦脂酸。采用 RP-HPLC 法对所得样品中白桦脂醇和白桦脂酸的含量进行定。
26、量同步 检测， 结果见表 4。 0039 表 4 不同底物加入量下白桦脂酸得率比较 0040 序号 底物溶液加入量 (L) 白桦脂酸得率 ( ) 实施例 11 37.5 5.21 实施例 12 300 12.84 实施例 13 562.5 7.94 0041 表 4 显示， 反应液中白桦脂醇底物浓度对白桦脂酸得率有一定影响， 当 30mL 反应 液中加入浓度 8mg/mL 的白桦脂醇溶液 300L 时， 白桦脂酸转化得率最大。 0042 实施例 14-16 不同转速条件下白桦脂酸得率比较 0043 向 30mL， pH 为 3.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液中依次加入 300L 白桦脂。
27、醇的二甲 基亚砜溶液 ( 浓度为 8mg/mL， 白桦脂醇纯度为 90 )， 100L 漆酶溶液 ( 浓度为 4.6U/mL) 和 200L 介体紫脲酸溶液 ( 浓度为 5mmol/L)， 混合均匀得到反应液。反应液于 28， 不同 转速的旋转式摇床上反应 8h， 其中转速分别选取 60rpm， 120rpm， 180rpm， 反应后的反应液 经3000rpm冷冻离心30分钟， 取上清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦 脂酸。采用 RP-HPLC 法对所得样品中白桦脂醇和白桦脂酸的含量进行定量同步检测， 结果 见表 5。 0044 表 5 不同转速条件下白桦脂酸得率比较 00。
28、45 序号 转速 (rpm) 白桦脂酸得率 ( ) 实施例 14 60 12.11 实施例 15 120 12.84 说 明 书 CN 102226213 B 7 6/6 页 8 实施例 16 180 10.67 0046 由表5可知， 反应液在不同转速条件下反应， 白桦脂酸得率区别不大， 在120rpm转 速下白桦脂酸产物得率略高。 0047 实施例 17-19 不同反应时间条件下白桦脂酸得率比较 0048 向 30mL， pH 为 3.0 的 Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液中依次加入 300L 白桦脂醇的二甲 基亚砜溶液 ( 浓度为 8mg/mL， 白桦脂醇纯度为 90 )， 100L 漆。
29、酶溶液 ( 浓度为 4.6U/mL) 和 200L 介体紫脲酸溶液 ( 浓度为 5mmol/L)， 混合均匀得到反应液。反应液于 28， 转速 120rpm 旋转式摇床上分别反应 8h， 18h， 28h， 反应后的反应液经 3000rpm 冷冻离心 30 分钟， 取上清液， 用乙酸乙酯萃取， 萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂酸。采用 RP-HPLC 法对所得 样品中白桦脂醇和白桦脂酸的含量进行定量同步检测， 结果见表 6。 0049 表 6 不同反应时间条件下白桦脂酸得率比较 0050 序号 反应时间 (h) 白桦脂酸得率 ( ) 实施例 17 8 13.39 实施例 18 18 12.84 实施例 19 28 12.34 0051 从表6可以看出， 随着反应时间的增长， 白桦脂酸得率呈下降趋势， 在反应8h时白 桦脂酸产物得率最高。 说 明 书 CN 102226213 B 8 。