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1、(10)申请公布号 CN 102250825 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102250825 A *CN102250825A* (21)申请号 201110169028.4 (22)申请日 2011.06.22 C12N 5/04(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 首都师范大学 地址 100048 北京市海淀区西三环北路 105 号 (72)发明人 白素兰 何奕騉 胡勇 李苗苗 李斐 姚涛 (74)专利代理机构 北京永创新实专利事务所 11121 代理人 姜荣丽 (54) 发明名称 一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方 法 (5。
2、7) 摘要 本发明公开了一种采用流式细胞仪分选正在 分裂细胞的方法， 属于生物技术领域， 该方法首先 将拟南芥幼苗用 10g/mL 的 propidium iodide 染色， 制成水封装片， 用激光共聚焦扫描显微镜 Leica SP2 观察， 确定原生质体位置 ； 然后进行根 尖原生质体的制备 ； 利用 FASC 细胞分选 ； 并最后 进行总 RNA 的提取。本发明提供的方法可以在较 短时间内收集到较多的处于分裂期的细胞， 显著 提高了实验效率。 与传统的分离方法相比， 可以更 准确的分离到处于正在分裂的细胞。利用分选出 的细胞提取的 RNA 完整度高， 质量好， 用于后续基 因表达谱的研究。
3、更可靠。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 102250827 A1/2 页 2 1. 一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： 第一步、 将拟南芥幼苗用 10g/mL 的 propidium iodide 染色， 制成水封装片， 用激光 共聚焦扫描显微镜 Leica SP2 观察， 确定原生质体位置 ； 第二步， 根尖原生质体的制备 ； 具体为 ： (1) 将 70 微米孔径的滤膜放入小培养皿， 加入酶解缓冲液 ； (2) 用刀片切取根尖放入上述的酶解。
4、缓冲液中， 在水平摇床上以 80-100 转 / 分钟的转 速摇动， 25避光酶解 60 分钟， 形成酶解混合物 ； (3) 将酶解混合物转入离心管中， 2-8， 200-600g 离心 5-10 分钟收集细胞， 除去上 清液， 加入 1mL 的等渗缓冲液 ； 重悬， 70 微米孔径的滤网和 40 微米孔径的滤网各过滤一次， 得到根尖原生质体 ； 所述的酶解缓冲液具体配方为 ： 质量分数为 1.2-1.5纤维素酶， 质量分数为 0.1-0.15果胶酶， 300-600mmolL-1甘露醇， 1.5-2mmolL-1MgCl2， 质量分数为 0.1牛血 清白蛋白， 1.5-2mmolL-1CaC。
5、l2， 2mmolL-1的 2- 吗啉乙磺酸， 10-15mmolL-1KCl， pH 5.5， 上述的百分数均为质量百分比， 其余为水溶剂 ； 所述的等渗缓冲液具体为 ： ： 300-600mmolL-1甘露醇， 1.5-2mmolL-1MgCl2， 质量分数 为 0.1牛血清白蛋白， 1.5-2mmol L-1CaCl2， 2mmol L-12- 吗啉乙磺酸， 10-15mmol L-1KCl， pH 5.5， 其余为水溶剂 ； 第三步、 FASC 细胞分选 ； 用 FACS Aria 流式细胞仪分选原生质体中带 GFP 的细胞， 分选时所采取的参数为 ： 100m 喷嘴， 488 纳米蓝。
6、光激发， 鞘液压力为 20psi ； 细胞直接分选至 RNA buffer 中， 混匀 立刻冻存于 -80 ； 第四步， 总 RNA 的提取 ； 使用RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取分选细胞的总RNA， 按照试剂盒上的说明进行 操作， 并做以下修改 ： 将 RLTbuffer 的体积调整为细胞悬浮液的 3.5 倍， 每 1mL RLTbuffer 中加入 10L-ME， 并省略步骤 QIAshredder， 具体总 RNA 的提取过程如下 ： (1) 将分选得到的细胞悬浮液与 RLTbuffer 充分混匀， 涡旋震荡使细胞破碎， 得到混合 液 ； (2) 加入与上述混合液相。
7、同体积的质量百分比浓度为 70的乙醇， 混匀 ； (3) 将液体转移至 RNeasy 柱， 10,000rpm 离心 1min， 弃去流下的液体 ； (4) 往 RNeasy 柱中加入 700L RPE buffer， 10,000rpm 离心 30sec， 弃去流下的液体 ； (5) 往 RNeasy 柱中加入 500L RWl buffer， 10,000rpm 离心 30sec， 弃去流下的液体 ； (6) 重复步骤 (5) ； (7) 离心转速设置为 14000g 以上使 RNeasy 柱离心 1min， 以除去残留的乙醇 ； (8)将RNeasy柱放入1.5mL离心管中， 加入30L。
8、 DEPC水， 10,000rpm离心1min， 洗脱 RNA ； (9) 将 RNA 置于 -80保存。 2. 根据权利要求 1 所述的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法， 其特征在 于 ： 所述的第三步 FASC 细胞分选的过程包括流式细胞仪的调试、 分选门的设定、 FASC 分选 权 利 要 求 书 CN 102250825 A CN 102250827 A2/2 页 3 参数设定三部分， 具体如下 ： (1) 流式细胞仪的调试 ； 调节主液流 ： 选定 100m 喷嘴， 超声清洗 1 分钟 ； 开机后， 打开主液流断点窗口， 点击 主液流， 调节液流振动幅度 ； 使液滴间隔值稳定。
9、， 调试参数至主液流的连续性和稳定性 ； 调节分选液流 ： 主液流稳定后， 打开侧液流窗口电压， 点击 Test Sort， 调整参数， 使液 流分束清晰 ； 安装四路分选装置， 打开侧液流窗口电压， 点击 Test Sort， 收起废液抽屉， 调 整侧液流窗的电压滚动条， 使偏转的分选液流落入相应的收集管中， 将主液流窗中实际调 出的 Dmpl 值添到默认窗口中 ； 确定液滴延迟 ： 运行流式细胞仪配套的标准质控物Accrodrop Beads， 调整Drop delay 值 ； (2) 分选门的设定 ； 以野生型拟南芥根尖原生质体作阴性对照， 转基因植株 Wer:GFP 根尖原生质体作阳 。
10、性对照， 建立分选门， 分选门的确定基于以下几个原则 ： 完整的原生质体具有较高的前向角 和侧向角比值 ； 相对于阴性对照， GFP 阳性细胞在绿光荧光通道有强烈的发射光 ； (3)FASC 分选参数 ； 前向角 FSC 指示细胞大小， 前向角电压 ： 184V ； 侧向角 SSC 指示细胞复杂度， 侧向角电压 ： 120V ； 设定前向角阈值排除细胞碎片， 前向角阈值 ： 1000 ； 绿色荧光通道 FITC 指示细胞绿色荧光强度， 绿色荧光通道电压 ： 368V ； 橙色荧光通道 PE 指示细胞橙色荧光强度， 橙色荧光通道电压 ： 430V ； 鞘液压力 ： 20psi ； 流速 ： 2,。
11、000-5,000events per secend ； 3. 根据权利要求 2 所述的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法， 其特征在 于 ： 所述的强烈的发射光是满足每秒钟大于 100 个阳性细胞落在分选门内 ； 较高的前向角 和侧向角比值为满足前向角在 50 100103处。 4. 根据权利要求 1 所述的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法， 其特征 在于 ： 所述的酶解缓冲液具体为 ： 1.5纤维素酶， 0.1果胶酶， 600mmolL-1甘露醇， 2mmolL-1MgCl2， 0.1牛血清白蛋白， 2mmolL-1CaCl2， 2mmolL-1的 2- 吗啉乙磺酸， 10m。
12、molL-1KCl， pH 5.5， 上述的百分数均为质量百分比， 其余为水溶剂 ； 所述的等渗缓冲液具体为 ： 600mmolL-1甘露醇， 2mmolL-1MgCl2， 质量分数为 0.1牛 血清白蛋白， 2mmolL-1CaCl2， 2mmolL-12- 吗啉乙磺酸， 10mmolL-1KCl， pH 5.5， 其余为水 溶剂。 权 利 要 求 书 CN 102250825 A CN 102250827 A1/6 页 4 一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及一种细胞分选方法， 具体地说， 是指一种采用流式 细胞仪分选正在分裂细胞的方。
13、法， 建立分离拟南芥根尖处于细胞分裂周期中的细胞 ( 以下 简称 ： 分裂细胞 ) 的实验系统。 背景技术 0002 流式细胞仪技术 (Flow Cytometry) 是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物 颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。FACS Aria 是 BD 公司 2003 年推出的世界首款台 式高速多荧光检测和分选的流式细胞仪， 其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细 胞， 以便作进一步鉴定、 功能研究或细胞培养。目前， 流式细胞仪分选技术已被广泛用于医 学研究和应用， 但其在植物学领域的应用较少。 0003 植物是由复杂的组织和器官构成， 构成植物组织或器官的细胞又可以分。
14、为多种 不同类型， 见参考文献 1Scheres B， Benfey P， Dolan L(2002).Root Development.The Arabidopsis Book， First published on September 30， doi ： 10.1199/tab.0101 ； 参考文 献2Scheres B， van den Toorn H， Heidstra R(2004).Root genomics ： towards digital in situ hybridization.Genome Biol 5 ： 227 ； 参考文献 3Galbraith D.W.， Bi。
15、rnbaum K.(2006).Global studies of cell type-specific gene expressionin plants. AnnualRev Plant Biol 57 ： 451-475。植物的发育是通过调控基因表达及决定细胞命运 而实现的， 因此建立不同类型细胞的基因表达谱对研究植物发育具有重要的意义， 见参考 文献 4Birnbaum K， Shasha DE， Wang JY， Jung JW， Lambert GM， Galbraith DW， Benfey PN(2003).A gene expression map of the Arabido。
16、psis root.Science 302 ： 1956-1960 ； 参考文献 5Nawy T， Lee JY， Colinas J， Wang JY， Thongrod SC， Malamy JE， Birnbaum K， Benfey PN(2005).Transcriptional profile ofthe Arabidopsis root quiescent center.Plant Cell 17 ： 1908-1925 ； 参 考 文 献 6Galbraith DW， Birnbaum K(2006). Global studies of cell type-specific 。
17、geneexpression in plants.Annual Rev Plant Biol 57 ： 451-475 ； 参考文献 7Zhang C， Barthelson RA， Lambert GM， Galbraith DW(2008).Global Characterization of Cell-Specific Gene Expressionthrough Fluorescence-Activated Sorting ofNuclei.PlantPhysiology 147 ： 30-40。 植物的组织、 器官及整体生长是通过细胞分裂增加细胞数量和通过细胞伸长增加体积(即细胞周期。
18、)来 实现的。细胞周期中的主要事件是 DNA 复制成两个拷贝， 通过有丝分裂分配到两个子代细 胞中。细胞周期被划分为 G1 期 (M 期结束到 S 期之间的间隙 )、 S 期 (DNA 合成期 )、 G2 期 (S 期结束到 M 期之间的间隙 ) 和 M 期 ( 有丝分裂期 )。要建立不同时期细胞的基因表达谱 首先需要将不同类型的细胞分离开， 然后收集所需细胞类型并获得足够量的 mRNA， 才能够 进行表达谱分析。目前分选特定细胞的技术还有激光捕获技术， 利用该技术必须对所研究 的组织或器官进行杀死、 固定、 包埋和切片， 暴露出所研究的目标细胞， 然后通过激光捕获 仪进行切割并分离该目标细胞。
19、， 见参考文献 8Kerk NM， Ceserani T， Tausta SL， Sussex 说 明 书 CN 102250825 A CN 102250827 A2/6 页 5 IM， Nelson TM.LaserCapture Microdissection of Cells from Plant tissues.Plant Physiology 132 ： 27-35。 由于分离细胞花费的时间很长， 大约需要4-5天时间， 并且实验过 程繁杂， 细胞经过切片， 分离出的 RNA 完整度大大降低， 实验的准确性不能完全保证。 发明内容 0004 本发明利用流式细胞仪成功收集到了拟南芥根。
20、尖发育早期正在分裂的细胞， 为从 中分离出高质量的 RNA 奠定基础， 可用于后续基因表达谱的研究。利用本发明提供的方法 能够快速、 大量富集所研究的目标细胞， 整个过程仅需要 2-3 个小时， 大大减少收集细胞所 花费的时间， 提高了实验效率， 同时提高实验的准确性。 0005 本发明建立了分离拟南芥根尖分裂的细胞的实验系统。选择在分裂细胞中 G2/ M 特异表达的基因 CyclinB1(CycB1)， 用其启动子以及它的 N 端的部分序列 (Destruction Box， 这段序列确保 CycB1 功能完成后能够及时被识别降解 ) 与 GFP( 绿色荧光蛋白 ) 构建 融合基因表达载体，。
21、 获得 CycB1:GFP 转基因纯系植株， 见参考文献 9Colon-Carmona A.， You R.， Hurst R.D.， Haimovitch-Gal T.， Doerner P.(1999).Saptio-temporal analysis ofmitotic activity with a labilecyclin-GUS fusion protein。 CycB1是植物细胞周期 检验点基因， 主要在 G2 和 M 早期表达， 随后被迅速降解， 它在 G2/M 期的转变中起作用。为 了分离拟南芥根尖分裂细胞， 需要分别将正在分裂的细胞进行荧光标记， 才能够利用流式 细胞仪收集。
22、。本发明以在根尖发育早期的正在分裂的细胞中表达 CYCB:GFP 绿色荧光蛋白 的拟南芥转基因植物为材料， 使用流式细胞仪分选出了较多 G2/M 期的细胞， 可以为建立特 定时期细胞的基因表达谱研究奠定技术基础。 0006 本发明提供的采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法， 主要用于分离拟南芥根 尖分裂的细胞， 具体步骤如下 ： 0007 第一步、 将拟南芥幼苗用 10g/mL 的 propidium iodide 染色， 制成水封装片， 用 激光共聚焦扫描显微镜 Leica SP2 观察， 确定原生质体位置 ； 0008 第二步， 根尖原生质体的制备 ； 0009 具体为 ： 0010 (1。
23、) 将 70 微米孔径的滤膜放入小培养皿， 加入酶解缓冲液 ； 0011 (2) 用刀片切取根尖放入上述的酶解缓冲液中， 在水平摇床上以 80-100 转 / 分钟 的转速摇动， 25避光酶解 60 分钟， 形成酶解混合物 ； 0012 (3) 将酶解混合物转入离心管中， 2-8， 200-600g 离心 5-10 分钟收集细胞， 除 去上清液， 加入 1mL 的等渗缓冲液 ； 0013 (4) 重悬， 70 微米孔径的滤网和 40 微米孔径的滤网各过滤一次， 得到根尖原生质 体 ； 0014 所述的酶解缓冲液具体为 ： 质量分数为 1.2-1.5纤维素酶， 质量分数为 0.1-0.15果胶酶。
24、， 300-600mmolL-1甘露醇， 1.5-2mmolL-1MgCl2， 质量分数为 0.1牛血 清白蛋白， 1.5-2mmolL-1CaCl2水溶液， 2mmolL-1的 2- 吗啉乙磺酸， 10-15mmolL-1KCl 水 溶液， pH 5.5， 上述的百分数均为质量百分比 ； 0015 所述的等渗缓冲液具体为 ： 300-600mmolL-1甘露醇， 1.5-2mmolL-1MgCl2， 质 量 分 数 为 0.1 牛 血 清 白 蛋 白， 1.5-2mmolL-1CaCl2， 2mmolL-12- 吗 啉 乙 磺 酸， 说 明 书 CN 102250825 A CN 10225。
25、0827 A3/6 页 6 10-15mmolL-1KCl， pH 5.5 ； 0016 第三步、 FASC 细胞分选 ； 0017 用FACS Aria流式细胞仪分选原生质体中带GFP的细胞， 分选时所采取的参数为 ： 100m 喷嘴， 488 纳米蓝光激发， 鞘液压力为 20psi ； 细胞直接分选至 RNA buffer 中， 混匀 立刻冻存于 -80 ； 0018 第四步， 总 RNA 的提取 ； 0019 使用 RNeasy Plant Mini Kit 试剂盒提取分选细胞的总 RNA， 按照试剂盒上的 说明进行操作， 并做以下修改 ： 将 RLTbuffer 的体积调整为细胞悬浮液。
26、的 3.5 倍， 每 1mL RLTbuffer 中加入 10L-ME， 并省略步骤 QIAshredder， 具体总 RNA 的提取过程如下 ： 0020 (1) 将分选得到的细胞悬浮液与 RTL buffer 充分混匀， 涡旋震荡使细胞破碎， 得 到混合液 ； 0021 (2) 加入与上述混合液相同体积的质量百分比浓度为 70的乙醇， 混匀 ； 0022 (3) 将液体转移至 RNeasy 柱， 10,000rpm 离心 1min， 弃去流下的液体 ； 0023 (4) 往 RNeasy 柱中加入 700LRPE buffer， 10,000rpm 离心 30sec， 弃去流下的液 体 ；。
27、 0024 (5) 往 RNeasy 柱中加入 500LRW1buffer， 10,000rpm 离心 30sec， 弃去流下的液 体 ； 0025 (6) 重复步骤 (5) ； 0026 (7) 最大转速使 RNeasy 柱离心 1min， 以除去残留的乙醇 ； 0027 (8) 将 RNeasy 柱放入 1.5mL 离心管中， 加入 30LDEPC 水， 10,000rpm 离心 1min， 洗脱 RNA ； 0028 (9) 将 RNA 置于 -80保存。 0029 本发明提供的方法的优点在于 ： 0030 (1) 可以在较短时间内收集到较多的处于分裂期的细胞， 显著提高了实验效率。 0。
28、031 (2) 与传统的分离方法相比， 可以更准确的分离到处于正在分裂的细胞。 0032 (3) 利用分选出的细胞提取的 RNA 完整度高， 质量好， 用于后续基因表达谱的研究 更可靠。 附图说明 0033 图1为激光共聚焦显微扫描检测拟南芥转基因株系CYCB:GFP基因的表达部位扫 描图 ； 0034 图 2 为拟南芥根尖分裂细胞原生质体的收集的显微观察结果 ； 0035 图 3 为 FACS 分选散点图 ； 0036 图 4 为总 RNA 纯度、 完整度的检测及 RT-PCR。 具体实施方式 0037 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于以下实施 例。 0038。
29、 下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。 说 明 书 CN 102250825 A CN 102250827 A4/6 页 7 0039 下面通过实施例来说明本发明提供的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的 方法， 主要用于分离拟南芥根尖分裂的细胞， 具体通过如下步骤实现 ： 0040 步骤 1、 激光共聚焦显微观察， 确定正在分裂细胞的位置。 0041 本发明以在根尖发育早期的正在分裂的细胞中表达 CYCB:GFP 绿色荧光蛋白的 拟南芥转基因植物， 拟南芥幼苗用 10g/mL 的 propidium iodide(PI， sigma) 染色 2 分钟， 制成水封装片， 用激光共聚焦。
30、扫描显微镜 Leica SP2( 德国 Leica) 观察。 0042 将上述制成的水封装片， 置于激光共聚焦扫描显微镜Leica SP2下观察， 观察结果 显示正在分裂的细胞位于拟南芥幼苗初生根的分生区， 如图 1 所示为生长 5 天的拟南芥幼 苗初生根激光共聚焦显微扫描图。 图1中， 图A为野生型拟南芥初生根激光共聚焦显微镜观 察结果， 无GFP荧光 ； 图B为转基因拟南芥CycB1:GFP初生根激光共聚焦显微镜观察结果， GFP 荧光只存在于根尖分生区的部分细胞中， 如图 B 中箭头所示灰色点部分， Bar 80m。 0043 步骤 2、 根尖原生质体的制备。 0044 具体为 ： 00。
31、45 (1) 将 70 微米孔径的滤膜放入小培养皿， 并在小培养皿中加入酶解缓冲液 ； 0046 所述的酶解缓冲液具体配方为 ： 质量分数为 1.2-1.5纤维素酶， 质量分数为 0.1-0.15果胶酶， 300-600mmolL-1甘露醇， 1.5-2mmolL-1MgCl2， 质量分数为 0.1牛血 清白蛋白， 1.5-2mmolL-1CaCl2， 2mmolL-1的 2- 吗啉乙磺酸， 10-15mmolL-1KCl， pH 5.5， 上述的百分数均为质量百分比， 其余为水溶剂。 0047 优选的， 选择酶解缓冲液具体配方为 ： 1.5纤维素酶， 0.1果胶酶， 600mmolL-1 甘。
32、露醇， 2mmolL-1MgCl2， 0.1牛血清白蛋白 (BSA)， 2mmolL-1CaCl2， 2mmolL-1的 2- 吗 啉乙磺酸 (MES)， 10mmolL-1KCl， pH 5.5， 上述的百分数均为质量百分比， 其余为水溶剂。 0048 (2) 用刀片切取根尖 (3 毫米 ) 放入酶解缓冲液中， 在水平摇床上以 80 100 转 / 分钟 ( 优选 85 转 / 分钟 ) 的转速摇动， 25避光酶解 60 分钟， 形成酶解混合物。 0049 (3) 将酶解混合物转入离心管中， 2-8 ( 优选 2-4或 4 )， 200-600g( 优 选 200-350g 或 350g) 。
33、条件下离心 5-10 分钟收集细胞， 除去上清液， 继续向离心 管中加入 1mL 的等渗缓冲液， 所述的等渗缓冲液配方为 ： 300-600mmolL-1甘露醇， 1.5-2mmol L-1MgCl2， 质量分数为0.1牛血清白蛋白， 1.5-2mmol L-1CaCl2， 2mmol L-12-吗 啉乙磺酸， 10-15mmolL-1KCl， pH 5.5， 其余为水溶剂。 0050 优选的， 选择等渗缓冲液配方为 ： 600mmolL-1甘露醇， 2mmolL-1MgCl2， 质量 分数为 0.1牛血清白蛋白 (BSA)， 2mmolL-1CaCl2， 2mmo1L-12- 吗啉乙磺酸 (。
34、MES)， 10mmolL-1KCl， pH 5.5， 其余为水溶剂。 0051 (4) 重悬， 采用 70 微米孔径的滤网和 40 微米孔径的滤网各过滤一次， 在显微镜下 观察细胞完整性。细胞的完整性如图 2 所示， 图 2 中 A 图为 CYCB:GFP 根尖细胞原生质体， 明场观察结果 ； B图为图A所示视野CYCB:GFP植物根尖细胞原生质表达绿色荧光蛋白(图 中灰色的点所示， 488nm 激发 ) ； C 图为野生型拟南芥根尖原生质体， 明场观察结果 ； D 图为 图 C 所示视野中野生型拟南芥根尖原生质体在 488nm 下无荧光。Bar 40m， 结果表明所 分离的拟南芥根尖整体原。
35、生质体分离完全， 可以用于下一步的分选。 0052 步骤 3、 FASC 细胞分选。 0053 用 FACS Aria 流式细胞仪 ( 美国 BD FACS Aria) 分选原生质体中带 GFP 的细胞。 说 明 书 CN 102250825 A CN 102250827 A5/6 页 8 分选时所采取的参数为 ： 100m 喷嘴， 488 纳米蓝光激发， 鞘液压力为 20psi。细胞直接分 选至 RNAbuffer 中 (Qiagen RLT buffer)， 混匀立刻冻存于 -80， 具体实现步骤如下 ： 0054 (1) 流式细胞仪的调试。 0055 调节主液流 ： 选定 100m 喷嘴。
36、， 超声清洗 1 分钟。开机后， 打开主液流断点窗口， 点击主液流， 调节液流振动幅度(Ampl)， 使液滴间隔值(Gap值)稳定， 调试参数至主液流的 连续性和稳定性。 0056 调节分选液流 ： 主液流稳定后， 打开侧液流窗口电压， 点击 Test Sort， 调整参数， 使液流分束清晰。安装四路分选装置， 打开侧液流窗口电压， 点击 Test Sort， 收起废液抽 屉， 调整侧液流窗的电压滚动条， 使偏转的分选液流落入相应的收集管中。 将主液流窗中实 际调出的 Dmpl 值添到默认窗口中。 0057 确定液滴延迟 ： 运行流式细胞仪配套的标准质控物 Accrodrop Beads， 调。
37、整 Drop delay 值。 0058 (2) 分选门的设定。 0059 以野生型拟南芥 (Arabidopsis thaliana Columbia-0) 根尖原生质体作阴性对 照， 转基因植株 Wer:GFP 根尖原生质体作阳性对照， 建立分选门。分选门的确定基于以下 几个原则 ： 完整的原生质体具有较高的前向角 (FSC) 和侧向角 (SSC) 比值 ； 相对于阴性对 照， GFP 阳性细胞在绿光荧光通道 ( 530 纳米 ) 有强烈的发射光， 使得每秒钟大于 100 个 阳性细胞落在分选门内。一般认为， 前向角应该在 50 100103处， 最好落于 100103。 0060 (3)。
38、FASC 分选参数 ； 0061 前向角 FSC 指示细胞大小， 前向角电压 (FSC Voltage) ： 184V ； 0062 侧向角 SSC 指示细胞复杂度， 侧向角电压 (SSC Voltage) ： 120V ； 0063 设定前向角阈值排除细胞碎片， 前向角阈值 (FSC Threshold value) ： 1000 ； 0064 绿色荧光通道 FITC 指示细胞绿色荧光强度， 绿色荧光通道电压 (FITC Voltage) ： 368V ； 0065 橙色荧光通道 PE 指示细胞橙色荧光强度， 橙色荧光通道电压 (PE Voltage) ： 430V ； 0066 鞘液压力 。
39、(Sheath pressure) ： 20psi ； 0067 流速 (Flow rate) ： 2,000-5,000events per secend ； 0068 此参数下的 FSC vs.SSC 散点图如图 3 所示， 图 3 中 A ： 野生型拟南芥原生质体双 参数分析， 说明野生型拟南芥细胞自发荧光， 在绿色荧光通道 ( 横坐标 ) 和橙色荧光通道 ( 纵坐标 ) 有近似相等的荧光强度 ； B ： Wer:GFP 原生质体双参数分析， 说明 Wer:GFP 转基 因植物分选门P1中的细胞散射出的绿色荧光远大于橙色荧光， 这些细胞是对照的GFP阳性 细胞 ； C-D ： CycB1。
40、:GFP 原生质体的 FASC 分选。 0069 步骤 4、 总 RNA 的提取。 0070 使用 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen) 试剂盒提取分选细胞的总 RNA， 按照试剂 盒上的说明进行操作， 并做以下修改 ： 将RLT buffer的体积调整为细胞悬浮液的3.5倍， 每 1mLRLTbuffer 中加入 10L-ME， 并省略步骤 QIAshredder， 具体总 RNA 的提取过程如下 ： 0071 (1) 将分选得到的细胞悬浮液与 RLTbuffer 充分混匀， 涡旋震荡使细胞破碎， 得到 混合液 ； 说 明 书 CN 102250825 A CN 102。
41、250827 A6/6 页 9 0072 (2) 加入与上述混合液相同体积的乙醇， 混匀 ； 所述乙醇的质量百分比浓度为 70 ； 0073 (3) 将液体转移至 RNeasy 柱， 10,000rpm 离心 1min， 弃去流下的液体 ； 0074 (4) 往 RNeasy 柱中加入 700LRPE buffer， 10,000rpm 离心 30sec， 弃去流下的液 体 ； 0075 (5) 往 RNeasy 柱中加入 500LRW1buffer， 10,000rpm 离心 30sec， 弃去流下的液 体 ； 0076 (6) 重复步骤 (5) ； 0077 (7) 离心转速设置为 140。
42、00g 以上使 RNeasy 柱离心 1min， 以除去残留的乙醇 ； 0078 (8) 将 RNeasy 柱放入 1.5mL 离心管中， 加入 30L 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水， 10,000rpm 离心 1min， 洗脱 RNA ； 0079 (9) 将 RNA 置于 -80保存。 0080 超微量分光光度计(NanoDrop)检查RNA的量和纯度， Agilent 2100生物分析仪检 测其完整性， 进行总 RNA 的定量和质量检测。如图 4 所示， A ： 总 RNA 在 Agilent 2100 生物 分析仪中的检测结果 ； B ： 看家基因 UBQ 的 RT-PCR 扩增产物。
43、电泳图。M ： DL2000maker ； UBQ ： UBIQUITIN， 结果显示， RNA 分离完整， 并且可以用于后续的基因表达分裂。 0081 根据上述的制备方法， 改变第二步中所述的酶解缓冲液的配方为 ： 质量分数为 1.2纤维素酶， 质量分数为0.15果胶酶， 300mmol L-1甘露醇， 1.5mmol L-1MgCl2， 质量分 数为 0.1牛血清白蛋白， 1.5mmol L-1CaCl2， 2mmol L-1的 2- 吗啉乙磺酸， 15mmol L-1KCl， pH5.5， 上述的百分数均为质量百分比， 其余为水溶剂。 0082 改变等渗缓冲液配方为 ： 300mmolL。
44、-1甘露醇， 1.5mmolL-1MgCl2， 0.1牛血清白 蛋白， 1.5mmolL-1CaCl2， 2mmolL-12- 吗啉乙磺酸， 15mmolL-1KCl， pH 5.5， 其余为水溶剂。 0083 其余的条件不变， 得到的拟南芥根尖 RNA 仍然是分离完整的。 0084 本发明中， 酶在植物原生质体分离中不可缺少， 目前主要应用的酶有纤维素酶、 果 胶酶、 离析酶、 半纤维素酶、 崩溃酶、 蜗牛酶等。 而酶的选取、 搭配， 尤其是浓度配比在植物原 生质体的分离中起到至关重要的作用， 本发明中采取纤维素酶和果胶酶两种， 取得了较好 的分离结果， 并且二者的浓度配比， 在 1.2 1。
45、， 1.3 1， 1.4 1， 1.5 1 的情况下， 均可 以分离得到该类分裂细胞， 即可以扩展到 1.2-1.5 1 范围内。其中在 1.5 1 的条件下 效果最佳。 0085 在流式细胞分选前的参数设定和调试是细胞分选的关键性工作， 其中前向角散射 (FSC) 可以用来检测细胞的大小， 通过调试， 本发明将前向角电压设置为 184， 前向角阈值 设置为 1000， 不仅有效的分离了正在分裂的细胞， 而且排除了样品中的各种碎片和小颗粒 物质对被分离细胞的干扰， 提高了分选的效率、 纯度和精度， 适用于该类分裂细胞的分选。 0086 本发明采用 QIAGEN 公司的 RNeasy Plant。
46、 Mini Kit 试剂盒提取分选细胞的总 RNA， 并做出适当调整， 由于样品中无高粘度的植物裂解物， 故省略 QIAshredder 分离柱离 心步骤 ； 本方法调整 RLT buffer 的体积为细胞悬浮液的 3.5 倍， 为分离得到的该类细胞提 供一个最适的缓冲空间， 并能够使得到的细胞混合物中的RNA酶(RNase)迅速失活， 保证了 分离 RNA 的完整性。 说 明 书 CN 102250825 A CN 102250827 A1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102250825 A CN 102250827 A2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102250825 A 。