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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610671047.X (22)申请日 2016.08.14 (71)申请人 广西壮族自治区农业科学院植物保 护研究所 地址 530007 广西壮族自治区南宁市西乡 塘区大学东路174号 (72)发明人 李战彪谢慧婷杨世安秦碧霞 崔丽贤苏琴蔡健和邓铁军 (74)专利代理机构 北京中誉威圣知识产权代理 有限公司 11279 代理人 朱志宽 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01)。
2、 C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于农业生物技术领域， 本发明公开 了一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物 组、 试剂盒及其应用。 本发明利用专门针对瓜类 褪绿黄化病毒( CCYV )、 甜瓜坏死斑点病毒 (MNSV)、 甜瓜黄化斑点病毒(MYSV)等3种病毒的3 对特异引物对CCYV-F/CCYV-R、 MNSV-F/MNSV-R、 MYSV-F/MYSV-R， 并结合一步法RT-PCR检测技术， 实现了对3种病毒的同时鉴别。 应用本发明， 在提 取样品总RNA后， 仅需一次RT-。
3、PCR检测即可实现 对3种侵染瓜类的RNA病毒的检测， 为调查鉴定提 供了较为简便的方法。 与传统RT-PCR一次仅能检 测一种病毒相比， 该法既减少了成本又节约了时 间， 既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操 作， 是一种特异、 灵敏、 方便且经济有效的检测方 法。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 106048095 A 2016.10.26 CN 106048095 A 1.一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组， 其特征在于： 包括3对特异性引物 对， 分别是引物对CCYV-F和CCYV-R、 引物对MNSV-F和MNSV-R、 引物对MYSV-F和MYSV-R， 其分。
4、 别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的序列。 2.一种用于鉴定瓜类褪绿黄化病毒的引物对， 包括特异性引物CCYV-F和CCYV-R， 它们 分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。 3.一种用于鉴定甜瓜坏死斑点病毒的引物对， 包括特异性引物MNSV-F和MNSV-R， 它们 分别具有序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.4的碱基序列。 4.一种用于鉴定甜瓜黄化斑点病毒的引物对， 包括特异性引物MYSV-F和MYSV-R， 它们 分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。 5.一种同步检测3种侵染瓜类的RN。
5、A病毒的试剂盒， 包括反转录试剂、 PCR试剂、 DEPC水 和RNase-free水， 其特征在于： 所述的PCR试剂中含有3对特异性引物对， 分别是引物对 CCYV-F和CCYV-R、 引物对MNSV-F和MNSV-R、 引物对MYSV-F和MYSV-R， 其分别具有如SEQID No.1至SEQIDNo.6所示的序列。 6.根据权利要求5所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述 的PCR试剂每管20 L， 其中2oneStepBuffer10 L， PrimeScriptoneStepEnzymeMix 0.8 L， 引物CCYV-F/R各0.2 L、 MNS。
6、V-F/R各0.2 L、 MYSV-F/R各0.3 L， 模板RNA1.2 L和ddH2O 6.6 L。 7.根据权利要求6所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述 的引物CCYV-F/R、 MNSV-F/R、 MYSV-F/R的使用浓度为10 M。 8.根据权利要求1所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、 权利要求2-4任一 所述的引物对或权利要求5-7任一所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒在鉴别 瓜类褪绿黄化病毒、 甜瓜坏死斑点病毒、 甜瓜黄化斑点病毒中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106048095 A 2 同步检测3种侵染。
7、瓜类的RNA病毒的引物组、 试剂盒及其应用 技术领域 0001 本发明属于植物类病毒检测技术领域， 尤其涉及一种同步检测3种侵染瓜类的RNA 病毒的引物组、 试剂盒， 以及鉴定瓜类褪绿黄化病毒、 甜瓜坏死斑点病毒、 甜瓜黄化斑点病 毒的引物对或引物组及其试剂盒。 背景技术 0002 瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbatchloroticyellowsvirus,CCYV)属于长线病毒科 (Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)。 基因组由双链RNA组成(即RNA1(8607nt)和 RNA2(8041nt)， 以介体烟粉虱进行半持久性传播。 主要为害西瓜、 甜瓜、 黄。
8、瓜等， 以甜瓜大 面积发病最为常见。 该病最早于2004年在日本观察到， 至2010年其病原才被揭示。 在我国， 古勤生等2007年在宁波、 上海等地发现。 随后在海南、 河南、 北京和山东等地有报道。 2014- 2015年本课题组调查发现， 该病在南宁市、 北海市部分甜瓜大棚中发病率高达20-70以 上， 危害较重。 0003 甜瓜坏死斑点病毒(Melonnecroticspotvirus， MNSV)属于甜瓜丛矮病毒科 (Tombusviridae)香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)， 基因组为正义单链RNA， 约4.3kb。 甜瓜 坏死斑点病毒主要通过种子、 土壤真菌瓜油壶菌(O。
9、lpidiumradicale)和黄瓜黑头叶甲进 行自然传播， 另外也可通过机械接种进行传播， 寄主范围限于葫芦科植物西瓜、 南瓜、 葫芦、 黄瓜、 甜瓜等， 其中甜瓜为系统侵染寄主。 该病最早于日本报道， 随后在美国、 希腊、 瑞典、 意 大利和突尼斯等国家出现。 我国于2007年在江苏省海门市温室甜瓜中发现该病， 2015年山 东寿光也有报道。 2015年本课题组调查发现， 该病在广西也有发生。 0004 甜瓜黄化斑点病毒(Melonyellowspotvirus， MYSV)， 属于布尼亚病毒科 (Bunyaviridae)甜瓜斑萎病毒属(Tospovirus)。 基因组包括3个单链线性。
10、RNA片段即LRNA、 MRNA和SRNA。 在植株间主要是通过棕榈蓟马(ThripspalmiKarny)以持久方式传播， 也 可通过汁液机械传播。 主要为害甜瓜、 西瓜、 黄瓜和苦瓜等葫芦科作物， 该病毒于2000年在 日本首次发现并命名， 2008年我国台湾的西瓜发现受到该病毒侵染， 2009年在海南省三亚 市大棚甜瓜被发现受到该病毒侵染。 随后， 广东的西瓜和山东寿光的黄瓜也有报道。 2011年 古勤生等调查发现， 海南三亚保护地甜瓜上MYSV的发病率为30-100， 造成严重的经济损 失。 2014年起， 本课题组在南宁市、 北海市等地的甜瓜大棚中发现该病， 发病后期造成甜瓜 畸形，。
11、 丧失经济价值， 造成严重的经济损失 0005 上述3种病毒均属于RNA病毒。 而传统的鉴别方法如： 生物学接种法、 电镜观察法、 血清学检测法、 分子生物学方法等方法要么费时费钱， 要么需要昂贵的仪器设备， 目前， 尚 未见到使用RT-PCR一次即可区分这3种病毒的方法。 0006 本发明提供的3对引物组由发明人自行设计， 并完成了多重PCR的体系优化， 引物 配比优化等相关工作； 多重PCR就是为了减轻工作量， 减少耗材的使用等； 设计3对引物组， 可以扩增不同大小的目的条带， 便于区分各病毒。 说明书 1/7 页 3 CN 106048095 A 3 发明内容 0007 本发明要解决的技。
12、术问题是提供一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、 试剂盒及其应用。 0008 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案： 0009 一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组， 包括3对特异性引物对， 分别是引 物对CCYV-F和CCYV-R、 引物对MNSV-F和MNSV-R、 引物对MYSV-F和MYSV-R， 其分别具有如SEQ IDNo.1至SEQIDNo.6所示的序列。 0010 一种用于鉴定瓜类褪绿黄化病毒的引物对， 包括特异性引物CCYV-F和CCYV-R， 它 们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。 0011 一种用于鉴定甜瓜。
13、坏死斑点病毒的引物对， 包括特异性引物MNSV-F和MNSV-R， 它 们分别具有序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.4的碱基序列。 0012 一种用于鉴定甜瓜黄化斑点病毒的引物对， 包括特异性引物MYSV-F和MYSV-R， 它 们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。 0013 一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒， 包括反转录试剂、 PCR试剂、 DEPC 水和RNase-free水， 其特征在于： 所述的PCR试剂中含有3对特异性引物对， 分别是引物对 CCYV-F和CCYV-R、 引物对MNSV-F和MNSV-R、 引物对MYS。
14、V-F和MYSV-R， 其分别具有如SEQID No.1至SEQIDNo.6所示的序列。 0014 作为优选， 所述的PCR试剂每管20L， 其中2oneStepBuffer10L， PrimeScriptoneStepEnzymeMix0.8 L， 引物CCYV-F/R各0.2 L、 MNSV-F/R各0.2 L、 MYSV-F/R各0.3 L， 模板RNA1.2 L及ddH2O6.6 L。 0015 作为优选， 所述的引物CCYV-F/R、 MNSV-F/R、 MYSV-F/R的使用浓度为10 M。 0016 本发明还提供了所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、 所述的引物对 或。
15、所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒在鉴别瓜类褪绿黄化病毒、 甜瓜坏死斑 点病毒、 甜瓜黄化斑点病毒中的应用。 0017 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 0018 1.本发明的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的方法是针对目前3种侵染瓜类的 RNA病毒(CCYV、 MNSV和MYSV)危害严重却又缺乏快速有效鉴别手段的问题， 发明人根据3种 病毒的基因序列分别优化设计了对应的3对特异引物CCYV-F/CCYV-R、 MNSV-F/MNSV-R、 MYSV-F/MYSV-R， 并结合RT-PCR检测技术建立的。 0019 2.应用本发明的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的方法。
16、， 在提取样品总RNA后， 仅 需一次RT-PCR检测即可实现对3种侵染瓜类的RNA病毒的检测， 为调查鉴定提供了较为简便 的方法。 与传统RT-PCR一次仅能检测一种病毒相比， 该法既减少了成本又节约了时间， 既保 证了灵敏性和特异性同时也简化了操作， 是一种特异、 灵敏、 方便且经济有效的检测方法。 附图说明 0020 图1为本发明所建立的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的特异性实验结果图； 0021 其中， M-DM2000标准分子量； 1-健康甜瓜植株； 2-已知感染瓜类褪绿黄化病毒样 品； 3-已知感染甜瓜坏死斑点病毒样品； 4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品； 5已知感染瓜 说明书 。
17、2/7 页 4 CN 106048095 A 4 类褪绿黄化病毒、 甜瓜坏死斑点病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样品。 0022 图2为应用本发明所建立的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒方法的实例结果图； 0023 其中， M-DM2000标准分子量； 1-健康甜瓜植株； 2-已知感染瓜类褪绿黄化病毒样 品； 3-已知感染甜瓜坏死斑点病毒样品； 4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品； 5已知感染瓜 类褪绿黄化病毒、 甜瓜坏死斑点病毒的样品； 6-已知感染甜瓜坏死斑点病毒、 甜瓜黄化斑点 病毒的样品； 7-已知感染瓜类褪绿黄化病毒、 甜瓜黄化斑点病毒的样品。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施例， 对。
18、本发明作进一步详细的阐述， 但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。 这些实施例仅用于说明本发明， 而非用于限制本发明的范围。 此 外， 在阅读本发明的内容后， 本领域的技术人员可以对本发明作各种修改， 这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。 0025 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所 使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0026 实施例1： 引物设计 0027 根据NCBI上已报道的瓜类褪绿黄化病毒( AB523789 )、 甜瓜坏死斑点病毒 (M29671)、 甜瓜黄化斑点病毒(AF076151)。
19、来设计并优选而得3组引物对， 具体配对如下表1。 0028 表1同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组 0029 特异引物对针对病毒扩增目的条带大小 CCYV-F/CCYV-RCCYV877bp MNSV-F/MNSV-RMNSV549bp MYSV-F/MYSV-RMYSV370bp 0030 实施例2： 0031 待测样本包括： 1-健康甜瓜植株； 2-已知感染瓜类褪绿黄化病毒样品； 3-已知感染 甜瓜坏死斑点病毒样品； 4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品； 5-已知同时感染瓜类褪绿黄 化病毒、 甜瓜黄化斑点病毒和甜瓜坏死斑点病毒样品。 0032 按下列步骤对各样品分别进行RT-PCR检测。
20、。 0033 (1)提取样品总RNA 0034 称取0.1g待测样本于研钵中， 加入液氮研磨， 研磨后迅速转移至装有1mLTRNzol- A+总RNA提取试剂的1.5mL离心管中， 剧烈震荡后冰上放置5min， 加入200 L氯仿剧烈震荡， 室温放置3min， 12000rpm离心10min， 取400 L上清液至新EP管中， 加入240 L异丙醇， 颠倒混 匀， 室温放置12000min离心10min， 弃上清， 75乙醇(RNase-Free水配制)清洗两次， 通风橱 内晾干， 加入50 LRNase-Free水溶解沉淀， -80保存备用； 0035 (2)RT-PCR反应 0036 反应。
21、体系： RT-PCR混合液20 L， 其中2oneStepBuffer10 L， PrimeScriptone StepEnzymeMix0.8 L， 引物CCYV-F/R各0.2 L、 MNSV-F/R各0.2 L、 MYSV-F/R各0.3 L(各 引物的使用浓度为10 M)， 模板RNA1.2 L及ddH2O6.6 L； 0037 引物序列如下： 说明书 3/7 页 5 CN 106048095 A 5 0038 CCYV-F： CGTAAGTGATCGCAATCAA， 见SEQ.ID.No.1； 0039 CCYV-R： AGTGATCACTTGACCATCTCC， 见SEQ.ID.N。
22、o.2； 0040 MNSV-F： GGCAACATTTCGTACACTGAGG， 见SEQ.ID.No.3； 0041 MNSV-R： ACCAGCACCAGAATAAGTAGCG， 见SEQ.ID.No.4； 0042 MYSV-F： GCCTGTTCCATGAATTGCACC， 见SEQ.ID.No.5； 0043 MYSV-R： AGCTTCCATTGGTTGCTGCG， 见SEQ.ID.No.6； 0044 扩增程序： 5030min， 942min； 随后进行30-35个循环， 每个循环包括9430s， 5545s， 7245s； 最后7210min； 0045 (3)电泳检测 0。
23、046 取5 LPCR产物经加入1.2的gel-red荧光染料的1.2琼脂糖凝胶在1TAE电 泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min， 电泳完成后放置于荧光成像系统下观察。 0047 (4)检测结果 0048 结果如图1所示， 在仅感染瓜类褪绿黄化病毒的甜瓜样品中可以观察到一条877bp 核酸条带； 在仅感染甜瓜坏死斑点病毒的甜瓜样品中可以观察到一条549bp核酸条带； 在仅 感染甜瓜黄化斑点病毒的甜瓜样品中可以观察到一条370bp核酸条带； 同时感染三种病毒 的样品中可以观察到三条对应大小的核酸条带。 0049 实施例3： 0050 参照实施例2检测步骤对各样品分别进行RT-PCR。
24、检测。 0051 待测样本包括： 1-健康甜瓜植株； 2-已知感染瓜类褪绿黄化病毒样品； 3-已知感染 甜瓜坏死斑点病毒样品； 4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品； 5-已知感染瓜类褪绿黄化病 毒和甜瓜坏死斑点病毒的样品； 6-已知感染瓜甜瓜坏死斑点病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样 品； 7-已知感染瓜类褪绿黄化病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样品。 0052 检测结果如图2所示， 在仅感染瓜类褪绿黄化病毒的甜瓜样品中可以观察到一条 877bp核酸条带； 在仅感染甜瓜坏死斑点病毒的甜瓜样品中可以观察到一条549bp核酸条 带； 在仅感染甜瓜黄化斑点病毒的甜瓜样品中可以观察到一条370bp核酸条带； 同时感染以。
25、 上任意两种病毒的样品中可以观察到两条对应大小的核酸条带。 0053 综上所述， 应用本发明的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、 试剂盒， 在提 取样品总RNA后， 仅需一次RT-PCR检测即可实现对3种侵染瓜类的RNA病毒的检测， 为调查鉴 定提供了较为简便的方法。 与传统RT-PCR一次仅能检测一种病毒相比， 该法既减少了成本 又节约了时间， 既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作， 是一种特异、 灵敏、 方便且经 济有效的检测方法。 说明书 4/7 页 6 CN 106048095 A 6 0054 说明书 5/7 页 7 CN 106048095 A 7 0055 说明书 6/7 页 8 CN 106048095 A 8 0056 说明书 7/7 页 9 CN 106048095 A 9 图1 说明书附图 1/2 页 10 CN 106048095 A 10 图2 说明书附图 2/2 页 11 CN 106048095 A 11 。