核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810512936.0 (22)申请日 2018.05.25 (71)申请人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238号 申请人 青岛优度生物工程有限公司 (72)发明人 刘晨光池哲王洪英于钰 丁松李生慧 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿赵青朵 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) C12Q 1/6825(2018.01) G01N 33/569(2006.01) (54)。

2、发明名称 核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿 假单胞菌的核酸适配体 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及核酸适 配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的 核酸适配体。 本发明提供的适配体具有良好的特 异性和灵敏度， 以该适配体制备的生物传感器能 够实现对铜绿假单胞菌菌的准确检测， 检测范围 从101CFU/ml到107CFU/ml， 检测限低至9CFU/ml， 在对饮料中铜绿假单胞菌的污染的检测中表现 出良好的检测能力。 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图2页 CN 108753789 A 2018.11.06 CN 108753789 A 1.特异性结合铜绿假单胞菌。

3、的核酸适配体的筛选方法， 其特征在于， 包括： 构建随机文库， SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的引物对制备次级文库； 以大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄杆菌为反筛选菌株， 以铜绿假单胞菌为正筛选菌株， 交替进行 正筛选、 反筛选共计15次； 筛选获得的ssDNA文库经测序后， 选择丰度较高， 而自由能与Kd值皆较低者， 以恶臭假 单胞菌、 粪肠球菌、 产气荚膜梭状芽胞杆菌为目标， 排除特异性较低的适配体， 筛选获得特 异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体； 所述随机文库由顺序连接的5 端固定区域、 随机区域、 3 端固定区域组成； 所述5 端固 定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.。

4、1所示， 所述3 端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。 2.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 所述筛选， 第1轮为反筛选、 第28轮 为正筛选； 第9轮为反筛选； 第1012轮为正筛选； 第1314轮为反筛选； 第15轮为正筛选。 3.根据权利要求1或2所述的筛选方法， 其特征在于， 所述筛选获得的ssDNA文库为第9、 12、 15轮筛选获得的ssDNA文库。 4.一种特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。 5.一种生物传感器， 其特征在于， 由5端修饰氨基的权利要求4所述的核酸适配体、 炭点 和氧化石墨烯制得。 6.权。

5、利要求5所述生物传感器的制备方法， 其特征在于， 包括： 以EDC和NHS活化炭点羧基后， 与5端修饰氨基的权利要求4所述的核酸适配体混合孵育 制得aptamer-CDs； 将所述aptamer-CDs与氧化石墨烯混合， 孵育制得生物传感器。 7.一种铜绿假单胞菌检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求5所述的生物传感器或权 利要求6所述制备方法制得的生物传感器。 8.铜绿假单胞菌的检测方法， 其特征在于， 将待测样品与权利要求5所述的生物传感器 或权利要求6所述制备方法制得的生物传感器混合， 3540孵育0.5h2h， 350nm的激 发波长下， 380600nm的发射波长范围内记录荧光光谱。

6、， 根据相对荧光强度判断是否存在 铜绿假单胞菌； 所述相对荧光强度(F450nm-F0450nm)/F0450nm 其中， F450nm示待测样品的荧光信号输出值， F0450nm示空白对照的荧光信号输出值。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述判断为所述相对荧光强度大于等 于零， 则样品中含有铜绿假单胞菌。 10.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述待测样品与所述生物传感器的 体积比为100:75。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108753789 A 2 核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适 配体 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领。

7、域， 尤其涉及核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假 单胞菌的核酸适配体。 背景技术 0002 核酸适配体(Aptamer)是一类通过指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment),从大容量的核酸文库中筛选获得 能与靶分子高特异性,高亲和力结合的单链或序列。 然而， 用于SELEX常规程序中的Sanger 测序由于其低通量性而使得大部分序列未被检测， 因此筛选得到的适配体不具有真实代表 性。 相反， 现代高通量测序技术(High-Throu-ghput Sequencing,HTS)能够以千兆字节为。

8、单 位给出大量的数据， 从而保证足够的序列覆盖率， 从而能够在任何一轮SELEX中准确识别 PCR产物中最丰富的序列， 为适配体的筛选开辟了一条新的途径。 但基于全细菌SELEX (Whole-bacteria SELEX,WB-SELEX)的微生物特异性适配体的研究中， 几乎没有任何应用 HTS的报道。 0003 碳点(Carbon dots,CDs)是一种荧光纳米材料， 它具有生物相容性高， 低毒性， 水 溶性高， 激发光谱宽， 量子产率适中， 耐光漂白， 易于大规模合成， 成本低等优点。 碳点是一 类新的高性能荧光剂， 并且能够赋予适体传感器更高的灵敏度。 氧化石墨烯(Graphene 。

9、oxide,GO)由于片内能量或电子转移而对许多荧光基团具有优异的荧光猝灭能力， 能解决 荧光标记的生物传感器背景信号太强的问题。 0004 铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌， 是一种普遍存在于潮湿环境中的无处不在的 机会性病原体是术后伤口感染、 褥疮、 脓肿、 化脓性中耳炎、 特别是烧伤后感染的主要病原 菌， 可导致血行散播， 发生菌血症和败血症。 世界卫生组织(WHO)将其定义为饮用水的安全 指标。 欧共体和食品法典委员会强调， 铜绿假单胞菌不能在饮用水中检测到。 然而， 基于适 体传感器的铜绿假单胞菌现场检测技术的发展并没有引起太多研究的关注， 导致这一领域 存在巨大挑战。 因此,对水域内。

10、和食品中的铜绿假单胞菌进行监控对于食品安全、 环境安全 是有重要意义的,临床上对铜绿假单胞菌进行快速诊断更是对患者的诊疗有着重要的意 义。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供核酸适配体的筛选方法及特异性结 合铜绿假单胞菌的核酸适配体， 本发明提供的筛选方法能够快速准确的筛选出高特异性的 适配体。 0006 本发明提供的特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体的筛选方法包括： 0007 构建随机文库， SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的引物对制备次级文库； 以大肠 杆菌、 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄杆菌为反筛选菌株， 以铜绿假单胞菌为正筛选菌株， 交替 说明书 1/10。

11、 页 3 CN 108753789 A 3 进行正筛选、 反筛选共计15次； 0008 筛选获得的ssDNA文库经测序后， 选择丰度较高， 而自由能与Kd值皆较低者， 以恶 臭假单胞菌、 粪肠球菌、 产气荚膜梭状芽胞杆菌为目标， 排除特异性较低的适配体， 筛选获 得特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体； 0009 所述随机文库由顺序连接的5 端固定区域、 随机区域、 3 端固定区域组成； 所述5 端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 所述3 端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0010 所述随机区域的长度为40bp。 0011 所述随机区域中各位碱基独立的选自A。

12、、 T、 C、 G。 0012 本发明中， 所述筛选， 第1轮为反筛选、 第28轮为正筛选； 第9轮为反筛选； 第10 12轮为正筛选； 第1314轮为反筛选； 第15轮为正筛选。 0013 各轮筛选条件如表1： 0014 表1各轮筛选条件 0015 说明书 2/10 页 4 CN 108753789 A 4 0016 0017 本发明中， 所述筛选获得的ssDNA文库为第9、 12、 15轮筛选获得的ssDNA文库。 0018 本发明中， 采用的大肠杆菌为ATCC 25922， 枯草芽孢杆菌为ATCC 6051和金黄色葡 萄球菌为ATCC 12600。 0019 所述测序采用高通量测序技术，。

13、 对筛选得到的文库进行全面分析， 得到更可靠， 更 具代表性的适配体。 0020 具体的， 使用Illumina Hiseq 3000平台进行测序， 产生1Gb的数据量。 0021 本发明提供了一种特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。 0022 本发明提供的适配体具有良好的亲和力， 能够特异性的识别铜绿假单胞菌， 能够 用于临床分离菌株的鉴定、 饮用水安全的监控、 饮品安全的监控等多方面的应用， 其灵敏度 较高， 检测阈值可达9CFU/mL。 0023 本发明还提供了一种生物传感器， 其由5端修饰氨基的本发明提供的核酸适配体、 炭点和氧化石墨烯制得。。

14、 0024 本发明提供的生物传感器首先利用碳量子点标记5 端进行氨基修饰的核酸适配 体， 然后通过加入氧化石墨烯来猝灭碳量子点的荧光。 传感器与待测样品孵育， 在孵育过程 说明书 3/10 页 5 CN 108753789 A 5 中适配体特异性识别目标菌体， 并使适配体上标记的碳量子点恢复荧光。 0025 本发明所述生物传感器的制备方法， 包括： 0026 以EDC和NHS活化炭点羧基后， 与5端修饰氨基的本发明提供的核酸适配体混合孵 育制得aptamer-CDs； 0027 将所述aptamer-CDs与氧化石墨烯混合， 孵育制得生物传感器。 0028 所述活化为将炭点溶液与PBS缓冲液混。

15、合， 然后加入EDC和NHS的溶液， 25超声 30min。 0029 所述炭点溶液的浓度为8 g/mL； 所述PBS缓冲液的浓度为5mM； 所述EDC和NHS的溶 液中EDC的浓度为1mg/ L， NHS的浓度为1mg/ L。 0030 EDC和NHS溶液与炭点溶液的体积比为30 L： 100 L。 0031 本发明还提供了一种铜绿假单胞菌检测试剂盒， 其包括本发明所述的生物传感器 或本发明所述制备方法制得的生物传感器。 0032 本发明还提供了一种铜绿假单胞菌的检测方法， 将待测样品与本发明所述生物传 感器混合， 3540孵育0.5h2h， 350nm的激发波长下， 380600nm的发射。

16、波长范围内 记录荧光光谱， 根据相对荧光强度判断是否存在铜绿假单胞菌； 0033 所述相对荧光强度(F450nm-F0450nm)/F0450nm； 0034 其中， F450nm示待测样品的荧光信号输出值， F0450nm示空白对照的荧光信号输出值。 0035 本发明中， 所述判断为所述相对荧光强度大于等于零， 则样品中含有铜绿假单胞 菌。 0036 本发明中， 所述待测样品与所述生物传感器的体积比为100:75。 0037 本发明中， 所述待测样品为矿泉水， 牛奶或可乐。 0038 本发明提供的铜绿假单胞菌适配体的筛选方法， 并提供了筛选到的适配体， 该适 配体具有良好的特异性和灵敏度， 。

17、以该适配体制备的生物传感器能够实现对铜绿假单胞菌 菌的准确检测， 检测范围从101CFU/ml到107CFU/ml， 检测限低至9CFU/ml， 在对饮料中铜绿假 单胞菌的污染的检测中表现出良好的检测能力。 附图说明 0039 图1示由HTS辅助的适配体筛选和鉴定(图1-A)和使用aptamer-CDs/GO系统对铜绿 假单胞菌的检测(图1-B)； 0040 图2示A)HRTEM表征ceCDs； B)ceCD的紫外可见光谱(曲线a， 黑色)， PL激发(曲线b， 蓝色)和PL发射光谱(曲线c， 红色)C)ssDNA适体候选物和ssDNA-ceCD的琼脂糖凝胶电泳； 泳 道1-5： Pa-A1至。

18、Pa-A5的ssDNA适体候选分别； 泳道6-10： Pa-A1-ceCD分别为Pa-A5-ceCD； M： DL2000DNA标记， 100bp， 250bp， 500bp， 750bp， 1000bp， 2000bp， 从下到上； D)ssDNA-ceCD的PL 发射峰的红移； 0041 图3A)ssDNA-CDs/GO系统对铜绿假单胞菌的工作原理； B)三种适体候选者ssDNA- CD/GO系统对包括铜绿假单胞菌的七种细菌的选择性； *(P0.05)， *(P0.01)： 两组间差异 显着； C)反应体系中GO浓度的优化； D)孵化时间的优化； 0042 图4荧光回复率与铜绿假单胞菌浓度。

19、之间的线性关系。 说明书 4/10 页 6 CN 108753789 A 6 具体实施方式 0043 本发明提供了核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似 的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明 的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精 神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0044 本发明采用的试材皆为普通市售品， 皆可于市场购得。 0045 下面结合实施例，。

20、 进一步阐述本发明： 0046 实施例1适配体筛选 0047 1、 设计随机文库序列： 0048 5 -TGGACCTTGCGATTGCGATTGACAGC(40nt)GCAGACATGAGTCT-CAGGAC-3 中间随机区 域为40个核苷酸， 两端分别为20个核苷酸的固定区域,序列总长为80个核苷酸。 0049 筛选所用的引物序列分别为： 0050 上游引物： TGGACCTTGCGATTGACAGC 0051 下游引物1： GTCCTGAGACTCATGTCTGC 0052 下游引物2： 5 -生物素GTCCTGAGACTCATGTCTGC 0053 上述的核酸序列均由上海生工生物有限公。

21、司完成 0054 2、 采用WB-SELEX技术筛选铜绿假单胞菌适配体 0055 铜绿假单胞菌核酸适配体的筛选过程如图1-A所示。 0056 1)筛选所用菌株及其培养与收集： 0057 使用铜绿假单胞菌ATCC 27853进行适配体筛选。 使用大肠杆菌ATCC25922， 枯草芽 孢杆菌ATCC 6051和金黄色葡萄球菌ATCC 12600进行反选择。 恶臭假单胞菌ATCC12633， 粪 肠球菌ATCC19433， 产气荚膜梭状芽孢杆菌ATCC13124以及上述反选择细菌用于评估适配体 的特异性。 所有需氧菌株在LB培养基(10g/L胰蛋白胨， 5g/L酵母提取物， 10g/L NaCl， 。

22、pH 7.2-7.4)中于37生长16小时。 将厌氧菌在巯基乙醇酸液体培养基(青岛Aikb)和厌氧瓶 (BUGBOX， Ruskinn， Bridgend， UK)中于37培养48h。 离心收集细胞， 使用前用结合缓冲液 (50mM Tris-HCl， 100mM NaCl， 5mM KCl， 1mM MgCl 2， pH7.5)洗涤两次。 0058 2)第一轮筛选过程为负筛选， 具体步骤如下： 0059 1将人工合成的的文库1.3nmol溶解于130 l2x结合缓冲液中， 95加热5min， 冰浴 10min。 0060 2取大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌液进行离心洗涤， 然后用。

23、2x结合 缓冲液进行重悬， 使每一种菌的浓度为1107CFU/ml。 0061 3将准备好的文库和菌液混合于300 l2x结合缓冲液中， 于37摇床孵育30min， 使 文库与细菌充分结合。 0062 4结合结束后， 将混合液12000r/min离心10min， 取上清作为模板进行PCR扩增并制 备次级文库。 结合到反筛细菌上的ssDNA经离心去除掉。 0063 5扩增体系： 上游引物(10 M)和下游引物(10 M)各2.5 l,高保真Q5酶0.5 l， ,模板 2 l， 5xBuffer 10 l， dNTP(10mM)1 l， 灭菌去离子水(ddH20)31.5 l。 说明书 5/10 。

24、页 7 CN 108753789 A 7 0064 扩增程序： 总循环数为30,预变性温度为98,时间持续30s， 变性温度为98,持 续时间为10s,退火温度为66,持续时间为30s,延伸温度为72,持续时间为20 0065 s。 循环结束后,最后的延伸温度为72,持续时间为2min。 0066 3)次级文库制备： 0067 1PCR扩增产物利用聚丙烯酞胺凝胶进行电泳， 然后使用索莱宝公司的PAGE胶DNA 回收试剂盒回收正确条带， 溶解于100 l磁珠buffer。 0068 2充分震荡重悬磁珠， 取50ul到1.5mlEp管中。 磁性分离1-2min， 去掉上清， 从磁性 分离器上取下E。

25、p管。 0069 3加入500ulBuffer1， 充分震荡， 磁性分离1-2min， 去上清。 重复一次。 0070 4取PCR扩增后的胶回收产物， 用Buffer1稀释至500ul， 加入磁珠重悬。 于室温摇床 结合90min。 磁性分离1-2min， 吸弃上清。 0071 5用500ulBuffer1洗涤磁珠2次。 0072 6加入100ul新配制的NaOH， 于37或者95孵育15min。 0073 7磁性分离1-2min， 取上清， 得到100ulssDNA。 0074 8加入10ul左右的1M HCL溶液调节PH至7.5左右。 0075 9用Nanodrop 2000测定ssDNA。

26、的含量。 0076 4)其他轮次筛选： 0077 从第二轮开始， 进行正常的筛选， 与反筛的区别在于当文库与目标菌株结合以后， 离心去除未结合的ssDNA， 用1x结合缓冲液洗涤菌体数次， 加入100 lddH2O重悬菌体， 95 加热10min， 12000r/min离心10min， 取上清液作为模板进行PCR扩增并制备次级文库。 筛选 总共进行15轮， 各轮的筛选条件见表1。 0078 表1各轮筛选条件 说明书 6/10 页 8 CN 108753789 A 8 0079 0080 a在第一轮反应体系中加入各反选择菌(大肠杆菌ATCC 25922， 枯草芽孢杆菌 ATCC6051和金黄色葡。

27、萄球菌ATCC 12600)的体积。 体积等于50 l， 每个反选菌培养物的细胞 密度为1107CFU/ml。 0081 b在其他轮次的反选中， 在反应体系中加入每种反选择细菌(大肠杆菌ATCC 25922， 枯草芽孢杆菌ATCC 6051和金黄色葡萄球菌ATCC 12600)的体积。 体积等于100 l， 每 个反选菌培养物的细胞密度为1107CFU/ml。 0082 3、 候选适配体的鉴定 0083 HTS对第9,12和15轮的ssDNA文库进行了测序分析。 从上一轮产生的PCR产物中富 集2 g的ssDNA， 由Novogene Co.Ltd。 (Beijing， China)使用Ill。

28、umina Hiseq 3000平台进行 测序以产生1Gb的数据量。 统计每一条序列出现的次数， 从而揭示ssDNA库内每个序列的丰 度。 选择丰度排在前五位的ssDNA作为适配体候选者。 使用DNAMAN软件分析适体候选者的自 由能， 并通过Mfold程序(http:/mfold.rna.albany.edu/？ qmfold)预测适体候选者的二 级结构)。 说明书 7/10 页 9 CN 108753789 A 9 0084 表2.HTS法鉴定铜绿假单胞菌适体候选序列、 自由能和平衡常数. 0085 0086 使用水热法合成CD。 为了制备aptamer-CDs纳米缀合物， 将100 L 。

29、CD溶液(8 g/mL) 在5mM PBS缓冲液中用30 l N-(3-二甲基氨基丙基)-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(1mg/ l)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1mg/ l)活化羧基， 在25下进行超声处理30min。 之后， 将10 L超声处理过的混合物加入到溶于5mM PBS缓冲液中浓度为3.3 M的90 L修饰氨基的候选 适配体中， 在25孵育2小时。 使用HRTEM和琼脂糖凝胶电泳， UV-vis扫描和荧光光谱扫描等 方法表征合成的CD和aptamer-CD。 结果如图2所示。 利用合成的aptamer-ceCds可以确定候 选适配体的Kd值。 如表1所示。 0087 为了鉴定。

30、出最佳的适配体， 基于合成的aptamer-ceCD建立了aptamer-ceCDs/GO系 统。 如上所述， 本研究采用 “开-关” 策略用aptamer-ceCDs/GO系统检测铜绿假单胞菌。 如图 3-A所示， 在没有氧化石墨烯(GO)的情况下， aptamer-ceCD的荧光是明显的(图3-A， 曲线a， 说明书 8/10 页 10 CN 108753789 A 10 蓝色)。 当它们混合在一起时， 通过 - 堆积相互作用将aptamer-ceCDs吸附到GO表面上， 并 且GO通过FRET将aptamer-ceCDs的荧光猝灭。 通过这种操作， 背景荧光信号减少到最小(图 3-A， 。

31、曲线c， 黑色)。 将铜绿假单胞菌与aptamer-CDs/GO系统共同孵育后， aptamer-CDs优先 与铜绿假单胞菌结合， aptamer-ceCDs与GO之间的 - 堆积作用被中断。 通过这种方式， 从GO 表面释放aptamer-CD并恢复荧光(图3-A， 曲线b， 红色)。 因此， 铜绿假单胞菌就像一个打开 荧光的 “开关” 。 通过读取荧光的恢复， 可以识别铜绿假单胞菌的存在。 这是saptamer-CDs/ GO系统检测铜绿假单胞菌的工作原理。 0088 经过鉴定， Pa-A1对铜绿假单胞菌的结合不受其他菌种的影响， 具有良好的特异 性， 而Pa-A2Pa-A5则对其他菌种存。

32、在不同程度的结合， 特异性较差。 0089 实施例2检测铜绿假单胞菌 0090 1、 首先合成aptamer-CD/GO生物传感器 0091 使用水热法合成CD， 然后将100 L CD溶液(8 g/mL)在5mM PBS缓冲液中用30 l N- (3-二甲基氨基丙基)-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(1mg/ l)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (1mg/ l)活化羧基， 在25下进行超声处理30min。 之后， 将10 L超声处理过的混合物加入 到溶于5mM PBS缓冲液中浓度为3.3 M的90 L修饰氨基的候选适配体中， 在25孵育2小时， 制得aptamer-CD。 将50 L GO(。

33、1mg/mL)加入到25 L前述aptamer-CDs溶液(100nM)中以猝灭 荧光， 然后将混合物在37孵育1小时， 制得aptamer-CD/GO生物传感器。 0092 2、 铜绿假单胞菌的检测 0093 将100 L铜绿假单胞菌(1107CFU/ml)加入反应体系并在37下孵育1小时。 不添 加铜绿假单胞菌细胞的反应作为对照。 在350nm的激发波长下， 在380-600nm的发射波长范 围内记录aptamer-CDs/GO体系的荧光光谱。 根据相对荧光强度(F450nm-F0450nm)/F0450nm计 算荧光信号输出值， 其中F450nm和F0450nm分别表示在存在和不存在铜绿。

34、假单胞菌的情况下， 在350nm激发波长时制备的适体传感器的荧光强度。 当(F450nm-F0450nm)/F0450nm0则表明存 在铜绿假单胞菌。 0094 本方案， 使用aptamer-CDs/GO系统对7种不同细菌进行检测。 测试的细菌菌株是铜 绿假单胞菌、 恶臭假单胞菌， 粪肠球菌， 产气荚膜梭菌， 大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌和金黄色葡 萄球菌。 结果表明， 该生物传感器对铜绿假单胞菌能够准确识别， 而对其他细菌的信号则较 差， 不产生相对荧光强度的变化， 准确度可达100。 0095 3、 灵敏度检测 0096 为了评估aptamer-CDs/GO系统的灵敏度， 按照如上所述的方法进。

35、行了针对一系列 不同浓度的铜绿假单胞菌的检测， 其范围从10CFU/ml至1107CFU/ml。 在优化条件下， 测定 了不同浓度铜绿假单胞菌存在下所制备的Pa-A1-ceCDs/GO体系的荧光恢复率。 如图4所示， 适体传感器对铜绿假单胞菌检测的浓度范围为10108CFU/ml， 表现出良好的响应性。 荧光 恢复率与铜绿假单胞菌浓度呈线性相关， 标准曲线为(F-F0)/F00.0582logC(CFU/ml)- 0.057， 相关系数为0.993(F和F0分别表示在存在和不存在铜绿假单胞菌的情况下生物传感 器的荧光强度)。 根据该方程， 得到的检测限(LOD)为9CFU/ml 0097 4、。

36、 实际样品分析 0098 从超市随机购买矿泉水(雀巢(中国)有限公司)， 牛奶(伊利有限公司， 中国)和可 口可乐(可口可乐(中国)有限公司)进行aptamer-CD/GO系统对实际样品的应用评估。 按照 说明书 9/10 页 11 CN 108753789 A 11 上述方法准备aptamer-CD/GO系统。 样品被不同浓度的铜绿假单胞菌人为地污染， 该浓度从 101103CFU/ml， 超出视觉识别范围。 受污染的样品也采用相同的程序对aptamer-CD/GO系 统进行处理。 使用灭菌后的蒸馏水作为阴性对照。 0099 从表3的结果可以发现， 使用适体传感器系统检测的细菌浓度接近于通过。

37、矿物质 水和牛奶中的显微计数获得的细胞浓度， 表明中性和高蛋白质条件对适体传感器系统的工 作没有明显的副作用。 但是可口可乐的检测效果受到了很大限制。 这可能是由于可口可乐 的酸性pH环境， 影响了Aptamer的正常折叠的正常功能 0100 表3.实际样品中铜绿假单胞菌的检测结果 0101 0102 RSD:Relative standard deviation(Lian et al.,2015). 0103 结果表明， 本发明提供的方法可实现对饮品中铜绿假单胞菌的准确检测。 0104 以上仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明原理的前提。

38、下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。 说明书 10/10 页 12 CN 108753789 A 12 序列表 中国海洋大学； 青岛优度生物工程有限公司 核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体 MP1804060 5 SIPOSequenceListing 1.0 1 26 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 tggaccttgc gattgcgatt gacagc 26 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 gcagacatga gtctcaggac 20 3 20 DN。

39、A 人工序列(Artificial Sequence) 3 tggaccttgc gattgacagc 20 4 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 gtcctgagac tcatgtctgc 20 5 84 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 tggaccttgc gattgacagc agacatgagt ctcaggacgt gaccgctgga ccttgcgatt 60 gacagcagac atgagtctca ggac 84 序列表 1/1 页 13 CN 108753789 A 13 图1 图2 说明书附图 1/2 页 14 CN 108753789 A 14 图3 图4 说明书附图 2/2 页 15 CN 108753789 A 15 。