柱溴化法制备高纯度紫杉醇的工艺 【技术领域】
本发明涉及一种紫杉醇工艺，具体为利用柱溴化法制备高纯度紫杉醇的工艺。背景技术
Wall等1971年首次报道从红豆杉的树皮中分离到紫杉醇，并确认其具有抗癌活性(J.Am.Chem.Soc.，93，2325，1971)。1983年美国国立癌症研究所(NCI)报告紫杉醇对人乳腺癌、结肠癌等实体癌具有抗肿瘤作用。1993年，美国FDA批准该药治疗对常规化疗，包括卵巢癌和乳腺癌，对肺癌及其它癌症的治疗进行临床应用。紫杉醇被认为是近三十年来天然抗癌药物研究领域最重大的发现，为广大癌症患者带来了福音。
对于紫杉醇的类似物三尖杉宁碱(cephalomannine)的研究，最初是从要使它与紫杉醇完全分离的角度入手的。三尖杉宁碱最初是Powell等(J.Org.Chem.Soc.，46，1469，1976)从三尖杉中分离得到，后来Miller等(J.Nat.Prod.，55，912，1992)发现西藏红豆杉也含有这种物质。在不同的红豆杉物种中或在植物体内的不同部分，紫杉醇和三尖杉宁碱的含量和比率有所不同，大量的测定表明紫杉醇的含量在0.001-0.08％左右，而三尖杉宁碱的含量达0.001-0.22％(J.Nat.Prod.，55，912，1992)。三尖杉宁碱结构通过甲醇降解和X-晶体衍射方法加以确定。紫杉醇(a)与三尖杉宁碱(b)的结构如下所示：
(a) (b)
三尖杉宁碱与紫杉醇结构相似，唯一的区别在于它的C-13侧链末端是丁烯基而不是紫杉醇结构式中的苯环，用柱层析的方法，常压和低压层析得到紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物，但很难再用常规的柱层析把紫杉醇完全分离出来。
Miller等(US4206221，1980)采用逆流分配色谱法(CCD)、薄层色谱(TLC)、柱色谱、高效液相色谱(HPLC)或将这些方法联用，分离与纯化三尖杉宁碱。主要采用了两步连续的CCD和一步HPLC在硅胶柱上实现三尖杉宁碱的分离与纯化。
Rao(US5475120，1995)从天然植物紫杉烷类萃取物中分离紫杉醇与三尖杉宁碱。他将这种萃取液用反相色谱处理，紫杉醇与三尖杉宁碱等紫杉烷类被吸附在吸附剂上，再用洗脱剂洗脱，不过分离不完全。
常规的柱层析分离方法，要经过多步才能达到紫杉醇与三尖杉宁碱的分离，并要利用HPLC、半制备色谱等设备。这样往往分离过程繁琐、得率低、成本高，无法进行大规模生产。
Kingston等(J.Nat.Prod.，55，259，1992)用OsO4处理紫杉醇与三尖杉宁碱的混和物，发现OsO4能选择性地氧化三尖杉宁碱C-13侧链末端地双键，使之形成二元醇，而紫杉醇却不受影响。然而OsO4毒性太大，价格昂贵，不适用于实际生产。
Murray等(US5334732，1994)用含1～10％O3的气体氧化三尖杉宁碱中的烯键，而对紫杉醇却不起反应。反应混和物经过硅胶柱层析可以使其中的紫杉醇得到有效的纯化。之后，Murray对上述方法又进行了进一步的改善(US5364747，1994)，在经O3氧化后处理，再加入吉拉德氏酞肼-AcOH的混合物，使得被O3氧化后的产物转变成中间体-吉拉德氏腙复合物，最后通过选择性沉淀或乙酸乙酯-水等萃取把紫杉醇分离出来。
用OsO4氧化或O3氧化后三尖杉宁碱被氧化成多个小分子物质，使其与紫杉醇在正相条件下易于分离。然而三尖杉宁碱本身是一种较好的药物，对于治疗白血病，配合地塞米松对粒细胞性白血病疗效较好。氧化法易于紫杉醇的分离提纯，但大量有用的伴生物被浪费了。对三尖杉宁碱侧链上的双键进行卤素加成，使其极性变小，易于其和紫杉醇的正相分离，既可以得到纯度较高的紫杉醇，又可以获取三尖杉宁碱的卤代产物，使这一天然药物得以综合利用。
1996年Kingston等(J.Nat.Prod.，59，167，1996)用液溴或吡啶鎓过溴化物、四丁基三溴铵作为氧化剂，室温下在氯仿中反应，可以使紫杉醇和三尖杉宁碱混合物中的三尖杉宁碱转化为2”，3”-二溴化三尖杉宁碱，而紫杉醇却不受影响。反应混合物用二氯甲烷稀释后，依次用10％的Na2S2O3水溶液、蒸馏水和盐水洗涤，经过硅胶层析柱纯化，从而可以分别得到纯度高达95％的紫杉醇以及2”，3”-二溴化三尖杉宁碱。
潘德伊(Pandy)等在公开专利申请书(CN 1182424A，1998；US5807888，1998)中用0.01-0.1M的溴溶液对紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物的氯代溶液(10克粗提物溶于1000ml氯代溶液中)进行溴化，产物经Na2S2O3水溶液、NaHCO3水溶液洗涤后蒸干，加少量二氯甲烷溶解以丙酮-CH2Cl2混合物(1∶9)为正相流动相用硅胶层析柱纯化。
以上几种溴化方法，原料与溴的浓度较低，反应时间过长，增加了反应方向的不可控制性，并且反应产物在上柱前要经过多步处理，容易造成产物损失。同时这些处理过程在产物中引入Na2S2O3、NaHCO3、NaCl等盐的杂质离子，影响紫杉醇的分离纯化并会给最终产物带来新的杂质。
谈增毅在公开专利申请书(CN1340505A，2002)中对于含量50％的紫杉醇半成品，用少量氯仿溶解，于硅胶柱上样，待样液渗入硅胶后，加入定量的2％溴氯仿，该溶液在氯仿的洗脱下平行下移，3-5分钟穿越样品，待溴液流出后，以1-2％的乙醇氯仿液洗脱。该方法中溴液穿越样品的时间，很大程度上受硅胶柱的填料情况的影响，且柱内样品与溴的反应时间并不完全一致，容易造成三尖杉宁碱没有完全反应或产物被溴化的情况。溴液在穿越样品时反应的时间、温度难以确定。以上这些问题增加了反应的不确定性。发明内容
本发明的目的是提供反应速度快，溴的利用率高，操作简单，适合于工业化生产的制备高纯度紫杉醇的工艺。
本发明所提出的制备高纯度紫杉醇的工艺，是以液溴作为氧化剂直接加入到质量浓度为20-60％的紫杉醇粗提物的溶液中，以加快反应速度、提高溴的利用率，能够通过一次性反应处理大量原料；本发明的反应产物直接上柱，使操作更为简单，这一发明使溴化法分离紫杉醇与三尖杉宁碱的工业化得以实现。
本发明的具体步骤如下：
1.原料溶解：将质量浓度为20～60％、主要杂质为三尖杉宁碱的紫杉醇的红豆杉粗提物溶解于氯代溶液中。该氯代溶剂可为CCl4、CHCl3、C2H4Cl2或CH2Cl2之一种；
2.溴化反应：将液溴加入上述溶液中，控制三尖杉宁碱于溴的摩尔比为1∶1.5-1∶4，反应温度控制在40℃至0℃，反应时间5～30分钟；
3.硅胶层析柱分离：常压玻璃硅胶层析柱，以硅胶填充，色谱柱高度为30～2800mm，色谱柱直径2～80cm，硅胶粒径为100～200目，红豆杉粗提物与硅胶质量比为1∶8～1∶50；
4.淋洗：反应液上柱后，先以CCl4淋洗，带走过量的溴，再以三氯甲烷或1∶1乙酸乙酯-正己烷溶液淋洗，收集馏分，对各个馏分进行检测，将相似的馏分合并在一起。
本发明工艺中，经硅胶层析分离得到的馏分，经HPLC检测，其纯度为50％以上的紫杉醇，集中收集减压蒸馏，经过二次重结晶，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。对于紫杉醇含量低于50％高于35％的馏分，集中收集，经过蒸发、浓缩，再经硅胶层析柱分离；然后对分离得的馏分，以正相流动相为1∶1乙酸乙酯-正己烷溶液或三氯甲烷淋洗。对于二溴化三尖杉宁碱非对应异构体的纯度为95％以上的一次柱层析馏分以及二次柱层析所得馏分集中收集，得到98％以上的二溴代三尖杉宁碱非对应异构体产物。
本发明工艺中，将含高浓度紫杉醇的固体溶于甲醇中，在该体系中加入水，使紫杉醇结晶析出。
本发明工艺中，淋洗液经过蒸发、浓缩后集中，精馏后得到的正己烷、乙酸乙酯、丙酮以及氯仿等溶剂可反复使用。含溴的非极性流动相CCl4可以用Na2S2O3水溶液还原后，经蒸馏，重复使用。
本发明对于制备高纯度紫杉醇，工艺简单，生产投资小、成本低廉、得率高，有利于大规模生产。试剂溶剂可以回收，循环使用，有利于环境保护。
所用的主要设备：
1)反相分析型高效液相色谱。美国惠普公司的Agilent 1100系列液相色谱，包括溶剂箱、四元梯度泵、真空脱气机、标准微量自动进样器、恒温柱温箱、可变波长检测器(VWD)。赛洋1.2G台式计算机(Agilent ChemStation 4.09.01色谱工作站)。日本SHISEIDO公司CAPCELL PAK C18分析色谱柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。柱温为35℃；使用HPLC级甲醇-乙腈-水(体积比30∶30∶40)的流动相；流速为1.0ml/min；紫外检测波长227nm；每次进样量为10μl，柱压101～103bar。
2)正相分析型高效液相色谱。美国Beckman公司分析型HPLC，主要包括110B高效液相色谱二元泵；168型PDA紫外检测器；GOLD SYSTEM色谱工作站，486台式计算机。以及美国Fisher公司310/H型超声波清洗器，上海In-TECH技术研究所的In-180恒温柱温箱，25μl微量进样针筒。淮阴汉邦科技有限公司Chrommatorex SiO2高效液相色谱柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。柱温32℃；使用分析纯1∶1正己烷-乙酸乙酯(无水Na2SO4脱水)的流动相(流动相经脱气)；流速为1.0ml/min；检测波长254nm(避开溶剂吸收)；每次进样量10μl，用PDA紫外检测器在190～290nm波段范围内扫描。
3)LC/MS(液质联用)。Thermo Finnigan公司的LCQ ADVANTAGE MS SYSTERM，包括TSP高效液相色谱系统和LCQ ADVANTAGE质谱检测仪，Xcalibur 1.0.01，MetaChem公司的Taxsil-3柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。流动相为ACN∶H2O(体积比49∶51)，流速0.8ml/min，柱箱温度40℃，检测波长为227nm。质谱(MS)检测条件：ESI(电喷雾化学解离)，全范围扫描150-2000，壳气70单位，辅助气15单位，源电压6KV，加热毛细管温度250℃，蒸发器温度465℃。
4)FTIR(傅立叶红外光谱检测)。NICOLET Avatar 360型FT-IR仪，ESP软件，DigitalPII电子计算机控制。
其他仪器有上海申生科技有限公司R501型旋转蒸发仪；河南省巩义市英峪豫华仪器厂SHZ-C型循环水式多用真空泵；2xZ-1型旋片式真空泵；德国Sartorius BP211D型精密电子天平；2K-82A型真空干燥箱；上海司乐仪器厂85-1磁力搅拌器；上海市实验仪器总厂ZK-82A型真空干燥箱；美国Millipore公司的Milli-Q水纯化系统。附图说明
图1为三尖杉宁碱与溴反应过程图示。
图2为两种2”，3”-二溴化三尖杉宁碱非对应异构体的质谱图。其中
图2(A)为三尖杉宁碱溴化产物双峰中前一个的APCI-MS谱，
图2(B)为三尖杉宁碱溴化产物双峰中后一个的APCI-MS谱。
图3为实施例3中各馏分的的HPLC谱图(自上而下依次为原料、第54、60、68、78号馏分)。
a三尖杉宁碱；b紫杉醇；c 7-表-10去乙酰基紫杉醇；
d2”，3”-二溴化三尖杉宁碱(两种非对应异构体)。
图4为实施例3中编号为II-VI号馏分的HPLC谱图。
b紫杉醇；c7-表-10去乙酰基紫杉醇；
d2”，3”-二溴化三尖杉宁碱(两种非对应异构体)。
图5为实施例4中各馏分集中的HPLC谱图。
b紫杉醇；c7-表-10去乙酰基紫杉醇；
d2”，3”-二溴化三尖杉宁碱(两种非对应异构体)。具体实施方式实施例1：
100-200目的硅胶在110℃烘2小时，取25克装入20×300mm2的玻璃层析柱中，填实。称取1.000克紫杉醇粗提物(以HPLC检测，测得原料中各物质的峰面积含量为：紫杉醇37.88％，三尖杉宁碱43.84％，7-表-10-去乙酰基紫杉醇4.83％)，加5ml氯仿溶解。在冰水浴、避光、连续搅拌状态下，加入0.08ml液溴，反应5min后，将反应液倒入已装好的硅胶柱中。先用80mlCCl4淋洗，带走反应中过量的溴，再用氯仿试剂洗脱。收集的各部分馏分用HPLC检测，(色谱柱填料为C18)，根据检测情况，将紫杉醇含量85％以上的馏分集中收集，浓缩、蒸干、称重，得到0.3181克白色固体。对其进行HPLC检测，其中紫杉醇含量达85.60％。将2”，3”-二溴化三尖杉宁碱含量90％以上的各个馏分集中收集，浓缩、蒸干、称重，得到0.2555克浅黄色固体。对其进行HPLC检测，其中2”，3”-二溴化三尖杉宁碱含量达97.60％。对于紫杉醇和2”，3”-二溴化三尖杉宁碱的混合物集中收集，浓缩、蒸干、称重，得到0.2645克浅黄色固体。对其进行HPLC检测，其中紫杉醇含量为34.91％，2”，3”-二溴化三尖杉宁碱含量达51.63％。根据计算，该工艺过程中紫杉醇的得率为96.15％。实施例2：
称取0.9976克紫杉醇粗提物(以HPLC检测，测得原料中各物质的峰面积含量为：紫杉醇37.88％，三尖杉宁碱43.84％，7-表-10-去乙酰基紫杉醇4.83％)，加5ml氯仿溶解。在冰水浴、避光、连续搅拌状态下，加入0.08ml液溴，反应5min后，将反应液倒入已装好的硅胶柱中。先用80mlCCl4淋洗，带走反应中过量的溴，再用500ml的1∶1乙酸乙酯和正己烷溶液淋洗，最后用100ml乙酸乙酯试剂将其他杂质洗脱下来。对各部分馏分进行HPLC检测，根据检测情况，将85％以上紫杉醇馏分、90％以上2”，3”-二溴化三尖杉宁碱馏分、以及紫杉醇和2”，3”-二溴化三尖杉宁碱混合馏分分别收集，这三部分溶液经浓缩、蒸干、称重，分别得到85.33％的紫杉醇产物0.2916克，98.05％的2”，3”-二溴化三尖杉宁碱产物0.3904克，以及59.15％的紫杉醇和25.89％的2”，3”-二溴化三尖杉宁碱混合产物0.1548克。根据计算，该过程中紫杉醇的得率为90.14％。
将紫杉醇和2”，3”-二溴化三尖杉宁碱混合产物用适量1∶1乙酸乙酯和正己烷溶液溶解，用制备型高效液相色谱进行再次分离，分别收集得到紫杉醇含量达99％以及2”，3”-二溴化三尖杉宁碱含量达99％的两部分馏分。实施例3：
取2700克100-200目的干燥硅胶，填入100×1000mm2的玻璃层析柱中，填料高度为800mm。称取54.13克紫杉醇粗提物(以HPLC检测，测得原料中各物质的峰面积含量为：紫杉醇42.14％，三尖杉宁碱42.61％，7-表-10-去乙酰基紫杉醇7.16％)。经过外标法定量确定其中紫杉醇的实际质量百分含量为31.5％，即原料中的紫杉醇有17.05克。加200ml氯仿溶解。在冰水浴、避光、连续搅拌状态下，加入3.5ml液溴，反应5min后，将反应液倒入已装好的硅胶柱中。先用3L的CCl4淋洗，带走反应中过量的溴，再用50L的1∶1乙酸乙酯和正己烷溶液淋洗，最后用纯乙酸乙酯试剂将其他极性较大的杂质洗脱下来。以上淋洗液，用500ml试剂瓶收集，对由1∶1乙酸乙酯和正己烷溶液淋洗产生的洗脱液依次编号，以1-80的馏分标记。对这些馏分进行TLC检测，确定反应产物大致的出峰顺序、范围。经TLC检测后，在对编号为39至78的馏分进行HPLC检测。依次对每一馏分取0.5ml，分别放入相应的HPLC进样瓶中，待进样瓶中所取溶液挥发干后，每瓶加入1ml色谱纯度的甲醇，将瓶中物质完全溶解后，进行反相HPLC检测，得到39号至79号馏分的HPLC谱图(如图3所示)。
从这些选取谱图中可以看到，反应物经溴化、过柱后，产物的相对出峰顺序。三尖杉宁碱的二溴化物(2”，3”-dibromocephalomannine)与另一种杂质(该检测条件下保留时间是22min)最先出现，7-表-10-去乙酰基紫杉醇(7-epi-10-deacetyltaxol)紧跟着三尖杉宁碱的二溴代物出现，所以两者很难分离。以上两者几乎出完时，紫杉醇开始出现。自第66号馏分后可得到高纯度紫杉醇。
根据HPLC谱图，将39号至78号的馏分分成：39号至44号、45号至50号、51号至57号、58号至65号、66号至72号、73号至78号，这六个部分，分别合并收集，依次定以编号I、II、III、IV、V、VI。将这六部分合并液分别低压恒温蒸干，称重，定量取样溶解，经反相HPLC检测，
利用已有的紫杉醇标准曲线以外标法，确定各组分中紫杉醇的确实含量，所得数据如表1所示。第II、III、IV、V、VI号合并组分的HPLC检测图谱见图4。
表1实施例3中各合并物的紫杉醇含量合并产物序号IIIIIIIVVVI馏分序号39-4445-5051-5758-6566-7273-79总质量(克)0.985.6618.0713.5810.392.52Taxol含量(％)--0.5351.8571.1953.34Taxol质量(克)--0.107.047.401.34所有馏分总产物质量51.20克所有馏分总紫杉醇质量15.92克紫杉醇一次得率(％)93.37实施例4：
取2500克100-200目干燥的分析纯硅胶，填入120×1000mm2的玻璃层析柱中，填料高度为500mm。称取100.00克紫杉醇粗提物(其中紫杉醇的实际质量百分含量为50.01％)。加500ml氯仿溶解。在冰水浴、避光、连续搅拌状态下，加入5ml液溴，反应5min后，将反应液倒入已装好的硅胶柱中。先用2.5L的CCl4淋洗，带走反应中过量的溴，再用40L的1∶9丙酮-氯仿溶液淋洗。以上淋洗液，均用500ml试剂瓶收集，并依次编号，以1-85的馏分标记。对这些馏分进行HPLC检测，色谱柱为Taxil-3，确定反应产物的出峰顺序、范围。
根据HPLC的检测结果，得到如下含有三尖杉宁碱的二溴化物及紫杉醇的各个馏分集中的谱图，分别以编号I、II、III、IV、V、VI、VII等表示(如图5所示)，各个馏分的成分、含量如表2所示。
表2实施例4中各合并物的紫杉醇含量合并序号IIIIIIIVVVIVII八馏分序号7-148-91011-1213-3940-5455-6465-85质量(克)3.2717.459.8014.1144.466.582.991.01Taxol含量(％)-0.559.0254.8972.4552.9426.132.08Taxol质量(克)-0.100.887.7532.213.480.780.02所有馏分总产物质量99.67克所有馏分总紫杉醇质量45.22克紫杉醇一次得率(％)90.42实施例5：
按实例1～4处理后含紫杉醇超过50％的样品集中，称取100克(实际率为56.7％)，溶于300ml甲醇中，在搅拌状态下缓缓加入二次蒸馏水，有白色晶体析出。加入大约600ml二次蒸馏水后，搅拌均匀，在通风厨放置2小时，转移至冰箱中，在4℃左右放置48小时，有大量晶体析出。过滤后的滤饼溶解后二次重结晶，得到101.36克纯度为99.6％紫杉醇产品，母液合并重新上样于正相硅胶柱分离。所得高纯度紫杉醇与标准对照品的NMR、MS、FT-IR、HPLC保留时间、比旋光度、熔点等一致。