《用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组、试剂盒及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组、试剂盒及其应用.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201611207629.9 (22)申请日 2016.12.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106755416 A (43)申请公布日 2017.05.31 (73)专利权人 四川农业大学 地址 611130 四川省成都市温江区惠民路 211号 (72)发明人 常小丽杨文钰付瑶何宛芹 杨继芝武晓玲雍太文尚静 (74)专利代理机构 北京元本知识产权代理事务 所 11308 代理人 秦力军 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C1。
2、2Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (56)对比文件 CN 1657627 A,2005.08.24, CN 101440402 A,2009.05.27, CN 103409532 A,2013.11.27, 审查员 王溯铭 (54)发明名称 用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异 性引物组、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提供一种用于分析大豆镰孢根腐真 菌多样性的特异性引物组、 试剂盒及其应用， 涉 及生物检测领域， 其由： 具有如SEQIDNO.1所示 的第一正向引物；。
3、 具有如SEQIDNO.2所示的第 二正向引物； 具有如SEQIDNO.3所示的第三正 向引物； 具有如SEQIDNO.4所示的第四正向引 物中的一种或多种， 以及具有如SEQIDNO.5所 示的共用反向引物组成。 将本发明的特异性引物 应用于由镰孢菌引起的大豆根腐病的检测可以 快速分辨出引起大豆根腐病的镰孢菌， 并根据检 测结果所显示的条带大小确定镰孢菌的种类， 从 而为大豆根腐病的综合防治提供依据。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图3页 CN 106755416 B 2018.10.30 CN 106755416 B 1.用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组， 其特征在。
4、于， 其由： 如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物； 如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物； 如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物； 如SEQ ID NO.4所示的第四正向引物中的一种或多种， 以及 如SEQ ID NO.5所示的共用反向引物组成。 2.一种检测大豆镰孢根腐真菌的试剂盒， 其特征在于， 其具有权利要求1所述特异性引 物组， 其中， 所述特异性引物组由： 如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物； 如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物； 如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物； 如SEQ ID NO.4所示的第四正向引物中的一种或多种， 以及 如SE。
5、Q ID NO.5所示的共用反向引物组成。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 使用其进行PCR的条件为： 94预变性 3min； 94变性30s， 5256退火30s， 72延伸30s， 循环2540次； 72终延伸5min。 4.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 利用其扩增出的条带、 条带数量和条带大 小就可以判断大豆镰孢根腐真菌的数量和种类。 5.一种检测大豆根腐病的方法， 其特征在于， 使用权利要求1所述的特异性引物组对待 测样本的DNA进行多重PCR检测， 若琼脂凝胶电泳出现条带， 则判断待测样本发生了该镰孢 菌引起的根腐病。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在。
6、于， 所述使用权利要求1所述的特异性引物组对 待测样本的DNA进行多重PCR检测的反应体系为： 体系总量1050 L， 包括待测样本的DNA溶 液2.04.0 L、 正向引物1.54.0 L、 反向引物1.54.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液 5.025.0 L、 超纯水013.0 L。 7.如权利要求6所述方法， 其特征在于， 所述使用权利要求1所述的特异性引物组对待 测样本的DNA进行多重PCR检测的反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 5256退 火30s， 72延伸3s， 循环2540次； 72终延伸5min。 8.一种检测大豆根腐病的方法， 其特征。
7、在于， 使用权利要求2所述的试剂盒对待测样本 的DNA进行检测， 若琼脂凝胶电泳出现条带， 则判断待测样本发生了大豆链孢根腐病， 并根 据条带的大小和数量， 判断病原菌的数量与种类， 从而有针对性的防治大豆根腐病。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述使用权利要求2所述的试剂盒对待测样 本的DNA进行检测的反应体系为： 体系总量1050 L， 包括待测样本的DNA溶液2.04.0 L、 正向引物1.54.0 L、 反向引物1.54.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液5.025.0 L、 超纯水013.0 L。 10.如权利要求9所述方法， 其特征在于， 所述使用权利。
8、要求2所述的试剂盒对待测样本 的DNA进行检测的反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 5256退火30s， 72延伸 3s， 循环2540次； 72终延伸5min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106755416 B 2 用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组、 试剂盒 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物检测领域， 尤其涉及一种分析大豆镰孢根腐真菌多样性的检测。 背景技术 0002 大豆根腐病(Soybean root rot)是大豆生产中分布范围广、 危害严重、 防治较为 困难的一种真菌性土传病害。 大豆根腐病致病菌群体复杂多样， 镰孢菌是其重要的致病类。
9、 群之一。 国内外已报道的主要有腐皮镰孢菌(Fusarium solani) 、 尖孢镰孢菌 (F.oxysporum)， 禾谷镰孢菌(F.graminearum)、 木贼镰孢菌(F.equiseti)、 层生镰孢菌 (F.proliferatum)、 假禾谷镰孢菌(F.pseudoproliferatum)、 燕麦镰孢菌(F.avenaceum)、 半裸镰孢菌(F.semitectum)、 F.tricinctum和F.armeniacum等。 我国西南地区主要以腐皮 镰孢菌(F.solani)、 尖孢镰孢菌(F.oxysporum)， 禾谷镰孢菌(F.graminearum)和木贼镰孢 菌。
10、(F.equiseti)为大豆根腐病主要致病镰孢菌。 由于引起大豆根腐病的病原菌成分复杂， 尤其是镰孢菌的种类繁多， 为实现大豆根腐病的快速检测和有效防治， 必须首先对大豆根 腐病的致病菌， 尤其是主要致病镰孢菌的多样性进行分析。 0003 传统的镰孢菌鉴定主要依据其形态培养特征及致病性检测， 不仅费时、 费力、 成本 高、 准确性差， 而且检测者需具备较好的植物病理学专业背景。 基于DNA序列的PCR扩增技术 为镰孢菌的鉴定提供了较大帮助。 据文献报道， PCR-RFLP、 LAMP技术、 RFLP-DGGP等PCR技术 先后被应用于大豆根腐病病原菌的检测。 以rDNA-ITS序列为代表的多。
11、个DNA分子标记被用 到镰孢菌检测中， 但rDNA-ITS在镰孢菌属内种间或复合种间相对保守， 变异位点较少， 不能 很好地将各种致病镰孢菌分开， 例如O Donnell等(2015)在研究用于镰孢菌属内种间及复 合种内群体的多种DNA分子标记时， 亦发现rDNA-ITS在属内种间相对保守， 不适合镰孢菌的 群体鉴定。 而且目前方法多涉及单一镰孢菌种的鉴定或检测， 考虑到大豆根腐病致病镰孢 菌的群体多样性， 目前亟需开发一系列用于镰孢菌多样性检测的分子技术。 0004 申请号为201310353895.2公开了一种用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异 性引物， 该申请仅利用一个特异性引物实现对。
12、多种致病菌的分析和检测， 其原理是基于酵 母基因组中18sRNA基因设计一对特异引物， 依据扩增片段大小不同达到区分多种真菌的目 的， 但是由于该基因序列相对保守， 序列之间差异较小的， 虽然该申请检测了11个相关真 菌， 但是不排除环境样本中其他真菌亦可被扩增出相同的条带， 从而无法确定是否存在相 应的致病菌， 并且， 由于该体系需要进行普通PCR和DGGE分层两个步骤， 因此其检测过程耗 时长达12h左右。 发明内容 0005 为解决现有技术存在的技术问题， 本发明提供一种方法简单， 检测时间短的分析 大豆镰孢根腐病真菌多样性的特异性引物组， 以及将其应用于大豆根腐病检测的方法， 利 用本。
13、发明提供的特异性引物组可以准确、 高效的判断由镰孢根腐真菌引起的大豆根腐病。 说明书 1/9 页 3 CN 106755416 B 3 0006 为实现本发明的技术目的， 本发明第一方面提供一种用于分析大豆镰孢根腐真菌 多样性的特异性引物组， 所述引物组包括： 0007 具有如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物； 0008 具有如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物； 0009 具有如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物； 0010 具有如SEQ ID NO.4所示的第四正向引物中的一种或多种， 以及 0011 具有如SEQ ID NO.5所示的共用反向引物组成。 0012 尤其。
14、是， 本发明提供的特异性引物是基于EF-1 为目标基因进行设计得到的。 0013 特别是， 所述第一正向引物、 第二正向引物、 第三正向引物、 第四正向引物可以分 别扩增出不同大小的条带， 每个条带对应不同的病原菌。 0014 特别是， 所述特异性引物组应用于多重PCR检测大豆根腐病的反应体系为： 体系总 量1050 L， 包括待测样本的DNA溶液2.04.0 L、 正向引物1.54.0 L、 反向引物1.5 4.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液5.025.0 L、 超纯水013.0 L。 0015 优选地， 所述应体系为： 体系总量25 L， 待测样本的DNA溶液4.0 L。
15、、 正向引物4.0 L、 反向引物4.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液12.5 L、 超纯水0.5 L。 0016 特别是， 所述特异性引物应用于多重PCR检测大豆根腐病的反应条件为： 94预变 性3min； 94变性30s， 5256退火30s， 72延伸30s， 循环2540次； 72终延伸5min。 0017 优选地， 所述反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 54退火30s， 72延伸 30s， 循环30次； 72终延伸5min。 0018 为实现本发明的技术目的， 本发明第二方面提供一种检测大豆镰孢根腐真菌的试 剂盒， 其具有第一方面所述特异性引物组。
16、。 0019 其中， 所述试剂盒的体系总量为1050 L， 包括待测样本的DNA溶液2.04.0 L、 正向引物1.54.0 L、 反向引物1.54.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液5.025.0 L、 超纯水013.0 L。 0020 优选的， 所述试剂盒的体系总量为25 L， 待测样本的DNA溶液4.0 L、 正向引物4.0 L、 反向引物4.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液12.5 L、 超纯水0.5 L。 0021 其中， 使用所述试剂盒的反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 5256退 火30s， 72延伸30s， 循环2540次；。
17、 72终延伸5min。 0022 优选地， 所述使用试剂盒的反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 54退火 30s， 72延伸30s， 循环30次； 72终延伸5min。 0023 特别是， 所述试剂盒不但可以根据反应结果得到的条带确定大豆发生链孢根腐 病， 还可以根据条带数量和条带大小可以判断大豆镰孢根腐真菌的数量和种类。 0024 例如， 当条带大小为172bp时， 可以判断大豆感染腐皮镰孢菌(F.solani)； 当条带 大小为269bp时， 可以确定大豆感染木贼镰孢菌(F.equiseti)； 当条带大小为376bp时， 可以 判断大豆染有禾谷镰孢菌(F.gramine。
18、arum)； 当条带大小为570bp时， 可以判断大豆感染尖 孢镰孢菌(F.oxysporum)。 0025 为实现本发明的技术目的， 本发明第三方面提供一种检测大豆根腐病的方法， 使 用第一方面所述的特异性引物组对待测样本的DNA进行多重PCR检测， 若琼脂凝胶电泳出现 条带， 则判断待测样本发生了根腐病。 说明书 2/9 页 4 CN 106755416 B 4 0026 特别是， 该方法还可以根据根据条带数量和条带大小可以判断大豆镰孢根腐真菌 的数量和种类。 当条带大小为172bp时， 可以判断大豆感染腐皮镰孢菌(F.solani)； 当条带 大小为269bp时， 可以确定大豆感染木贼镰。
19、孢菌(F.equiseti)； 当条带大小为376bp时， 可以 判断大豆染有禾谷镰孢菌(F.graminearum)； 当条带大小为570bp时， 可以判断大豆感染尖 孢镰孢菌(F.oxysporum)。 0027 其中， 所述第一方面的特异性引物组对待测样本的DNA进行多重PCR检测的反应体 系为： 0028 其中， 所述试剂盒的体系总量为1050 L， 待测样本的DNA溶液2.04.0 L、 正向 引物1.54.0 L、 反向引物1.54.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液5.025.0 L、 超纯 水013.0 L。 0029 优选的， 所述试剂盒的体系总量为25 L，。
20、 待测样本的DNA溶液4.0 L、 正向引物4.0 L、 反向引物4.0 L、 Tap Master Mix聚合酶混合液12.5 L、 超纯水0.5 L。 0030 其中， 使用所述试剂盒的反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 5256退 火30s， 72延伸30s， 循环2540次； 72终延伸5min。 0031 优选地， 所述使用试剂盒的反应条件为： 94预变性3min； 94变性30s， 54退火 30s， 72延伸30s， 循环30次； 72终延伸5min。 0032 为实现本发明的技术目的， 本发明第四方面提供一种检测大豆链孢根腐病的方 法， 使用第二方面所述的试剂。
21、盒对待测样本的DNA进行检测， 若琼脂凝胶电泳出现条带， 则 判断待测样本发生了大豆链孢根腐病。 0033 本发明的有益效果： 0034 1、 由于本发明提供的特异性引物组是根据多种大豆根腐病镰孢菌的延伸因子EF- 1 基因序列比对后得到的， 特异性强， 灵敏度高， 最高检测浓度可达10-8， 因此可以准确、 高 效的判断由镰孢根腐真菌引起的大豆根腐病。 0035 2、 本发明提供的特异性引物组不但可以准确高效的判断由镰孢菌引起大豆根腐 病， 还可以直观的判断病原菌的数量与种类。 0036 3、 利用本发明方法对由镰孢菌引起的大豆根腐病进行检测， 仅需要1.92h， 为现有 技术的1/10倍。。
22、 0037 4、 本发明方法检测步骤简单， 成本低廉， 普适性广。 附图说明 0038 图1是本发明进行单重PCR检测四种大豆根腐病致病镰孢菌引物的特异性电泳结 果； 0039 图2是本发明利用混合体系检测镰孢菌引物的特异性及多重PCR建立的电泳结果； 0040 图3是多重PCR体系对单一待测样本的灵敏度检测的电泳结果； 0041 图4是多重PCR体系对多个待测样本的灵敏度检测的电泳结果； 0042 图5是模拟大豆镰孢根腐病环境样本的多重PCR验证的电泳结果； 0043 图6是其他非大豆致病镰孢菌环境样本的多重PCR验证的电泳结果。 具体实施方式 说明书 3/9 页 5 CN 10675541。
23、6 B 5 0044 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、 特征和优点， 下面结合附图和具体实 施方式对本发明进行进一步的详细描述。 0045 在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明， 但是， 本发明还 可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施， 因此， 本发明并不限于下面公开的具体 实施例的限制。 0046 试剂及仪器： 核酸染料、 琼脂糖、 蛋白酶K、 Taq PCR Master Mix、 DNA Marker 600 等购自生工生物工程(上海)股份有限公司； 台式高速冷冻离心机(Eppendorf， 5424R， 上 海)、 PCR扩增仪(ThermaL Cy-cL。
24、er， 1000TM， Bio-Rad)、 电泳仪(DYY-6C型， 北京六一仪器 厂)、 凝胶成像仪(niversaL Hood II， Bio-Rad)、 超微量分光光度计(Thermo Scientific， Nanodrop2000， 美国)； 其余常规试剂均为分析纯， 购自成都博大泰克生物公 司。 0047 实施例1特异性引物 0048 1、 特异性引物的获得 0049 利用延伸因子EF-1 基因序列的通用引物EF1/EF2对不同的大豆根腐病的致病镰 孢菌进行PCR扩增， 获得多种大豆根腐病致病镰孢菌的EF-1 基因序列并提交GenBank， 基因 登录号分别为KX966232、 K。
25、X966220、 KX966207和KX966200。 根据镰孢菌的EF-1 基因序列， 采 用引物设计软件如Vector NTI 11 .0software(Invitrogen， USA)或NCBI在线平台 (https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对， 寻找差异位点， 根据差异 位点分别设计4种病原菌的扩增片段大小存在明显差异的特异引物， 得到SEQ ID NO.14 的所示特异引物序列， 反向引物设计在保守区段， 得到SEQ ID NO.5所示的共用反向引物。 利用NCBI Blast对各引物进行参数检测， 由生物公司合成， 合成的引物。
26、用ddH2O溶解为10 mol/L用于PCR扩增。 其中， 本发明所用的大豆根腐病的致病镰孢菌为大豆根腐病的主要致 病菌， 即木贼镰孢菌(F.equiseti)、 尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、 腐皮镰孢菌(F.solani)、 禾 谷镰孢菌(F.graminearum)， 其EF-1 基因序列可从GenBank获得， 也可以由实验室自行分离 鉴定获得， 其中， 经实验室自行分离获得的菌株经形态观察致病性检测、 以及基于rDNA- ITS、 EF1- 和RPB1基因序列的分子鉴定， 均与公开的木贼镰孢菌(F.equiseti)、 尖孢镰孢菌 (F.oxysporum)、 腐皮镰孢菌(F。
27、.solani)、 禾谷镰孢菌(F.graminearum)一致。 0050 其中， 获得的特异引物如表1所示。 0051 说明书 4/9 页 6 CN 106755416 B 6 0052 注： SEQ ID NO.1-4为各镰孢菌正向特异引物； SEQ ID NO.5为各镰孢菌通用反向 引物。 0053 经鉴定， 如SEQ ID NO.1-4所示的正向特异引物分别鉴定不同的镰孢菌真菌， 其所 对应的镰孢菌真菌如表2所示， 根据其所鉴定的不同真菌将其定义： 0054 表2不同正向特异引物及其特性 0055 0056 在多重PCR扩增体系的建立过程中， 目的片段的选择和引物设计是首要的、 关键。
28、性 的步骤。 多重PCR技术要实现在同一反应体系中扩增多个目的条带， 其扩增引物除对引物长 度、 G+C、 二级结构及二聚体等一般PCR引物设计的要求外， 还须满足特异性强、 相容性好、 扩增获得的目的片段大小差异较大， 电泳结果肉眼容易区分等特点。 本实验为建立4种大豆 根腐病致病镰孢菌的多重PCR扩增体系， 前期分别选择镰孢菌的核糖体转录间隔区序rDNA- ITS和翻译延长因子EF-1 序列进行分析比对， 结果发现4种镰孢菌的rDNA-ITS无较多可变 区域， 引物设计较困难， 而EF-1 序列则变异位点区域较多。 因此， 本发明人基于大量的实验 论证发现， 以EF-1 为目标基因用于引物。
29、设计， 可以实现本发明的技术目的。 发明人通过对4 种致病镰孢菌及其他非致病镰孢菌的翻译延伸因子EF-1 基因序列进行比对， 选择变异位 点较多的区段作为4种镰孢菌的各自正向引物设计位点， 选择与其他非致病镰孢菌有差异 的位点区段用作共用反向引物， 既兼顾了4种镰孢菌引物特异性， 又避免了今后用于环境样 品检测过程中其他非致病镰孢菌的干扰， 结果表明， 所涉及的引物特异性好， 相互间无干 扰， 适合多重PCR体系对引物的要求。 0057 2、 多重PCR反应体系 0058 10 L体系如下： 0059 0060 25 Ll体系如下： 说明书 5/9 页 7 CN 106755416 B 7 0。
30、061 0062 50 L体系如下： 0063 0064 3、 反应体系的反应条件 0065 94预变性3min； 94变性30s， 54退火30s， 72延伸30s， 30个循环； 最后72 延伸5min。 0066 其中， 退火温度在5256范围内都可以实现PCR的扩增， 例如将退火温度分别设 定为52、 53、 55、 56； 0067 其中， 反应程序中循环次数在2540次均可以实现本发明的目的， 例如将循环次 数设为25次、 35次和40次。 0068 实施例2特异性引物的特异性检测 0069 1、 待测样本的获得与培养 0070 选取本实验室从大豆根腐病病株根部经分离和鉴定获得的尖。
31、孢镰孢菌 (F .oxysporum)、 腐皮镰孢菌(F .solani)、 木贼镰孢菌(F .eqiseti)和禾谷镰孢菌 (F.graminearum)四种致病菌的纯化菌株作为待试样本。 0071 将上述4种供试镰孢菌的单孢纯化菌株， 分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马 铃薯200g、 葡萄糖10g、 琼脂粉20g， PDA)PDA培养基上， 置于2528温箱中培养35天， 并 保存待用。 0072 2、 DNA的提取 0073 采用CTAB法提取镰孢菌DNA。 具体步骤如下： 刮取PDA培养基上菌丝于研钵中， 在液 氮中研磨至粉末状放入2mL离心管， 加入1mL 65预热的CTAB和2。
32、 L -巯基乙醇， 充分混匀 后， 65， 水浴45min； 取出离心管冷却后， 加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1， V/V)， 温和摇匀 10min后， 10 000r/min离心10min； 取上清液， 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1， V/V)， 重复1 2次； 收集上清液至离心管后， 迅速加入预先冷冻的异丙醇至满管， 置于-20冰箱中冷冻2h 后， 10 000r/min离心10min； 弃上清液， 加入1mL 75乙醇， 8000r/min离心5min； 弃上清液， 加入1mL无水乙醇， 8000r/min离心5min， 弃上清液， 重复12次； 将离心管打开， 在超净工作 说明。
33、书 6/9 页 8 CN 106755416 B 8 台中晾干， 加入40 L ddH2O溶解DNA， 放入-20冰箱中保存待用。 0074 3、 单一PCR扩增的特异性检测 0075 分别利用SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物对木贼镰 孢菌(F.equiseti)病原菌进行PCR扩增、 利用SEQ ID NO.2所示的正向引物和SEQ ID NO.5 所示的反向引物对禾谷镰孢菌(F.graminearum)病原菌进行PCR扩增、 利用SEQ ID NO.3所 示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物对尖孢镰孢菌(F.oxysorum)病原菌进。
34、行PCR 扩增、 利用SEQ ID NO.4所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物对腐皮镰孢菌 (F.solani)病原菌进行PCR扩增。 0076 反应体系为25 L： 12.5 L Taq PCR Master Mix， 1.0 L镰孢菌DNA， 1.0 L正向引 物， 1.0 L反向引物， 补ddH2O至25 L， 以ddH2O为模版作为阴性对照。 0077 PCR反应程序为： 94预变性3min； 94变性30s， 54退火30s， 72延伸30s， 30个 循环； 72延伸5min。 采用2琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物， 依据条带大小确定镰孢菌 的种， 从而验证引物。
35、的特异性， 电泳结果如图1所示。 0078 从图1中可以看出 ， 利用本申请的不同特异性引物对分别对木贼镰孢菌 (F .equiseti)、 尖孢镰孢菌(F .oxysporum)、 腐皮镰孢菌(F .solani)、 禾谷镰孢菌 (F .graminearum)进行检测， 分别获得F .solani为172bp、 F .equiseti为269bp、 F.graminearum为376bp和F.oxysorum为570bp， 扩增条带唯一均较亮， 无杂带干扰， 而且各 片段大小适中容易区分， 表明基于EF-1 基因序列设计获得引物特异性好。 0079 4、 多重PCR扩增的特异性检测 008。
36、0 将如SEQ ID NO.1-4所示的正向引物以体积比1:1:1:1混合， 以及SEQ ID NO.5所 示的反向引物作为共用反向引物， 建立混合扩增体系， 分别将1种、 2种、 3种、 4种病原菌DNA 混合后作为模板， 其中混合比例为1:1或1:1:1或1:1:1:1， 检测本申请提供的引物的特异 性。 0081 其中， PCR反应体系为25 L： 12.5 L Taq PCR Master Mix， DNA依据上述设计的模 板加入， DNA模板的总用量为4.0 L， 4.0 L混合正向引物， 4.0 L通用反向引物SEQ ID NO.5， 用ddH2O至25 L。 0082 其中， 反。
37、应条件是： 反应程序94预变性3min； 94变性30s， 54退火30s， 72延 伸30s， 30个循环； 72延伸5min。 采用2琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物， 得到如图2所 示的检测结果。 0083 根据图2中2-1图的检测结果可知， 2-1图中的泳道14分别与泳道N(即ddH2O对 照)相比， 以单一镰孢菌DNA为模板进行PCR扩增(14泳道)均能扩增出对应镰孢菌的特异 条带， 且无杂带出现， 表明混合引物体系对各镰孢菌PCR扩增无影响， 在该体系下的引物特 异性好。 0084 根据图2中2-2图的检测结果可知， 在混合引物体系下， 分别加入1种、 2种、 3种、 4种 病原菌。
38、的DNA进行PCR扩增(编号69)， 均扩增出了相应的镰孢菌目的条带， 各条带较亮， 且 无其他杂带干扰， 由此说明4对引物特异性较好， DNA和引物之间均不存在交叉和相互干扰。 同时， 以4对特异引物和4种DNA混合(编号5和9)， 所扩增条带清晰， 无杂带， 符合多重PCR体 系要求， 可见混合的特性引物组的特异性和灵敏度均不受影响， 依然可以检测到不同的镰 孢根腐真菌。 说明书 7/9 页 9 CN 106755416 B 9 0085 实施例3特异性引物的灵敏度检测 0086 将单一镰孢菌的DNA(100ng/ L)， 用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测其浓 度， 将混合。
39、DNA浓度调整至100ng/ L， 然后10梯度稀释为10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 107、 10-8、 10-9、 10-10、 10-11、 10-12、 10-13不同浓度梯度， 利用本发明提供的如SEQ ID NO.14所示 的正向引物以体积比1:1:1:1混合， 以及SEQ ID NO.5所示的反向引物作为共用反向引物， 以及建立的多重PCR体系进行扩增及电泳检测， 得到如图3所示的电泳结果， 根据图3所示的 电泳图可知， 当DNA稀释为10-8倍时， 依然可以见到的镰孢菌。 可见， 相对于现有技术， 本发明 的特异性引物的灵敏度远高于常用的。
40、引物测定的100倍。 0087 将镰孢菌混合DNA(100ng/ L)， 用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测其浓度， 将混合DNA浓度调整至100ng/ L， 然后10梯度稀释为10-1、 10-2、 10-3、 10-4共5个浓度梯度， 利 用本发明提供的如SEQ ID NO.14所示的正向引物以体积比1:1:1:1混合、 SEQ ID NO.5所 示的反向引物作为共用反向引物， 以及建立的多重PCR体系进行扩增及电泳检测， 得到如图 4所示的电泳结果， 根据图4所示的电泳图可知， 当混合DNA稀释为10-1和10-2倍时， 可同时检 测到4种病原菌， 但稀释至10-3和10-。
41、4倍时， 不能同时检测到4种病原菌， 因此该多重PCR的灵 敏度可达到10-2， 即混合DNA的最低浓度为0.1ng/ L。 0088 可见， 本发明的特异性引物组对于单独的还是混合的样品都可以准确的检测出不 同的镰孢菌， 特异性强、 相容性好、 而且对于混合样品进行的多重PCR扩增获得的目的片段 大小差异较大， 电泳结果肉眼容易区分， 将本发明的特异性引物应用于由镰孢菌引起的大 豆根腐病的检测可以快速分辨出引起大豆根腐病的菌株， 并根据检测结果所显示的条带大 小就可以确定病原菌种类， 从而为大豆根腐病的综合防治提供依据。 0089 对照例1 0090 模拟大豆根腐病接种的环境样本进行多重PC。
42、R体系验证， 分别提取木贼镰孢菌 (F.equiseti)与大豆苗的混合后的DNA， 木贼镰孢菌DNA， 禾谷镰孢菌(F.graminearum)和大 豆苗的混合后的DNA、 禾谷镰孢菌DNA、 尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和大豆苗的混合后的DNA、 尖孢镰孢菌DNA、 腐皮镰孢菌(F.solani)和大豆苗混合后的DNA， 腐皮镰孢菌DNA， 四个菌(木 贼镰孢菌、 禾谷镰孢菌、 尖孢镰孢菌、 腐皮镰孢菌)和大豆苗的混合后的DNA， 木贼镰孢菌、 禾 谷镰孢菌、 尖孢镰孢菌和腐皮镰孢菌的混合后的DNA作为待测样本， 并设置大豆豆苗的DNA 作为对照， 以ddH2O为阴性对照， 利用本。
43、发明提供的特异性引物组以及多重PCR反应体系、 多 重PCR反应条件进行检测， 得到如图5所示的检测结果。 0091 图中， M： DNA Marker； 110： 各样品混合后再提DNA进行PCR验证， 并分别以镰孢菌 为对照 ， 依次为木贼镰孢菌 (F .equiseti) +大豆苗 ， 木贼镰孢菌 ， 禾谷镰孢菌 (F.graminearum)+大豆苗， 禾谷镰孢菌， 尖孢镰孢菌(F.oxysporum)+大豆苗， 尖孢镰孢菌， 腐皮镰孢菌(F.solani)+大豆苗， 腐皮镰孢菌， 木贼镰孢菌+禾谷镰孢菌+尖孢镰孢菌+腐皮 镰孢菌+大豆苗， 木贼镰孢菌+禾谷镰孢菌+尖孢镰孢菌+腐皮镰孢。
44、菌； CK： 大豆豆苗DNA作为 对照； N： 阴性对照ddH2O。 0092 根据检测结果可知， 与镰孢菌DNA相比， 大豆黄花苗和各镰孢菌菌丝混合后提取的 DNA样品经多重PCR扩增后， 均能扩增出各镰孢菌的特异条带， 且4种镰孢菌菌丝与大豆豆苗 混合DNA亦清晰地扩增出了4条镰孢菌条带。 同时， 考虑到大豆黄花苗与镰孢菌混合提取DNA 过程中， 可能存在大量的大豆蛋白质影响多重PCR体系对镰孢菌的特异性扩增， 本实验还设 说明书 8/9 页 10 CN 106755416 B 10 置了大豆DNA和镰孢菌DNA的混合DNA样本用作对照， 结果表明， 经优化的CTAB法提取获得的 混合材料。
45、DNA质量较好， 无蛋白污染， 表明该多重PCR体系可特异性地鉴定出环境样本中的 致病镰孢菌。 0093 对照例2 0094 设 置 木 贼 镰 孢 菌 ， 禾 谷 镰 孢 菌 ， 尖 孢 镰 孢 菌 ， 腐 皮 镰 孢 菌 ， 色 二 孢 菌 (Lasiodiplodia theobromae)， 稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)， 细极链格孢菌 (Alternaria tenuissima)， 层生镰刀菌(F.proliferatum)， 大豆种腐病菌(Diaporthe longicolla)的DNA作为待测样本利用本发明提供的特异性引物组以及多重PCR反应体系、 多重PC。
46、R反应条件进行检测， 得到如图5中5-1所示的检测结果； 并设置木贼镰孢菌， 禾谷镰 孢菌， 尖孢镰孢菌， 腐皮镰孢菌， 木霉属(Trichoderma simmonsii)、 腐霉菌(Pythium ultimum Trow)、 疫霉菌(Phytophthora sojae)、 木霉属(Trichoderma pyramidale)、 木霉 属(Trichoderma rossicum)、 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、 炭疽菌(Colletotrichum spp.)的DNA作为待测样本利用本发明提供的特异性引物组以及多重PCR反应体系、 多重PCR 反应条件进行检测。
47、， 设置ddH2O为阴性对照， 得到如图5中5-2所示的检测结果。 0095 图中， M： DNA Marker； 14： 木贼镰孢菌， 禾谷镰孢菌， 尖孢镰孢菌， 腐皮镰孢菌； 5 10： F.commune， 色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)， 稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)， 细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)， 层生镰刀菌(F.proliferatum)， 大豆种 腐病菌(Diaporthe longicolla)； 1114： 木贼镰孢菌， 禾谷镰孢菌， 尖孢镰孢菌， 腐皮镰孢 菌； 1518： 木霉菌(Tricho。
48、derma simmonsii)； 19： 木霉菌(Trichoderma pyramidale)； 20： 木霉菌(Trichoderma rossicum)； 21： 腐霉菌(Pythium ultimum Trow)； 22： 大豆疫霉菌 (Phytophthora sojae) ； 23： 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) ； 24： 炭疽菌 (Colletotrichum spp.)； N： 阴性对照ddH2O。 0096 根据图5所示的电泳结果可知， 表示木贼镰孢菌， 禾谷镰孢菌， 尖孢镰孢菌， 腐皮镰 孢菌的1-4和11-14条带均能检测出来， 其他非镰孢菌均无。
49、法得到明亮的条带， 可见本发明 的特异性引物特异性好， 进一步表明该多重PCR体系引物的特异性， 可保证后期环境样本检 测的准确性。 0097 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之类。 说明书 9/9 页 11 CN 106755416 B 11 0001 序列表 0002 四川农业大学 0003 用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组、 试剂盒及其应用 0004 5 0005 PatentIn version 3.5 0006 1 0007 21 0008 DNA 0009 人工序列 0010 CTTATACCCCG。