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1、(10)授权公告号 CN 102060905 B (45)授权公告日 2012.10.10 CN 102060905 B *CN102060905B* (21)申请号 201010541297.4 (22)申请日 2010.11.12 C07J 71/00(2006.01) (73)专利权人 山东省科学院生物研究所 地址 250014 山东省济南市历下区科院路 19 号 (72)发明人 袁文鹏 刘昌衡 刘新 张永刚 夏雪奎 王小军 孟秀梅 张绵松 贾爱荣 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 曲志波 袁文鹏 . 仿刺参 （Apostichopus japoni。
2、cus） 水溶性海参皂苷的分离纯化及其药理活性研 究 .中国博士学位论文全文数据库 医药卫生 科技辑 .2008,( 第 03 期 ),E057-5. 薛长湖 等.青岛仿刺参中3种海参皂苷的分 离纯化及结构鉴定 .中国海洋大学学报 .2010, 第 40 卷 ( 第 8 期 ),60-65. 袁文鹏 等 . 水溶性海参皂苷的分离纯化 及其抗真菌活性研究 .山东大学学报 ( 理学 版 ) .2007, 第 42 卷 ( 第 5 期 ),69-78. (54) 发明名称 利 用 鲜 海 参 加 工 废 液 制 备 海 参 皂 苷 Holotoxin A1对照品的工艺方法 (57) 摘要 一种利用鲜。
3、海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1对照品的工艺方法， 其特征是它由 如下步骤组成 ： (1) 将鲜海参加工废液减压浓缩 醇沉， 吸取上清液 ； (2) 将所得上清液通过大孔 吸附树脂柱， 吸附饱和后冲洗并收集洗脱液， 将 洗脱液减压浓缩得浸膏 ； (3) 将所得浸膏拌硅胶 粉， 利用由甲醇， 二氯甲烷， 乙酸乙酯， 水组成的 溶液体系进行硅胶柱层析 ； 再利用甲醇二氯甲 烷乙酸乙酯水 2 2 4 1 为展开体 系， 取下层进行 TLC 层析， 收集硅胶柱层析迁移率 为 0.2-0.3 的组分， 将该组分减压浓缩， 真空干燥 得白色粉末。(4) 将白色粉末利用乙腈水溶液溶 解， 。
4、利用 HPLC， 203nm 紫外光吸收， 乙腈水溶液为 流动相进行纯化， 收集主峰， 真空干燥得海参皂苷 Holotoxin A1对照品。本发明主要用于制备海参 皂苷 Holotoxin A1。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 周静 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1.一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的工艺方法， 其特征是 它由如下步骤组成 ： (1) 将鲜海参加工废液减压浓缩后加入乙醇， 静置， 待固液分层后， 吸取上清液 ； (。
5、2) 将所得上清液通过大孔吸附树脂柱， 吸附饱和后， 分别利用水， 20乙醇溶液冲洗 ； 然后再利用 70乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂柱并收集洗脱液， 将洗脱液减压浓缩得浸膏 ； (3) 将所得浸膏拌样硅胶粉， 利用由甲醇， 二氯甲烷， 乙酸乙酯， 水组成的溶液体系进行 硅胶柱层析 ； 再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1 为展开体系， 取下层 进行 TLC 层析， 收集硅胶柱层析迁移率为 0.2-0.3 的组分， 将该组分减压浓缩， 真空干燥得 白色粉末 ； (4) 将白色粉末利用乙腈水溶液溶解， 利用 HPLC， 203nm 紫外光吸收， 乙腈水溶液为流 动相进行纯化， 收集主峰， 真。
6、空干燥得海参皂苷 Holotoxin A1 对照品。 2. 根据权利要求 1 所述的利用鲜海参加工废液提取海参皂苷 Holotoxin A1 对照品的 工艺方法， 其特征是所述鲜海参为新鲜刺参。 3. 根据权利要求 2 所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1 对照品 的工艺方法， 其特征是所述鲜海参加工废液是指将新鲜刺参放入沸腾的海水或自来水中煮 10-40min， 捞出海参后所得到的溶液。 4. 根据权利要求 3 所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1 对照品的 工艺方法， 其特征是将新鲜刺参煮制后得到的鲜海参加工废液减压浓缩后利用乙醇沉淀得 。
7、到混合液， 使乙醇在混合液中的浓度为 15-25， 静置分层后， 取上清液。 5. 根据权利要求 1 所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1 对照品的 工艺方法， 其特征是所述乙腈水溶液为 45-55乙腈水溶液。 6. 根据权利要求 1 所述的利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1 对照品 的工艺方法， 其特征是所述硅胶柱层析中的层析液为甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1， 取下层。 权 利 要 求 书 CN 102060905 B 2 1/4 页 3 利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin A1对照品的 工艺方法 技术领域 0001 本。
8、发明涉及一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1对照品的工艺 方法。 背景技术 0002 海参皂苷具有重要的生物学活性， 如抗真菌、 抗肿瘤、 抗炎、 抗病毒、 提高免疫力 等， 1976 年， 日本学者 Kitagawa 便从刺参 (stichopus japonicus shlenka) 中分离出具有 显著抗真菌活性的皂苷类物质， holotoxin A 和 B， 现已经成为脚气和脚癣的治疗药物。此 后， 对海参皂苷的研究倍受学者们关注。 0003 我国对于海参皂苷的研究始于上世纪80年代， 已先后分离纯化出100余种不同结 构的海参皂苷。海参皂苷分离纯化方法有多种， 。
9、包括如下 ： 0004 如 2005 年， 第二军医大学药学院海洋药物中心在 第二军医大学学报 第 26 卷 第 6 期， 发表了 “糙海参中三萜活性成分的研究” ， 分离鉴定了 5 个三萜皂苷化合物， 分别为 24-dehydroechinoside A(1)， echinoside B(2)， echinoside A(3)， holothurin B(4) 和 holothurin A(5)， 其分离纯化的主要特点是 ： 糙海参干燥、 粉碎 (7.0kg)， 用 70乙醇冷浸 提取 (200L3 次 )， 回收乙醇得流浸膏， 分散在水中， 依次用石油醚、 三氯甲烷、 正丁醇萃 取， 得到。
10、石油醚部分、 三氯甲烷部分和正丁醇部分， 糙海参皂苷主要集中于正丁醇部分。正 丁醇部位减压浓缩得糙海参总皂苷 (75.8g)。总皂苷经大孔树脂柱层析和 Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶过滤纯化， 经反复的正相硅胶柱层析处理， 氯仿甲醇水 (7 3 1， 下层 ) 洗脱， 再经反相硅胶柱层析分离 ( 洗脱剂为 62甲醇溶液 )， 最后通过 HPLC 纯化 ( 流动相 为 60甲醇溶液， 流速为 1.5ml/min)。 0005 2006 年， 第二军医大学药学院海洋药物中心在 中草药 第 4 期， 发表了 “黑乳海 参中两个新的三萜皂苷” ， 其分离纯化的主要特点 ： 新鲜黑乳海参材料洗。
11、净、 切碎后， 用85 乙醇冷浸提取， 回收乙醇得流浸膏。将流浸膏均匀分散在水中， 用二氯甲烷萃取， 待二氯甲 烷萃取液颜色变得极浅后， 再用正丁醇萃取。回收正丁醇即可得到黑乳海参粗皂苷。取粗 皂苷 60mg， 溶于 120mL 由吡啶 - 二氧六环等体积混合的溶剂中， 120加热 215h。反应物冷 却后， 回收溶剂， 所得浸膏用硅胶低压柱色谱处理， 氯仿甲醇水 (7.5 2.5 1， 下层 ) 洗脱， 得到的主成分再进行高效液相柱色谱纯化， 色谱柱为 Zobax SB C218 型 ODS 反相柱， 洗脱剂为 80甲醇， 体积流量为 1.5mL/min， 得到 2 个化合物。 0006 2。
12、006 年， 第二军医大学药学院海洋药物中心在 中国天然产物 第 4 卷， 发表了 “花 刺参中两个新的三萜皂苷” ， 其分离纯化的主要特点 ： 新鲜花刺参 ( 约 15kg)， 绞碎， 用 70 的乙醇冷浸 3 次， 每次 7d， 减压回收乙醇提取液得流浸膏。用甲醇反复多次溶解， 过滤除去 不溶物， 甲醇组分减压回收至浸膏状。再将其分散在水中， 水溶液用石油醚萃取 3 次， 脱脂 后的溶液用正丁醇萃取 6 次， 减压回收正丁醇部分得到粗总皂苷 (17.6g)。总皂苷经反复 的正相和反相硅胶柱层析分离， 以及Sephadex LH-20纯化， 所得主成分进行制备HPLC纯化 说 明 书 CN 。
13、102060905 B 3 2/4 页 4 ( 流动相为 65甲醇 )， 流速为 1.5mLmin-1， 得到化合物 (19.6mg)， 化合物。 0007 2008 年， 第二军医大学药学院海洋药物中心在 中国海洋药物杂志 第 27 卷， 发表 了 “丑海参的化学成分研究” ， 分离鉴定了 3 个海参皂苷 ： Holothurin A1( )， Holothurin A()和Pervicoside C()， 其分离纯化的主要特点是 ： 丑海参干品3.8kg粉碎， 用70 乙醇加热回流提取 4 次， 合并提取液， 减压浓缩至无醇味， 分散水中， 进行大孔树脂柱分离， 依次用水、 70乙醇和 9。
14、5乙醇洗脱， 70乙醇洗脱液浓缩得总皂苷 (83g)。总皂苷进行快 速硅胶柱色谱分离， 用CHCl3MeOHH2O梯度洗脱(821， 731， 6.53.51)， 分为 A J 10 个组分， TLC 检测表明海参皂苷主要在 J 组分中 (7.03g)。取 J 组分 1.0g， 进行 MPLC(ODS 反相硅胶 ) 分离， 以 70 MeOH 洗脱， 得到 J 1， J 2 和 J 33 个组分 ： J 1 经 HPLC 制备， 以 50 MEOH 洗脱， 得到化合物 (13mg) ； J 2 经 HPLC 制备， 以 54 MEOH 洗脱， 得到化合物 (220mg) ； J 3 经 HPL。
15、C 制备， 以 54 MEOH 洗脱， 得到化合物 (24mg)。C 组 分 (940mg) 进行硅胶柱和 SephadexLH-20 柱分离， 得化合物 (64mg)。 0008 以上对海参皂苷单体的分离纯化均从鲜海参或干参中获得。 0009 2006年， 中国海洋大学以海参废液为原材料提取制备了水溶性海参皂苷， 在 中国 海洋大学学报 第36卷， 发表了 “仿刺参水溶性海参皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究” ， 其主要特点是 ： 海参废弃液用 1mol/L NaOH 调节 pH 10， 离心 (8000r/min， 30min) 收集上 清液， 上样于预处理的 AB-8 型大孔吸附树脂柱，。
16、 用去离子水冲洗后， 分别用 20和 70的 乙醇溶液进行洗脱， 收集 70乙醇的洗脱组分， 减压浓缩至浸膏状， 加入少量蒸馏水重新溶 解， 离心 (8000r/min， 40min) 收集上清液， 经石油醚萃取脱脂后， 将水层再利用水饱和的正 丁醇萃取 3 次， 合并所得正丁醇层， 减压浓缩至浸膏状后进行真空冷冻干燥， 即得到水溶性 海参皂苷冻干品。文中从海参废液中分离制备了海参皂苷， 但对于 Holotoxin A1纯品的制 备还没有报道。 发明内容 0010 本发明提出一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1对照品的工艺 方法。 0011 本发明的技术方案包括如下内容。
17、 ： ( 本发明所述百分数均为浓度百分比 ) 0012 一种利用鲜海参加工废液制备海参皂苷 Holotoxin A1对照品的工艺方法， 其特征 是它由如下步骤组成 ： (1) 将鲜海参加工废液减压浓缩后加入乙醇， 静置， 待固液分层后， 吸取上清液 ； (2) 将所得上清液通过大孔吸附树脂柱， 吸附饱和后， 分别利用水， 20乙醇 溶液冲洗 ； 然后再利用 70乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂柱并收集洗脱液， 将洗脱液减压浓 缩得浸膏 ； (3) 将所得浸膏拌样硅胶粉， 利用由甲醇， 二氯甲烷， 乙酸乙酯， 水组成的溶液体 系进行硅胶柱层析 ； 再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1， 取下层为。
18、展 开剂进行 TLC 层析 ； 收集硅胶柱层析迁移率为 0.2-0.3 的组分， 将该组分减压浓缩， 真空干 燥得白色粉末。 (4)将白色粉末利用乙腈水溶液溶解， 利用HPLC， 203nm紫外光吸收， 乙腈水 溶液为流动相进行纯化， 收集主峰， 真空干燥得海参皂苷 Holotoxin A1对照品。TLC 是指硅 胶板层析。 0013 本方案的具体特点还有所述鲜海参为新鲜刺参。 将新鲜刺参煮制后的加工废液减 压浓缩后利用乙醇沉淀得到混合液， 使乙醇在混合液中的浓度为 15-25， 静置分层后， 取 说 明 书 CN 102060905 B 4 3/4 页 5 上清液。所述乙腈水溶液为 45-5。
19、5乙腈水溶液。所述鲜海参加工废液是指将新鲜刺参放 入沸腾的海水或自来水中煮 10-40min， 捞出海参后所得到的溶液。所述硅胶柱层析中的层 析液为甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1， 取下层。 0014 海参皂苷 Holotoxin A1结构式如下 ： 0015 0016 本发明充分利用新鲜刺参加工煮制过程中所产生的废液， 利用上述工艺方法， 能 够有效的分离纯化出 98以上的海参皂苷 Holotoxin A1对照品。本发明最显著的特点 包括如下三个方面 ： (1) 利用新鲜刺参加工废液， 从中提取纯度高于 98以上的海参皂苷 Holotoxin A1； (2) 工艺方法仅采用醇沉取上清。
20、液、 大孔树脂层析、 硅胶柱层析、 HPLC 层析 四步先后组合就可获得 98以上纯度的海参皂苷对照品， 工艺简单 ； (3)HPLC 层析， 采用 203nm 紫外光吸收， 45-55乙腈水溶液为流动相进行纯化， 不同于文献中报道的分离其它 海参皂苷单体 ( 纯品 ) 的方法， 如利用 60甲醇溶液为流动相。本发明对于利用新鲜刺参 加工废液分离纯化制备海参皂苷 Holotoxin A1对照品具有极高的利用价值。 具体实施方式 0017 实施例 1 0018 (1) 收集新鲜刺参加工废液 2000L， 65第一次减压浓缩， 浓缩至体积 200L， 固形 物含量为 16， 然后加入 95的乙醇 。
21、45L， 静置后取上清液。 0019 (2) 上清液以 2 倍柱体积的流速通过 AB-8 型大孔吸附树脂柱， 过柱完毕后， 利用 50L 的纯净水冲洗， 20L20的乙醇溶液冲洗 ； 再用 30L70的乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂 柱并收集本次冲洗的洗脱液， 将洗脱液 60浓缩得浸膏。 0020 (3) 浸膏拌样硅胶粉， 采用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1， 取 下层进行硅胶柱层析， 再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1 为展开体 系， 取下层进行TLC层析， 收集硅胶柱层析迁移率为0.2-0.3的组分， 收集组分50浓缩， 真 空干燥。 0021 (4) 干燥组分利用乙腈水溶液溶。
22、解， 利用 HPLC， 203nm 紫外光吸收， 45的乙腈流 说 明 书 CN 102060905 B 5 4/4 页 6 动相层析， 收集主峰， 真空干燥得海参皂苷 Holotoxin A1对照品。 0022 通过上述步骤所得海参皂苷 Holotoxin A1纯度达 98以上。 0023 实施例 2 ： 0024 (1) 收集新鲜刺参加工废液 2000L， 65第一次减压浓缩， 浓缩至体积 200L， 固形 物含量为 13， 然后加入 95的乙醇 70L， 静置后取上清液。 0025 (2) 上清液以 2 倍柱体积的流速通过 AB-8 型大孔吸附树脂柱， 过柱完毕后， 利用 50L 的纯净。
23、水冲洗和 20L20的乙醇溶液冲洗 ； 再用 30L70的乙醇溶液冲洗大孔吸附树脂 柱并收集本次冲洗的洗脱液， 将洗脱液 50浓缩得浸膏。 0026 (3)浸膏拌样硅胶粉， 采用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水2241取下 层进行硅胶柱层析， 再利用甲醇二氯甲烷乙酸乙酯水 2 2 4 1 为展开体系， 取下层进行 TLC 层析， 收集硅胶柱层析迁移率为 0.2-0.3 的组分， 收集组分 60浓缩， 真空 干燥。 0027 (4) 干燥组分利用乙腈水溶液溶解， 利用 HPLC， 203nm 紫外光吸收， 50的乙腈流 动相层析， 收集主峰， 真空干燥得海参皂苷对照品 Holotoxin A1。 0028 通过上述步骤所得海参皂苷 Holotoxin A1纯度达 98以上。 说 明 书 CN 102060905 B 6 。