从红豆杉植物细胞培养液中初分离紫杉醇的方法 本发明涉及一种植物细胞工程，特别是一种从红豆杉植物细胞培养液中初分离紫杉醇的方法。
紫杉醇是从红豆杉植物树皮中提取分离出来的二萜类生物碱，经临床试验证明对治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等有明显疗效，美国、中国、加拿大等国相继批准紫杉醇为抗癌新药上市。由于目前提取紫杉醇的原料都来自红豆杉的树皮或枝叶，资源稀少，药价昂贵。因此，开辟和提高紫杉醇生产的研究，成为公众关注的焦点。
我们在应用红豆杉植物细胞培养生产紫杉醇的研究开发中发现，细胞中合成的紫杉醇70～80％均排放在培养液中，且大部分被培养液中的胶体微粒所吸附。通常采用直接进行液-液萃取的方法初分离紫杉醇，如应用1吨的反应器进行培养，每次便有800升以上的培养液，用等体积的二氯甲烷萃取三次，合并后的体积便有2400立升，然后挥去溶剂得到紫杉醇的浓缩物，完成这个过程需要大型的萃取和回收溶剂的设备，消耗大量的有机溶剂和能源，且萃取过程中易形成乳化现象，使分离工作更加困难。这种方法存在分离过程长、工艺复杂、成本高、效率低的问题。
本发明的目的就是提供一种经济、简便、可靠、快速从红豆杉植物细胞培养液中初分离紫杉醇的方法。
本发明从红豆杉植物细胞培养液中初分离紫杉醇地方法：(1)在红豆杉培养液中加入絮凝剂，搅拌均匀后絮凝、澄清；(2)过滤后得到富集紫杉醇的浓缩物。絮凝剂是硫酸铝，每升培养液中加入0.25～2.0克。絮凝剂可以是硫酸铝与海藻酸钠的组合物，每升培养液中加入0.25～2.0克硫酸铝与0.005～0.25克海藻酸钠。絮凝剂还可以是硫酸铝与卡拉胶的组合物，每升培养液中加入0.25～2.0克硫酸铝与0.005～0.25克卡拉胶。红豆杉植物的细胞培养液是中国红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉、短叶红豆杉或杂种红豆杉植物的细胞培养液。
本发明在红豆杉植物细胞培养液中加入絮凝剂，搅拌便迅速絮凝，经过滤后便可得到富集紫杉醇的浓缩物。它具有简便、可靠、成本低、效率高的优点，且不产生三废污染。
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述。
实验材料：硫酸铝(明矾)、海藻酸钠、卡拉胶(化学纯)，红豆杉植物细胞培养液是由红豆杉细胞经20～50天悬浮培养后，经120目筛过滤后所获得的滤液。滤速测定采用普通玻璃漏斗和定性滤纸(11cm，杭州新华纸业有限公司)。
实施例一
硫酸铝的试验：
量取一定体积的红豆杉植物细胞培养液，加入不同体积含2％及含1％硫酸铝，搅拌均匀后，观察其絮凝及过滤情况，结果如下(h表示小时，min表示分钟，下同)：
含2％硫酸铝用于红豆杉细胞培养液的絮凝与过滤试验培养液体积 硫酸铝用量 絮凝时间滤纸过滤速度中国红豆杉10ml 1ml 10min 3min滤完云南红豆杉10ml 1ml 15min 5min滤完东北红豆杉10ml 1ml 10min 2.5min滤完中国红豆杉10ml 0ml 无 5h滤完
含1％硫酸铝用于中国红豆杉细胞培养液的絮凝与过滤试验培养液体积 硫酸铝用量 絮凝时间滤纸过滤速度 20ml 0.5ml 15min 10min滤完 20ml 1.0ml 10min 3min滤完 20ml 1.5ml 11min 3min滤完 20ml 2.0ml 10min 2min滤完
实施例二
硫酸铝与卡拉胶组合的试验：
量取一定体积的中国红豆杉植物细胞培养液，加入不同浓度的硫酸铝与卡拉胶，搅拌均匀后，观察其絮凝及过滤情况，结果如下：
含1％硫酸铝与含1％卡拉胶组合用于红豆杉细胞培养液的絮凝与过滤试验 培养液体积 硫酸铝用量 卡拉胶用量絮凝时间 滤速测定 20ml 1ml 0.1ml立即絮凝12min滤完 20ml 1ml 0.2ml立即絮凝11min滤完 20ml 1ml 0.3ml立即絮凝10min滤完 20ml 1ml 0.4ml立即絮凝10min滤完
含1％硫酸铝与含0.1％卡拉胶组合用于中国红豆杉细胞培养液的絮凝与过滤试验 培养液体积 硫酸铝用量 卡拉胶用量絮凝时间滤速测定 20ml 1ml 0.1ml立即絮凝5min滤完 20ml 1ml 0.2ml立即絮凝4min滤完 20ml 1ml 0.3ml立即絮凝5min滤完 20ml 1ml 0.4ml立即絮凝3min滤完 20ml 1ml 0.5ml立即絮凝3min滤完
实施例三
硫酸铝与海藻酸钠组合的试验
量取一定体积的中国红豆杉细胞培养液，加入不同浓度的海藻酸钠，搅拌后，观察其絮凝及过滤情况，结果如下：
含1％硫酸铝与含1％海藻酸钠组合用于红豆杉细胞培养液的絮凝与过滤试验培养液体积硫酸铝用量海藻酸钠用量絮凝时间滤速测定 20ml 1ml 0.1ml立即絮凝6min滤完 20ml 1ml 0.2ml立即絮凝6min滤完 20ml 1ml 0.3ml立即絮凝5min滤完 20ml 1ml 0.4ml立即絮凝4min滤完
含1％硫酸铝与含0.1％海藻酸钠组合用于红豆杉细胞培养液的絮凝与过滤试验培养液体积硫酸铝用量海藻酸钠用量絮凝时间滤速测定 20ml 1ml 0.1ml立即絮凝5min滤完 20ml 1ml 0.2ml立即絮凝4min滤完 20ml 1ml 0.3ml立即絮凝2min滤完 20ml 1ml 0.4ml立即絮凝3.5min滤完
从以上实施例可以看出，组合的絮凝剂在絮凝、澄清、过滤方面优于单一的絮凝剂。
实施例四
絮凝处理与未经絮凝处理的红豆杉细胞培养液中紫杉醇含量测定试验：
量取一定体积细胞培养液，用等体积二氯甲烷萃取三次，合并后回收二氯甲烷，残渣用少量甲醇溶解、定容样品。样品检测采用Waters515HPLC系统；流动相为甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)；流速1.0ml/分；检测波长227nm。标准品购自SIGMA公司。
经絮凝处理的红豆杉细胞培养液过滤，进行固液分离。分别测定固相与滤液中的红豆杉含量，二者之和为培养液中的紫杉醇含量。测定结果如下：被试培养液絮凝操作前紫杉醇含量 絮凝操作后紫杉醇含量固相中紫杉醇含量液相中紫杉醇含量 总含量中国红豆杉 54.8mg/L 47.7mg/L 5.39mg/L 53.09mg/L云南红豆杉 11.7mg/L 12.6mg/L 1.38mg/L 13.98mg/L东北红豆杉 0.95mg/L 0.68mg/L 0.26mg/L 0.94mg/L
经HPLC检测表明，絮凝处理和未经絮凝处理的培养液中紫杉醇含量无明显变化，说明絮凝处理对紫杉醇不产生不利反应。