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1、(10)授权公告号 CN 101717452 B (45)授权公告日 2011.08.03 CN 101717452 B *CN101717452B* (21)申请号 200910023912.X (22)申请日 2009.09.14 C08B 37/00(2006.01) (73)专利权人 西北工业大学 地址 710072 陕西省西安市友谊西路 127 号 (72)发明人 尚晓娅 钦传光 徐春兰 牛卫宁 钞愈 (74)专利代理机构 西北工业大学专利中心 61204 代理人 王鲜凯 CN 1884571 A,2006.12.27,说明书第2页第 3 段至第 13 页倒数第 2 段 . CN 1。
2、490338 A,2004.04.21,说明书第1页第 3 段至第 4 页第 1 段 . JP 第2646361号 B2,1997.08.27,说明书第 1 栏第 2 段至第 4 栏第 7 段 . CN 101249131 A,2008.08.27,说明书第2页 第 3 段至第 7 页第 3 段 . Zhaojing Wang et al.“Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide purified from Gynostemma pentaphyllum Makino” .Carbohydrate Poly。
3、mers .2006, 第 68 卷 54-58. 宋淑亮等. “绞股蓝多糖的提取纯化和含量测 定” . 中药材 .2006,第29卷(第6期),595-598. 宋淑亮等 .“绞股蓝多糖的分离纯化及初 步结构分析” .中药材 .2008, 第 31 卷 ( 第 3 期 ),454-456. 张钟等 .“绞股蓝多糖的提取及理化性质研 究” .中国林副特产 .2007,( 第 6 期 ),1-4. (54) 发明名称 一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种在绞股蓝中制备中性多糖的 方法， 其特征在于中性多糖的制备由 3 步实现 ： 先 加入乙醇提取绞股蓝浓缩液真空干燥，。
4、 得到棕褐 色秦巴绞股蓝粗多糖 ； 将绞股蓝粗多糖溶于水， 加入木瓜蛋白酶反应、 离心， 收集上清液， 透析， 加入乙醇沉淀多糖， 离心收集多糖， 冷冻干燥， 得 到白色绞股蓝精制多糖 ； 将绞股蓝精制多糖溶 于水， 上阴离子交换柱， 依次用蒸馏水、 NaCl 溶 液梯度洗脱， 再上凝胶柱， 用 NaCl 溶液洗脱， 收 集主峰， 经透析后冷冻干燥得到绞股蓝中性多糖 GPMPA， 它是由鼠李糖、 阿拉伯糖、 甘露糖、 葡萄糖 和半乳糖组成的吡喃糖。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 严艳 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页。
5、 附图 2 页 CN 101717452 B1/1 页 2 1. 一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法， 其特征在于中性多糖的制备由 3 步实现 ： 先 自绞股蓝中制备得到粗多糖， 然后制得精制多糖， 由精制多糖制备得到中性多糖 ； 具体步骤 如下 ： 步骤 1 ： 将 95乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中， 在 502的温度下搅拌 1 小时， 然 后过滤收集滤渣 ； 再将滤渣采用 95乙醇在 502回流搅拌 1 小时后过滤收集滤渣 ； 再 将滤渣采用 95乙醇在 502回流搅拌 1 小时后过滤收集滤渣 ； 将滤渣自然风干后加入 6-10 倍相对滤渣质量重的蒸馏水， 在 90-95下搅拌 10-12h。
6、， 过滤收集滤液， 重复 2-3 次 ； 将上述每次收集得到的滤液合并， 在 50下抽真空减压浓缩， 在流动水中透析 48h ； 步骤 2 ： 向步骤 1 得到的透析袋的溶液加入 4 倍体积的乙醇， 在 4下保存 10-12h ； 然 后用高速离心机在 5000rpm 离心 10min， 收集其中的沉淀物， 依次采用乙醇、 丙酮和乙醚进 行洗涤， 在 40-45真空干燥 6h， 得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖 ； 步骤 3 ： 将粗多糖加双蒸水配成浓度为 5的水溶液， 用 1mol/L HCl 调节 pH 为 5.5， 加 入粗多糖质量 1/20 的木瓜蛋白酶在 65恒温下搅拌 3h 后加热至 1。
7、00终止酶反应 ； 步骤 4 ： 加入双蒸水将步骤 3 得到的溶液稀释至 0.5， 滴加浓氨水将 pH 值调至 8.0， 于 50边搅拌边逐渐加入 30 H2O2， 搅拌 3 5 小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色， 停 止搅拌在 50下抽真空减压浓缩 ； 步骤 5 ： 向步骤 4 得到的浓缩液加入其体积 1/5 的 sevag 试剂， 震荡 20min， 放入高速 离心机中在 5000rpm 离心 15min ； 离心完后收集上清液， 再加入其体积 1/5sevag 试剂， 重复 5 次 ； 将得到的上清液用蒸馏水透析 48h， 收集透析袋中的溶液， 加入其 4 倍体积的乙醇， 在 4放置 1。
8、0-12h ； 放入高速离心机中在 5000rpm 离心 10min， 离心完后收集沉淀， 依次分别 用乙醇、 丙酮和乙醚洗涤， 冷冻干燥 12h， 得到白色绞股蓝精制多糖 ； 步骤 6 ： 将精制绞股蓝多糖 1g 溶于 50mL 双蒸水， 5000rpm 离心 15min， 取上清， 上 DEAE-52 cellulose 柱， 上样量为交换容量的 10 20 ； 步骤7 ： 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、 01mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱， 收集 合并第一流出物的蒸馏水洗脱液， 在 50下减压浓缩， 蒸馏水透析 48h， 冷冻干燥得到绞股 蓝中性多糖。 2.根据权利要求1所述的在。
9、绞股蓝中制备中性多糖的方法， 其特征在于 ： 所述的步骤1 和步骤 2 采用以下步骤替代 ： 步骤 1 ： 取干燥绞股蓝， 加 6-10 倍重量的蒸馏水， 在 90-95的温度下搅拌与提取 10-12h， 2-3 次 ； 离心后去残渣， 合并前 2 3 次提取的上清液， 浓缩 ； 步骤 2 ： 向步骤 1 所得的提取液中加入 4 体积的工业乙醇， 4放置 ； 离心收集沉淀， 依 次分别用乙醇、 丙酮和乙醚洗涤， 真空干燥， 得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖。 权 利 要 求 书 CN 101717452 B1/4 页 3 一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种在绞股蓝中。
10、制备中性多糖的方法， 尤其是利用秦巴山区天然资源 的秦巴绞股蓝中草药中提取、 分离、 纯化一种中性多糖的方法。 背景技术 0002 绞股蓝 (Gynostemma pentaphyllum Makino) 为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本 植物， 具有增强免疫、 抗肿瘤、 降血压、 降血脂、 抗氧化等作用， 且安全无毒。目前， 全世界已 知绞股蓝植物有 13 种， 我国占 11 种， 其中 7 种为我国独有， 占全部种数的 53.8。绞股蓝 主要分布在亚洲一些国家， 在我国应属陕西绞股蓝资源最为丰富， 主要分布在以秦巴山区 为中心的 37 个县市， 安康、 平利等县市目前已成为我国绞股蓝最大的生。
11、产基地， 所产绞股 蓝品种最为优良。 0003 近年研究发现绞股蓝多糖是绞股蓝的有效活性成分之一， 具有增强免疫、 抗肿瘤、 抗氧化、 降血糖、 抗疲劳等药理作用。 目前国内外对绞股蓝多糖的研究普遍停留在粗多糖水 平， 主要集中在粗多糖提取和生物活性等方面的研究。中国专利公开号 CN1098298A 所述 的绞股蓝多糖的提取技术， 得到的多糖含有蛋白质、 色素等其他成分。中国专利公开号 CN 1490338A 所用技术， 虽然进行了除蛋白处理过程， 但是缺少脱色等程序， 此方法得到的绞股 蓝多糖也只是粗品， 含有大量色素等其他成分。目前尚未分离纯化得到均一的绞股蓝多糖 组分。 发明内容 000。
12、4 要解决的技术问题 0005 为了避免现有技术的不足之处， 本发明提出一种在绞股蓝中制备中性多糖的方 法， 可以制备得到均一的绞股蓝多糖组分。 0006 技术方案 0007 一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法， 其特征在于中性多糖的制备由 3 步实现 ： 先自绞股蓝中制备得到粗多糖， 然后制得精制多糖， 由精制多糖制备得到中性多糖 ； 具体步 骤如下 ： 0008 步骤 1 ： 将 95乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中， 在 502的温度下搅拌 1 小 时， 然后过滤收集滤渣 ； 再将滤渣采用 95乙醇在 502回流搅拌 1 小时后过滤收集滤 渣 ； 再将滤渣采用 95乙醇在 502回流搅拌 1 。
13、小时后过滤收集滤渣 ； 将滤渣自然风 干后加入 6-10 倍相对滤渣质量重的蒸馏水， 在 90-95下搅拌 10-12h， 过滤收集滤液， 重 复 2-3 次 ； 将上述每次收集得到的滤液合并， 在 50下抽真空减压浓缩， 在流动水中透析 48h ； 0009 步骤2 ： 向步骤1得到的透析袋的溶液加入4倍体积的乙醇， 在4下保存10-12h ； 然后用高速离心机在 5000rpm 离心 10min， 收集其中的沉淀物， 依次采用乙醇、 丙酮和乙醚 进行洗涤， 再 40-45真空干燥 6h， 得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖 ； 说 明 书 CN 101717452 B2/4 页 4 0010 步骤。
14、 3 ： 将粗多糖加双蒸水配成浓度为 5的水溶液， 用 1mol/L HCl 调节 pH 为 5.5， 加入粗多糖质量 1/20 的木瓜蛋白酶在 65恒温下搅拌 3h 后加热至 100终止酶反 应 ； 0011 步骤 4 ： 加入双蒸水将步骤 3 得到的溶液稀释至 0.5， 滴加浓氨水将 pH 值调至 8.0， 于50边搅拌边逐渐加入30H2O2， 搅拌35小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色， 停止搅拌在 50下抽真空减压浓缩 ； 0012 步骤 5 ： 向步骤 4 得到的浓缩液加入其体积 1/5 的 sevag 试剂， 震荡 20min， 放入高 速离心机中在 5000rpm 离心 15min。
15、 ； 离心完后收集上清液， 再加入其体积 1/5sevag 试剂， 重 复 5 次 ； 将得到的上清液用蒸馏水透析 48h， 收集透析袋中的溶液， 加入其 4 倍体积的乙醇， 在 4放置 10-12h ； 放入高速离心机中在 5000rpm 离心 10min， 离心完后收集沉淀， 依次分 别用乙醇、 丙酮和乙醚洗涤， 冷冻干燥 12h， 得到白色绞股蓝精制多糖 ； 0013 步骤 6 ： 将精制绞股蓝多糖 1g 溶于 50mL 双蒸水， 5000rpm 离心 15min， 取上清， 上 DEAE-52 cellulose 柱， 上样量为交换容量的 10 20 ； 0014 步骤7 ： 将上述的。
16、离子交换柱依次用双蒸水、 01mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱， 收集合并第一流出物的蒸馏水洗脱液， 在 50下减压浓缩， 蒸馏水透析 48h， 冷冻干燥得到 绞股蓝中性多糖。 0015 有益效果 0016 本发明提出的一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法， 是一种从绞股蓝中提取、 分 离、 纯化的中性多糖的制备方法。 本发明利用多糖、 糖蛋白溶于水的特性， 用水提法浸提， 并 用乙醇分级沉淀法分离， 最后用阴离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化多糖。 附图说明 0017 图 1 秦巴绞股蓝精制多糖的 DEAE-52 cellulose 柱层析 0018 图 2 GPMPA 的 Sephadex G。
17、-100 凝胶柱层析 0019 图 3 9 种单糖标准品糖腈衍生物 GC 图 0020 图 4 GPMPA 糖腈衍生物 GC 图 具体实施方式 0021 现结合实施例、 附图对本发明作进一步描述 ： 0022 本实施例中采用秦巴绞股蓝制备中性多糖。 0023 实施例 1 0024 称取干燥绞股蓝 500g， 加入 2500mL95乙醇， 在 50的温度下搅拌 1 小时， 然后 过滤收集滤渣 ； 再将滤渣采用 95乙醇在 50回流搅拌 1 小时后过滤收集滤渣 ； 再将滤渣 采用 95乙醇在 50回流搅拌 1 小时后过滤收集滤渣 ； 将滤渣自然风干后加入 3000mL 的 蒸馏水， 在 95下搅拌。
18、 10h， 过滤收集滤液， 重复 3 次 ； 将上述每次收集得到的滤液合并， 在 50下抽真空减压浓缩至 1L， 在流动水中透析 48h ； 0025 向透析后的溶液加入 4 倍体积的乙醇， 在 4下保存 12h ； 然后用高速离心机在 5000rpm 离心 10min， 收集其中的沉淀物， 依次采用乙醇、 丙酮和乙醚进行洗涤， 在 40真空 干燥 6h， 得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖 ； 说 明 书 CN 101717452 B3/4 页 5 0026 称取 10g 秦巴绞股蓝粗多糖， 加 200mL 去离子水配成 5粗多糖溶液， ， 用 1mol/ LHCl 调节 pH 为 5.5， 加入 。
19、0.5g 木瓜蛋白酶， 65恒温搅拌 3h 后加热至 100， 保持 6min， 灭活， 终止酶反应 ； 0027 加入 1800mL 双蒸水将溶液稀释至 0.5， 滴加浓氨水将 pH 值调至 8.0， 于 50边 搅拌边逐渐加入 30 H2O2， 搅拌 3 小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色， 停止搅拌， 用醋酸 调节 pH 值至 7.0， 在 50下抽真空减压浓缩至 500mL ； 0028 向浓缩液加入 100mL sevag 试剂， 震荡 20min， 放入高速离心机中在 5000rpm 离心 15min ； 离心完后收集上清液， 再加入其体积 1/5 sevag 试剂， 重复 5 次 。
20、； 将得到的上清液用 蒸馏水透析 48h， 收集透析袋中的溶液， 加入其 4 倍体积的乙醇， 在 4放置 12h ； 放入高速 离心机中在 5000rpm 离心 10min， 离心完后收集沉淀， 依次分别用乙醇、 丙酮和乙醚洗涤， 冷 冻干燥 12h， 得到白色绞股蓝精制多糖 ； 0029 将精制绞股蓝多糖 1g 溶于 50mL 双蒸水， 5000rpm 离心 15min， 取上清， 上 DEAE-52 cellulose 柱， 上样量为交换容量的 10 20 ； 0030 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、 0 1mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 收集合 并第一流出物的蒸馏水洗脱液， 。
21、在 50下减压浓缩， 蒸馏水透析 48h， 冷冻干燥得到绞股蓝 中性多糖。 0031 实施例 2 0032 称取干燥绞股蓝 20kg， 加入 120L 蒸馏水， 投入提取罐中， 在 95下搅拌 10h， 过滤 收集滤液， 重复2次 ； 将上述每次收集得到的滤液合并， 在50下抽真空减压浓缩至40L， 在 流动水中透析 48h ； 0033 向透析后的溶液加入 4 倍体积的工业乙醇， 在 4下保存 10h ； 然后用高速离心机 在5000rpm离心10min， 收集其中的沉淀物， 依次采用乙醇、 丙酮和乙醚进行洗涤， 在45真 空干燥 6h， 得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖 ； 0034 称取 10。
22、g 秦巴绞股蓝粗多糖， 加 200mL 去离子水配成 5粗多糖溶液， 用 1mol/ LHCl 调节 pH 为 5.5， 加入 0.5g 木瓜蛋白酶， 65恒温搅拌 3h 后加热至 100， 保持 6min， 灭活， 终止酶反应 ； 0035 加入 1800mL 双蒸水将溶液稀释至 0.5， 滴加浓氨水将 pH 值调至 8.0， 于 50边 搅拌边逐渐加入 30 H2O2， 搅拌 3 小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色， 停止搅拌， 用醋酸 调节 pH 值至 7.0， 在 50下抽真空减压浓缩至 500mL ； 0036 向浓缩液加入 100mL sevag 试剂， 震荡 20min， 放入高速。
23、离心机中在 5000rpm 离心 15min ； 离心完后收集上清液， 再加入其体积 1/5 sevag 试剂， 重复 5 次 ； 将得到的上清液用 蒸馏水透析 48h， 收集透析袋中的溶液， 加入其 4 倍体积的乙醇， 在 4放置 12h ； 放入高速 离心机中在 5000rpm 离心 10min， 离心完后收集沉淀， 依次分别用乙醇、 丙酮和乙醚洗涤， 冷 冻干燥 12h， 得到白色绞股蓝精制多糖 ； 0037 将精制绞股蓝多糖 1g 溶于 50mL 双蒸水， 5000rpm 离心 15min， 取上清， 上 DEAE-52 cellulose 柱， 上样量为交换容量的 10 20 ； 0。
24、038 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、 0 1mol/L NaCl 溶液线性梯度洗脱， 收集合 并第一流出物的蒸馏水洗脱液， 在 50下减压浓缩， 蒸馏水透析 48h， 冷冻干燥得到得到本 发明的秦巴绞股蓝中性多糖 GPMPA， 如图 1 所示。 说 明 书 CN 101717452 B4/4 页 6 0039 实施例制备的秦巴绞股蓝中性多糖 GPMPA 的理化性质 0040 1. 纯度测定 0041 Sephadex G-100 填料在 100溶胀 5h 后， 用 1.0mol/L NaoH 溶液处理， 以蒸馏水 洗至中性后装柱 ( 柱尺寸为 1.6cm50cm)。装柱后用蒸馏水平衡 48。
25、h。将 GPMPA 50mg 溶 于 5mL 双蒸水， 离心， 取上清， 过柱， 用 0.1mol/L NaCl 溶液洗脱， 流速 0.5mL/min， 自动部分 收集器收集 (3mL/Tube)， 苯酚 - 硫酸法跟踪检测， 将主峰收集合并， 绘制洗脱管数与吸光度 的关系曲线。GPMPA 的 Sephadex G-100 凝胶柱层析洗脱曲线为单一对称峰， 表明该样品纯 度较高， 如图 2 所示。 0042 2. 光谱分析 0043 紫外光谱 ： 取 GPMPA 适量， 去离子水溶解， 配制成浓度为 1mg/mL 的溶液， 在 200-400nm 范围内扫描。GPMPA 的紫外光谱在 260n。
26、m 和 280nm 处无吸收峰， 表明不含核酸和 蛋白质。 0044 红外光谱 ： 取GPMPA适量， 溴化钾压片， 4000-400cm-1区间扫描。 IR光谱解析如下 ： 3407(O-H)， 2920(C-H)， 1638(C O)， 1452(C-O)。GPMPA 在 866cm-1处出现吸收峰， 是吡喃 环的特征吸收， 说明 GPMPA 是吡喃糖。 0045 3. 单糖组成测定 0046 称取 20mg 固体糖样、 10mg 盐酸羟胺和 5mg 内标 ( 肌醇六乙酸酯 )， 加入 2mL 吡啶， 放入 90水浴中加热反应 30min 并振荡。取出后冷至室温， 加入 1mL 乙酸酐， 。
27、在 90下继 续反应 30min 进行乙酰化， 反应产物直接进行气相色谱分析。 0047 用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法对 9 种单糖标准品及 GPMPA 进行 GC 分析 ( 安捷 伦 6890)， 气相色谱分析条件如下 ： 0048 色谱柱 ： 石英毛细管柱 DB-1701 ； 氢火焰离子化检测器 (FID) ； 柱温 ： 110， 3min 20 /min 210， 30min ； 气化室温度 ： 280； 监测器温度 ： 280； H2流速 ： 40mL/ min ； 空气流速 ： 400mL/min ； N2流速 ： 1.0mL/min。 0049 气相色谱分析结果如图4所示， 对照单糖标准品色谱图(图3)可知， GPMPA由鼠李 糖(9.9)、 阿拉伯糖(15.73)、 甘露糖(8.31)、 葡萄糖(40.34)、 半乳糖(25.72) 组成。 说 明 书 CN 101717452 B1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101717452 B2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 。