本分案申请为申请号：201410049382.7，发明名称：两株纤维堆囊菌的转化方法，申请 日：2014年02月12日的专利申请的分案申请。
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及两株纤维堆囊菌的转化方法。
背景技术：
纤维堆囊菌是一种能降解利用纤维素的粘细菌，由于纤维堆囊菌能产丰富的活性代谢产 物而受到广泛关注，据报道，纤维堆囊菌活性次级代谢产物占粘细菌中发现总量的48.4％。 如纤维堆囊菌生产的埃博霉素具有很强的抗肿瘤活性。因此，通过建立适当的遗传操作体系， 利用基因工程手段提高其次级代谢产物产量具有十分重要的意义，但由于纤维堆囊菌极易成 团，生长缓慢，而且缺乏适合的遗传操作载体，因此对于纤维堆囊菌的遗传操作改造进展较 为缓慢。夏志洁等(XiaZ-J,WangJ,HuW,LiuH,GaoX-Z,WuZ-H,ZhangP-Y,LiY-Z. ImprovingconjugationefficacyofSorangiumcellulosumbytheadditionofdualselection antibiotics.Journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2008,35(10):1157-1163)利用结合 转移和自然转化等方法将外源基因转入纤维堆囊菌，但重组质粒构建及转换过程耗时较长， 虽然1992年Jaoua等(Jaoua,S.,S.Neff,T.Schupp.TransferofmobilizableplasmidstoSorangium cellulosumandevidencefortheintegrationintothechromosome.Plasmid,1992,(28):157-165)建 立了利用IncPCR质粒pME305介导PSJB55结合转移至菌株Soce26中，但由于纤维堆囊菌 的菌株特异性，该方法并不适用于其他菌株。因此完善纤维堆囊菌的转化方法，建立纤维堆 囊菌的遗传操作体系对于促进纤维堆囊菌的基因工程改造以获得更多的活性次级代谢产物就 显得十分必要。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种纤维堆囊菌SoceM1的转化方法，利用该方法可以成功 的将外源基因转入纤维堆囊菌SoceM1中，为建立纤维堆囊菌的遗传操作体系并促进纤维堆 囊菌的基因工程改造奠定基础，从而提高纤维堆囊菌中活性次级代谢产物的丰度和产量。
本发明的纤维堆囊菌SoceM1的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：制备纤维堆囊 菌SoceM1的原生质体，将外源基因与质粒PBEP43连接构建重组质粒PBEP43-外源基因， 然后将重组质粒PBEP43-外源基因利用PEG介导转化至纤维堆囊菌SoceM1的原生质体中。
所述的外源基因为透明颤菌血红蛋白基因vgb。
具体步骤优选为：
a.原生质体的制备：以体积分数2.5％的接种量将纤维堆囊菌SoceM1接种至液体培养 基，培养至对数生长期，离心得到菌体，用PBS溶液洗涤2次，再用体积分数14％甘露醇溶 液充分悬浮SoceM1细胞，然后用质量分数15％EDTA溶液处理细胞30min，PBS洗涤，再 用3mg/ml溶菌酶于30℃作用2h，用体积分数14％甘露醇溶液充分洗涤以去除残留酶液，得 到纤维堆囊菌SoceM1的原生质体；
b.原生质体的转化：在纤维堆囊菌SoceM1的原生质体中加入重组质粒PBEP43-vgb，于 冰上混合30min，加入体积分数40％PEG溶液于30℃作用10min,然后于含体积分数10％甘 露醇的液体培养基中复壮24h，涂布于含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的固 体平板，经筛选得到含有重组质粒PBEP43-vgb的纤维堆囊菌SoceM1。
所述的质粒PBEP43为带有P43强启动子和终止子以及氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PBEP43。
本发明的第二个目的是提供纤维堆囊菌SoceM6的转化方法，其特征在于，包括以下步 骤：将外源基因与质粒PLA2917连接构建重组质粒PLA2917-外源基因，然后将带有重组质 粒PLA2917-外源基因的供体菌、含质粒PRK2013的帮助菌和纤维堆囊菌SoceM6的受体菌 混合，经过筛选获得转入有重组质粒PLA2917-外源基因的纤维堆囊菌SoceM6。
所述的外源基因为透明颤菌血红蛋白基因vgb，最好其5’端连有组成型启动子p43，其3’ 端有终止子序列，这样的话，可以转入纤维堆囊菌后无需诱导就能表达发挥其功能。
所述的帮助菌和供体菌可以为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌HB101。
具体步骤优选为：
a.供体菌株的构建：将透明颤菌血红蛋白基因vgb插入到载体PLA2917中，得到重组 质粒PLA2917-vgb，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，作为供体菌；
b.三亲本结合转化法：将含有重组质粒PLA2917-vgb的大肠杆菌DH5α、含有质粒 PRK2013的大肠杆菌DH5α的帮助菌和纤维堆囊菌SoceM6培养至对数生长期前期，按照 供体菌、帮助菌和纤维堆囊菌SoceM6受体菌的细胞总数之比为1:1:2，将上述三种菌混合， 于无抗性平板的滤纸上培养24h，配制浓度为109个/mL的菌液，涂布于含有10μg/mL四环 素和50μg/mL卡那霉素的平板上培养，经筛选得到转入有重组质粒PLA2917-vgb的纤维堆 囊菌SoceM6。
本发明的纤维堆囊菌SoceM1和SoceM6分离自广东的土壤样品，其公开于文献：张 庆波，王磊，章卫民。广东6株纤维堆囊菌的分离与鉴定。吉林农业大学学报，2010，32(4)： 387-393，该菌种本发明人也持有，保证自本发明的申请日起20年内向公众提供。
鉴于目前纤维堆囊菌的转化方法和可用质粒载体相对较少，因此本发明选用带双抗性的 穿梭质粒载体和广宿主载体分别将外源基因(vgb)导入至两株纤维堆囊菌中，为建立纤维堆 囊菌的遗传操作体系并促进纤维堆囊菌的基因工程改造奠定基础，从而提高纤维堆囊菌中活 性次级代谢产物的丰度和产量。
附图说明：
图1为SoceM1的阳性克隆平板。
图2为SoceM1的PCR鉴定图，M：DL2000DNAmarker，lane1:空白对照，lane2：重组So ceM1阳性克隆PCR，lane3:以重组质粒PBEP43-vgb为模板PCR。
图3为SoceM1和SoceM6阳性克隆用vgb基因引物的测序结果在NCBI数据库比对结果图。
具体实施方式：
以下将参照附图，结合具体实施例对本发明进行进一步解释。但实施例本身对发明不做 任何形式的限定。
实施例1：纤维堆囊菌SoceM1的原生质体转化，包含如下步骤：
(1)原生质体的制备：按如下配方配制液体培养基：8g/L马铃薯淀粉，2g/L葡萄糖，2g/L 大豆蛋白酶解物，2g/L酵母提取物，8mg/LEDTA铁钠，1g/LMgSO4.7H2O，1g/LCaCl2，0.5g/L Tris，溶剂为水，用盐酸调pH至7.4。115℃，25min灭菌。以2.5％的接种量将纤维堆囊菌 SoceM1接种至30ml液体培养基，30℃，180rpm培养至OD595nm为0.8左右，8000rpm离 心10min得到菌体，用PBS溶液洗涤2次，再用14％甘露醇溶液充分悬浮SoceM1细胞， 然后用15％EDTA溶液处理细胞30min，PBS洗涤，再用1mlPBS悬浮菌体，加入100μl3mg/ml 溶菌酶于30℃作用2h，8000rpm离心10min，用14％甘露醇溶液充分洗涤以去除残留酶液， 取样镜检原生质体的制备情况，得到原生质体。
(2)原生质体的转化：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒PBEP43的构建方法公开于文 献：罗文华，郭勇，韩双艳。豆豉纤溶酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高水平表达。应用与环 境生物学报，2007，13(4)：565-569，使用SalI和BamHI分别对PBEP43和vgb基因进行双 酶切，连接，构建重组质粒PBEP43-vgb。在原生质体中加入重组质粒PBEP43-vgb3μL，于 冰上混合30min，加入1ml40％PEG溶液于30℃作用10min,然后加入2ml含10％甘露醇的 液体培养基中复壮24h，涂布于含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的固体平板， 于30℃培养7天左右。
(3)挑取含抗性平板上的阳性克隆菌落(如图1所示)，于含有50μg/mL卡那霉素和 100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中扩大培养，待菌液生长至对数生长期时，进行菌液PCR。
其反应体系如下：
上、下游引物分别如SEQIDNO.1和2所示
PCR扩增程序如下：
所得PCR产物于4℃保存待用，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如图2所示，可以 得到与阳性对照一致的大小为440bp的vgb基因片段，对此片段切胶回收，送至华大进行测 序。测序结果于NCBI数据库中比对，比对结果表明该片段为vgb基因(GenBankaccession： AF292694)(图3)，由此说明重组质粒PBEP43-vgb转入了纤维堆囊菌SoceM1中。
实施例2：纤维堆囊菌SoceM6的三亲本结合转化，包含如下步骤：
(1)重组质粒的构建：在透明颤菌血红蛋白基因vgb基因两端加上HindIIII和PstI酶切位 点，用HindIIII和PstI对vgb基因和广宿主载体PLA2917进行双酶切，16℃连接过夜，转化 至DH5α感受态细胞，挑取单克隆扩大培养，菌液PCR鉴定并送测序。
(2)三亲本结合法转化外源质粒：分别接种含有PLA2917-vgb的供体菌、含质粒PRK2013 的帮助菌(在DH5α菌株中)和SoceM6受体菌，待供体菌和帮助菌的OD为0.6左右，受 体菌的OD为0.8左右，将三种菌以细胞总数比例为供体菌：帮助菌：受体菌＝1:1:2的比例混 和，涂布至含有0.22μm滤膜的无抗性固体平板上，30℃培养24h，从滤膜上冲洗菌体，配制 成浓度为109个/ml的菌液，取100μL涂布至含有10μg/mL四环素和50μg/mL卡那霉素的平 板上于30℃培养。
(3)阳性克隆的鉴定：挑取含抗性平板上的菌落，于含有10μg/mL四环素和50μg/mL 卡那霉素的液体培养基(8g/L马铃薯淀粉，2g/L葡萄糖，2g/L大豆蛋白酶解物，2g/L酵母提 取物，8mg/LEDTA铁钠，1g/LMgSO4.7H2O，1g/LCaCl2，0.5g/LTris，溶剂为水，用盐酸 调pH至7.4。115℃，25min灭菌)中扩大培养，待菌液生长至对数生长期时，进行菌液PCR。
其反应体系如下：
上、下游引物分别如SEQIDNO.1和2所示。
PCR扩增程序如下：
所得PCR产物于4℃保存待用，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，可以得到与阳性对 照一致的大小为440bp的vgb基因片段，对此片段切胶回收，送至华大进行测序。测序结果 于NCBI数据库中比对，比对结果表明该片段为vgb基因(GenBankaccession：AF292694) (图3)
由此说明，经过本实施例的三亲本结合转化方法，成功的将PLA2917-vgb转入了纤维堆 囊菌SoceM6中。