技术领域
本发明涉及通过发酵由原料化合物制造化工产品的方法及装置。
背景技术
已经提出有经过采用微生物的发酵工序制造各种化工产品的方法。例 如，下述专利文献1中记载有通过采用特定的裂殖酵母的发酵由糖类制造乳 酸的方法。
下述专利文献2的实施例中记载有通过下述方法来连续地制造乳酸的 方法：通过向发酵槽中供给微生物和培养基(原料糖和硫酸铵)并进行培养 而生成乳酸，对从发酵槽取出的发酵液进行膜分离而分离出乳酸和微生物 后，让该微生物回到发酵槽。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2011/021629号
专利文献2:国际公开第2012/077742号
发明内容
发明所要解决的技术问题
然而，专利文献2记载的方法中，发酵槽内的发酵液中存在一定浓度的 原料糖，对该发酵液进行膜分离而得的透过液(分离液)中不仅包含化工产 品，还包含原料糖，因此还需要用于对该透过液中的化工产品与原料糖进 行分离的纯化工序。该透过液中所含的原料糖越多，则原料糖的利用效率 越低，纯化工序的负担也越大。
本发明鉴于所述情况而完成，其目的在于提供化工产品的制造方法及 用于该方法的制造装置，所述方法是通过发酵由原料化合物制造化工产品 的方法，对发酵液进行分离而获得包含化工产品的分离液时，可减少该分 离液中所含的原料化合物的量。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明为以下的[1]～[8]。
[1]化工产品的制造方法，其特征在于，包括：
向含有菌体的液体中供给原料化合物和氧进行发酵，获得包含通过发 酵生成的化工产品的第一发酵液的第一发酵工序；
取出所述第一发酵液作为第二发酵液，在不供给原料化合物的情况下 向该第二发酵液中供给氧进行发酵，使该第二发酵液中的原料化合物的浓 度达到比所述第一发酵液中的原料化合物的浓度(X)低的浓度(Y)的第二发 酵工序；
取出所述原料化合物的浓度为所述浓度(Y)的第二发酵液作为第三发 酵液，将该第三发酵液分离为包含所述化工产品且不含菌体的分离液和包 含菌体的非分离液，获得包含所述化工产品的分离液的分离工序。[2]如 [1]所述的化工产品的制造方法，其中，还包括：将所述分离工序中所得的 包含菌体的非分离液供给至第一发酵工序的返回送液工序。
[3]如[1]或[2]所述的化工产品的制造方法，其中，所述第一发酵液 中的所述原料化合物的浓度(X)为5～500g/L，且所述第二发酵液中的所述 原料化合物的浓度(Y)为所述浓度(X)的80％以下。
[4]如[1]～[3]中的任一项所述的化工产品的制造方法，其中，所述 第一发酵液的溶存氧浓度为10～300ppb，且所述第二发酵液的溶存氧浓度 为10～6000ppb。
[5]化工产品的制造装置，其特征在于，具备：第一发酵部、分离部 和设于所述第一发酵部与所述分离部之间的第二发酵部，
所述第一发酵部具有向含有菌体的液体中供给原料化合物的单元以及 向该含有菌体的液体中供给氧的单元，获得包含通过发酵生成的化工产品 的第一发酵液；
所述分离部具有分离单元，通过分离获得包含所述化工产品且不含菌 体的分离液和包含所述菌体的非分离液；
所述第二发酵部具有从所述第一发酵部取出所述第一发酵液作为第二 发酵液并将该第二发酵液向所述分离部送液的流路、以及向所述第二发酵 液中供给氧的单元，在不向所述第二发酵液供给所述原料化合物的情况下 进行发酵，使该第二发酵液中的原料化合物的浓度达到比所述第一发酵液 中的原料化合物的浓度(X)低的浓度(Y)[6]如[5]所述的化工产品的制造装 置，其中，所述第一发酵部具备第一发酵槽，所述第二发酵部具备第二发 酵槽。
[7]如[5]或[6]所述的化工产品的制造装置，其中，所述分离部具备 从所述分离单元取出包含菌体的液体并再次供给至分离单元的循环路。
[8]如[5]～[7]中的任一项所述的化工产品的制造装置，其中，还具 备将包含所述菌体的非分离液从所述分离部向所述第一发酵部供给的返回 送液部。
发明的效果
如果采用本发明，则在通过发酵由原料化合物制造化工产品的方法中， 对发酵液进行分离而获得包含化工产品的分离液时，可减少该分离液中所 含的原料化合物的量。藉此，可使原料化合物的利用效率提高。此外，纯 化分离液时应除去的原料化合物的量减少，因此纯化工序的负担减轻。
附图说明
图1是表示本发明的化工产品的制造装置的一种实施方式的构成示意 图。
图2是表示本发明的化工产品的制造装置的一种实施方式的构成示意 图。
具体实施方式
＜化工产品的制造装置＞
本发明的化工产品的制造装置具备第一发酵部、第二发酵部及分离部。 本发明的化工产品的制造装置较好是还具备返回送液部。
图1和图2是表示适合于实施本发明的化工产品的制造方法的化工产品 的制造装置的一种实施方式的构成示意图。以下的制造装置的说明中，使 用图1(部分使用图2)进行说明。
本实施方式的化工产品的制造装置大致由具备第一发酵槽10的第一发 酵部1、具备第二发酵槽20的第二发酵部2、具备分离单元30的分离部3及从 分离部3向第一发酵部1送液的返回送液部4构成。
本实施方式的装置中，形成如下的循环体系：第一发酵槽10中得到的 发酵液经过第二发酵槽20后，在分离部3被分离，包含菌体的非分离液经返 回送液部4返回第一发酵槽。
本说明书中，发酵是指使用菌体转化原料化合物而获得作为目标的化 工产品的处理。本说明书中的发酵液是指经发酵的液体，包含菌体和通过 发酵生成的化工产品。此外，发酵液中可包含原料化合物。
第一发酵液是指存在于第一发酵部1的内部的包含菌体和化工产品的 液体。此外，第二发酵液是指从第一发酵部1被取出至到达分离部3为止的 存在于第二发酵部2的内部的包含菌体和化工产品的液体。此外，第三发酵 液是指存在于分离部3的内部的包含菌体和化工产品的液体。
[第一发酵部]
本发明所述的第一发酵部具有向含有菌体的液体中供给原料化合物的 单元以及向该含有菌体的液体中供给氧的单元，获得包含通过发酵生成的 化工产品的第一发酵液。第一发酵部较好是具备第一发酵槽。该含有菌体 的液体至少含有菌体即可，除了菌体之外，还可含有通过发酵生成的化工 产品。此外，除了菌体之外，还可含有原料化合物。
图1中所示的实施方式中，第一发酵部1具备第一发酵槽10。第一发酵 槽10具备向槽内供给原料化合物的原料供给单元7、向槽内供给菌体的菌体 供给单元8、向槽内供给氧的氧供给单元6。
本实施方式中，氧供给单元6也可向第二发酵部2和分离部3分别供给 氧。即，氧供给单元6也兼作第二发酵部2的氧供给单元和分离部的氧供给 单元。
此外，虽然未图示，但第一发酵槽10具备将槽内均匀混合的混合单元、 从槽内排出剩余气体的气体排出单元、将槽内的液温保持于规定温度的温 度调节单元。
另外，虽然未图示，但第一发酵槽10具备对槽内的液体中的氧浓度、 原料化合物的浓度和菌体的浓度进行监控的装置。设有控制原料供给单元 7、菌体供给单元8和氧供给单元6的控制单元，使得从该监控装置得到的值 保持恒定。
第一发酵槽10的材质和形状无特别限定，可适当使用公知的发酵槽。 本发明中，向液体中导入氧，因此被认为是比较容易发生金属腐蚀的环境。 因此，作为装置的材质，较好是使用玻璃或耐蚀钢。特别是目标化工产品 在液体中呈酸性的情况下，特别好是使用玻璃或耐蚀钢。作为玻璃，装置 全部或部分可采用玻璃制，也可使用搪玻璃制钢。作为耐蚀钢，较好是使 用不锈钢或镍合金。对于材质，较好是对本发明的装置整体采用同样的材 质。但是，分离部采用膜分离单元的情况下，膜的材质如后所述。此外， 第一发酵槽10可密闭，为了防止杂菌从外部侵入，较好是可将内部维持在 规定的加压状态。
作为本实施方式中的第一发酵槽10，优选采用例如气泡塔型发酵槽、 带搅拌叶片的发酵槽、管型发酵槽等。
第一发酵槽10的容量无特别限定，可适当设定。本实施方式中，从容 易获得本实施方式的构成所产生的效果和化工产品的制造效率的角度来 看，第一发酵槽10的容量较好是在0.3L以上，更好是在100L以上，进一步 更好是在1m3以上。从容易进行定期保养和检查的角度来看，该容量的上限 较好是在1000m3以下，更好是在600m3以下。
原料供给单元7具备例如存积含有原料化合物的液体(以下称为含原料 液)的原料槽70、将含原料液从原料槽70向第一发酵槽10送液的含原料液供 给管道71、将含原料液从原料槽70向第一发酵槽10送液的泵71a、调节该泵 71a来控制供给量的控制单元(略去图示)。含原料液在受控的情况下连续或 间歇地被供给至第一发酵槽10。此外，原料槽70可仅设1个，也可设多个。
作为泵71a的调节方法，可例举直接控制泵的动力(电力或频率)的方 法、控制设于泵前后的阀门的口径的方法、设置从泵的吐出侧回到吸入侧 的循环管道并控制该循环管道的流量的方法以及将它们组合的方法等。后 述的泵81a、21a、22a、31a和41a的调节方法也同样。
菌体供给单元8具备例如培养菌体获得培养液(含菌体的液体)并储存 该培养液的培养槽80、将培养液从培养槽80向第一发酵槽10送液的培养液 供给管道81、将培养液从培养槽80向第一发酵槽10送液的泵81a、调节该泵 81a来控制供给量的控制单元(略去图示)。培养液在受控的情况下连续或间 歇地被供给至第一发酵槽10。
培养槽80被供给液体的培养基和菌体，并供给含氧的气体，保持在规 定的培养温度。通过这些操作，使菌体增殖，获得规定的菌体浓度的培养 液。可根据菌体的种类使用公知的培养基和培养条件。
培养基可含原料化合物。该情况下，若通过菌体供给单元8向槽内供给 培养液，则同时供给菌体和原料化合物。
氧供给单元6具备例如将含氧的气体加压并储存的气体储存槽60、将气 体从气体储存槽60向第一发酵槽10输送的气体供给管道61、调节未图示的 阀门来控制供给量的控制单元(略去图示)。氧在受控的情况下连续或间歇 地被供给至第一发酵槽10。氧通常作为气体供给。所供给的气体只要是至 少包含氧且对发酵无不良影响的气体即可。例如，可以是纯氧，也可以是 氧与1种以上除氧以外的气体(空气、氮、二氧化碳、甲烷等)的混合气体， 还可以是空气。由于容易获得，较好是使用空气。
向第一发酵槽10的槽内供给的气体的氧浓度较好是5～50体积％，更好 是15～30体积％。如果该氧浓度在上述范围的下限值以上，则易于供给足 以供菌体利用的量的氧。此外，如果该氧浓度在上述范围的上限值以下， 则提高氧浓度的负荷减少，因此气体的供给变得容易。
作为氧供给单元6，较好是具有通过从第一发酵槽10的下部供给气体而 搅拌该槽内的液体的构成。即，作为第一发酵槽10，较好是气泡塔型发酵 槽。此外，从搅拌效率高这点来看，较好是内部设有导流管的构成。如果 是这样的构成，则可简化大型发酵槽的结构，且容易抑制菌体的损伤，所 以优选。
作为向槽内供给气体的细部的结构，可例举例如多孔分散管(喷头)、 气体喷射装置、气体透过膜型装置等。作为多孔分散管，可示例直线状或 环状的管上设有大量的孔的管型喷头、使用具有大量空隙的烧结金属的烧 结金属型喷头等。作为气体喷射装置，可示例将高压气体从喷嘴喷射的气 体喷射喷嘴型喷射装置、将高压气体和高压液体分别从喷嘴喷射并使其撞 击的二流体喷嘴型喷射装置、以高速液体吸引气体的抽吸型喷射装置等。 特别是气体喷射喷嘴型喷射装置中，还可使用通过对喷嘴形状进行改良而 生成微细气泡(所谓的微气泡或纳米气泡)的装置。作为气体透过膜型装置， 可示例在槽的壁面或用于搅拌的挡板等的一部分使用气体透过膜而通过透 过该透过膜的气体使气体溶存于液体的装置。这些细部结构可组合使用。
此外，第一发酵槽10较好是具有可将滞留在其上部的气体根据需要排 出至槽外的气体排出单元。可回收被排出的气体并再次供给至体系内。
作为发酵槽内的液体中的氧浓度监控设备，可使用常规的溶存氧计。 作为原料化合物和目标化工产品的浓度监控设备，可使用近红外传感器、 氧电极等。此外，也可抽取试样通过高效液相色谱(HPLC)法等进行测定。 作为菌体的浓度监控设备，可使用光学传感器、电容传感器。
[第二发酵部]
本发明所述的第二发酵部具有设于第一发酵部与分离部之间的从第一 发酵部取出第一发酵液作为第二发酵液并将第二发酵液向分离部送液的流 路、以及向第二发酵液中供给氧的单元，在不向第二发酵液供给原料化合 物的情况下进行发酵，使该第二发酵液中的原料化合物的浓度达到比第一 发酵液中的原料化合物的浓度(X)低的浓度(Y)。第二发酵部较好是具备第 二发酵槽。
图1中所示的实施方式中，第二发酵部2具备从第一发酵部1向分离部3 送液的流路(管道)21、22和设于该流路中途的第二发酵槽20。图中，符号 21为连接第二发酵槽20与第一发酵槽10的第一发酵部侧的管道，具备泵 21a。图中，符号22为连接第二发酵槽20与后述的分离部3的循环路31的分 离部侧的管道，具备泵22a。
第二发酵槽20具备向槽内供给氧的氧供给单元6。此外，虽然未图示， 但第二发酵槽20具备将槽内均匀混合的混合单元、从槽内排出剩余气体的 气体排出单元、将槽内的液温保持于规定温度的温度调节单元。
另外，虽然未图示，但第二发酵槽20具备对槽内的液体中的氧浓度、 原料化合物的浓度和菌体的浓度进行监控的装置。设有分别对设于第一发 酵部侧的管道21及分离部侧的管道22的泵21a、22a进行控制的控制单元和 控制氧供给单元6的控制单元，使得从该监控装置得到的值保持恒定。
另外，可适当具备例如pH控制单元、液面水平控制单元等通常的发酵 槽中公知的构成。
第二发酵槽20的材质和形状无特别限定，可适当使用公知的发酵槽。 对于装置的材质，与第一发酵槽10的情况同样。此外，第二发酵槽20可密 闭，为了防止杂菌从外部侵入，较好是可将内部维持在规定的加压状态。
作为本实施方式中的第二发酵槽20，优选采用例如气泡塔型发酵槽、 带搅拌叶片的发酵槽、管型发酵槽等。作为第二发酵槽20，并不一定需要 作为槽具有独立的形状。即，只要是具有供给氧的氧供给单元和可排出多 余气体的单元并可确保发酵液的滞留时间的结构即可。例如，可以是能向 长的管道或粗的管道供给氧并能排出滞留气体的简单形态。但是，作为第 二发酵槽，从需要控制氧浓度和温度的角度来看，较好是具有一定容量的 槽。此外，第二发酵槽20可仅设1个，也可将多个串联或并联设置。特别是 第一发酵槽10和第二发酵槽20为大型槽而送液需要时间的情况下，较好是 并联设置。例如，较好是并联设置3个，可同时进行(1)从第一槽接收原料 化合物浓度高的第二发酵液的工序、(2)持续供给氧并降低原料化合物浓度 的工序、(3)将原料化合物浓度降低的第二发酵液送出至分离部的工序这3 个工序的装置构成。
第二发酵槽20的容量无特别限定，可适当设定。本实施方式中，从容 易获得本实施方式的构成所产生的效果和制造效率的角度来看，第二发酵 槽20的容量较好是在0.3L以上，更好是在100L以上，进一步更好是在1m3以 上。从容易进行定期保养和检查的角度来看，该容量的上限较好是在1000m3以下，更好是在600m3以下。此外，第二发酵槽20相对于第一发酵槽10的容 量(容量比)在将第一发酵槽设为1时较好是0.01～2，更好是0.05～1。如果 在该容量比的下限值以上，则容易降低分离部3中的原料化合物的浓度。此 外，如果该容量比在上限值以下，则容易提高装置效率。
第二发酵槽20中，利用菌体使得第二发酵液中的原料化合物的浓度降 低。通过延长第二发酵槽20中的平均滞留时间(实效容量/平均体积流速)， 可使第二发酵液中的原料化合物的浓度降低。作为该实效容量，以第二发 酵槽20的实效容量(实际填充液体的容量，存在多个第二发酵槽20时为它们 的总容量)与管道21、22的容量的总和来考虑。此外，平均体积流速以从第 一发酵槽10送出的液量为基准考虑。
第一发酵部侧管道21和分离部侧管道22根据需要设有温度调节单元 (未图示)来保持管内的液温为规定的发酵温度。
氧供给单元6具备例如气体储存槽60、将气体从气体储存槽60向第二发 酵槽20输送的气体供给管道62、调节未图示的阀门来控制供给量的控制单 元(略去图示)。氧在受控的情况下连续或间歇地被供给至第二发酵槽20。 氧通常作为气体供给。所供给的气体可使用与供给至第一发酵槽10的记载 同样的气体。
向第二发酵槽20的槽内供给的气体的氧浓度较好是5～50体积％，更好 是15～30体积％。如果该氧浓度在上述范围的下限值以上，则易于供给足 以供菌体利用的量的氧。此外，如果该氧浓度在上述范围的上限值以下， 则提高氧浓度的负荷减少，因此气体的供给变得容易。
作为氧供给单元6，较好是具有通过从第二发酵槽20的下部供给气体而 搅拌该槽内的液体的构成。即，作为第二发酵槽20，较好是气泡塔型发酵 槽。此外，从搅拌效率高这点来看，较好是内部设有导流管的构成。如果 是这样的构成，则可简化大型发酵槽的结构，且容易抑制菌体的损伤，所 以优选。作为向槽内供给气体的细部的结构，可示例与第一发酵槽10的情 况同样的结构。
此外，虽然未图示，但较好是设置对第一发酵部侧管道21和/或分离部 侧管道22内的液体中的氧浓度进行监控的单元，并根据需要设置向第一发 酵部侧管道21和/或分离部侧管道22内供给含氧的气体的单元。气体可使用 与供给至第一发酵槽10的记载同样的气体。
供给至第一发酵部侧管道21和/或分离部侧管道22内的气体的氧浓度 较好是与供给至第二发酵槽20的槽内的气体的氧浓度相同。
例如使用气体供给管道63、64来向第一发酵部侧管道21和/或分离部侧 管道22内供给气体。作为其细部的结构，可示例与第一发酵槽10的情况同 样的结构(例如多孔分散管(喷头)、气体喷射装置、气体透过膜型装置等)。
此外，第二发酵槽20较好是具有可将滞留在其上部的气体根据需要排 出至槽外的气体排出单元。可回收被排出的气体并再次供给至体系内。
此外，作为氧浓度监控设备、原料化合物和目标化工产品的浓度监控 设备以及菌体的浓度监控设备，分别可使用与第一发酵槽10的情况同样的 设备。
[分离部]
本发明所述的分离部具有分离单元，通过分离获得分离液和非分离液。 分离液包含化工产品，且不含菌体。在此，“不含菌体”是指实质上不含， 可含以湿重计在20g/L以下(较好是10g/L以下)的菌体(活菌)。非分离液包 含化工产品，且包含菌体。分离部较好是具备从所述分离单元取出包含菌 体的液体并再次供给至分离单元中的循环路。
图1所示的实施方式中，分离部3具备分离单元30以及将分离单元30的 分离中未分离的非分离液再次供给至分离单元30的循环路31。循环路31与 第二发酵部2的分离部侧管道22连接，在该连接位置与分离单元30之间设有 泵31a。此外，从泵31a的运转容易的角度来看，较好是图2所示在该连接位 置设置缓冲罐32。
作为分离单元30，只要是可将所得的发酵液(第三发酵液:包含菌体和 化工产品的液体)分离为包含化工产品且不含菌体的液体(分离液)和包含 菌体的液体(非分离液)的装置即可，可使用例如膜分离装置、离心分离装 置、萃取分离装置等。分离单元30可仅设1个，也可将多个串联或并联设置。
作为膜分离装置，只要具备透过第三发酵液中的目标化工产品且不透 过菌体的分离膜即可，可适当使用公知的膜分离装置。分离膜可以是有机 膜，也可以是无机膜。作为分离膜的材质，可例举例如聚偏氟乙烯、聚砜、 聚醚砜、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、陶瓷等。其中，从较廉价且耐久 性高、可稳定供给的角度来看，较好是聚砜、聚醚砜。
分离膜的形状无特别限定，可例举例如平板膜、中空丝膜等。
从菌体不易透过、具有较高的透过流束(flux)的角度来看，分离膜较 好是具有平均孔径为0.01～3μm的细孔的多孔膜。分离膜的平均孔径更好 是0.1～0.65μm。
膜分离装置的处理能力(透过流束)也根据装置的规模而不同，例如较 好是1～100L/m2/h，更好是3～30L/m2/h。
作为离心分离装置，只要具备使菌体离心沉降的机构即可，可示例螺 旋沉降器等。离心分离装置的处理能力根据第一发酵槽10的容量等适当选 定。
作为萃取分离装置，只要是可使用萃取剂从发酵液中萃取第三发酵液 中的目标化工产品的装置即可，可示例萃取塔等。作为萃取塔，可示例筛 板萃取塔、填充萃取塔等。作为萃取的形式，可示例逆流萃取、并流萃取。 作为萃取剂，可示例醇、酯、酮、醚、胺等，分别较好是使用碳数为5～40 左右的有机化合物。
循环路31根据需要设有温度调节单元(未图示)来保持管内的液温为规 定的发酵温度。
分离单元30具备排出被分离的分离液的排出管51。该排出管51设有泵 (图示省略)。
此外，较好是设置监控循环路31内的液体中的氧浓度的单元(图示省 略)，并根据需要在循环路31内设置连续或间歇地供给含氧的气体的氧供给 单元6。氧供给单元6较好是设置在循环路31的1处以上的任意位置。例如使 用气体供给管道65来向循环路31内供给气体。作为其细部的结构，可示例 与第一发酵槽10的情况同样的结构。
气体可使用与供给至第一发酵槽10的记载同样的气体。供给至循环路 31的气体的氧浓度较好是与供给至第二发酵槽20的槽内的气体的氧浓度相 同。
[返回送液部]
本发明所述的返回送液部将包含菌体的非分离液从分离部向第一发酵 部供给。
图1中所示的实施方式中，返回送液部4具备管道41(流路)。管道41连 接分离部3的循环路31与第一发酵槽10。图2中所示的实施方式中，返回送 液部4还具备泵41a、管道42和排出管43。管道42从管道41分支，与第二发 酵槽20连接。排出管43将非分离液的一部分连续或间歇地排出。管道41与 循环路31的连接位置设置于循环路31与第二发酵部2的分离部侧管道22的 连接位置同非分离液从分离单元30被排出的出口之间。在管道41上，较好 是于管道41与循环路31的连接位置附近设置流量控制阀。通过该控制阀， 可调整循环路31与管道41的流量平衡。返回送液部4在设有多个分离部3的 情况下可以是汇聚至一处返回第一发酵部的形态，也可以是分别返回第一 发酵部的形态。
此外，虽然未图示，但较好是设置监控管道41内的液体中的氧浓度的 单元，并根据需要在该管道41内设置连续或间歇地供给含氧的气体的氧供 给单元6。氧供给单元6较好是设置在管道41的1处以上的任意位置。例如使 用气体供给管道(图示省略)来向管道41内供给气体。作为其细部的结构， 可示例与第一发酵槽10的情况同样的结构(例如多孔分散管(喷头)、气体喷 射装置、气体透过膜型装置等)。
气体可使用与供给至第一发酵槽10的记载同样的气体。供给至管道41 的气体的氧浓度较好是与供给至第二发酵槽20的槽内的气体的氧浓度相 同。
返回送液部4中，不需要将从分离部3送液的液体全部送回第一发酵部 1。可经由管道42将一部分送回第二发酵部2，也可全部送回第二发酵部。 另外，还可经由排出管43将一部分作为排出液排出。
＜化工产品的制造方法＞
本发明的化工产品的制造方法是通过使用菌体的发酵由原料化合物制 造化工产品的方法。
[菌体]
本发明中的菌体是指具有消耗原料化合物、生产作为目标的化工产品 的能力的生物。作为菌体，可以是天然存在的菌体，也可以是通过突变或 基因重组而改变了部分性质的菌体。发酵中可适当使用公知的菌体。
作为菌体的例子，可例举酵母、大肠杆菌、乳酸菌、丝状菌、放线菌 等。
其中，从化工产品生产性和耐化学品性(醇、酸)良好的角度来看，较 好是酵母。作为酵母，可例举例如酿酒酵母、裂殖酵母等。作为酿酒酵母， 可例举乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyceslactis)、戴尔有孢圆酵母 (Torulasporadelbrueckii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)、 毕赤酵母(Pichiapastoris)等。作为裂殖酵母，可例举粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus)等。上述 裂殖酵母中，粟酒裂殖酵母(以下也记作S.pombe)因可利用它的各种有用 的突变株，因而优选。
[原料化合物]
本发明中，原料化合物是指菌体可直接同化、能通过发酵获得目标化 工产品的化合物。发酵中可适当使用公知的原料化合物。
作为原料化合物的例子，可例举糖类(单糖类(五碳糖、六碳糖)、双糖 类、多糖类)、醇类(甘油等)、氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸等)等。
其中，从作为碳源菌体容易同化的角度来看，较好是糖类。作为糖类 的优选例子，可例举核糖、阿拉伯糖、木糖等五碳糖，葡萄糖、果糖、半 乳糖等六碳糖，蔗糖、海藻糖、纤维二糖、麦芽糖等双糖类，纤维素、淀 粉等多糖类等。其中，更好是六碳糖，特别好是葡萄糖。
菌体仅可同化作为原料化合物的单糖类的情况下，可将双糖类或多糖 类进行预处理后使用。例如，可使用在原料槽中向包含双糖类或多糖类的 原料混合糖化酶而分解得到的单糖类。此外，还可直接使用含大量葡萄糖 等糖类的原料(甘蔗或甜菜的压榨残渣(废蜜)等)。
[含原料液]
含原料液是含有原料化合物的液体(通常为水溶液)。除了原料化合物 之外，还可含有例如K、Na、Mg、Ca、Fe等金属元素，矿物质成分和维生素 类。后述的实施方式中，含原料液不含菌体。
[化工产品]
本发明中，化工产品是指在发酵液中通过菌体生成的化合物。除了作 为目标的化工产品之外，还包括作为副产物的化工产品。
作为化工产品，可例举例如醇、有机酸等。
作为醇的例子，可例举乙醇、2-丙醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丙 二醇、甘油等。
作为有机酸的例子，可例举乙酸、丙二酸、琥珀酸、乙醇酸、乳酸、 苹果酸、酒石酸、柠檬酸、3-羟基丙酸、丙酮酸等。在此，羟基羧酸视作 有机酸。
其中，从通用性高、市场的发展性(合成纤维用途和车载用途、替代塑 料用途等)值得期待的角度来看，优选有机酸，特别好的是乳酸、苹果酸、 琥珀酸、3-羟基丙酸等。
本发明的化工产品的制造方法也可适用于通过形成中和盐等沉淀来获 得化工产品的方法。但是，本发明的制造方法特别适合于在不形成沉淀的 情况下作为水溶液获得化工产品的方法。
此外，本发明的制造方法特别适合作为沸点比水(100℃)高的化工产品 的制造方法。本发明的制造方法中，分离菌体而得的分离液为包含化工产 品的水溶液(化工产品粗制液)的情况下，作为分离所得的化工产品和水的 手段，可考虑采用蒸馏。但是，原料化合物通常在蒸馏中作为高沸点成分 或残渣被分离。这时，作为目标的化工产品的沸点比水低的情况下，通过 蒸馏容易分离。另一方面，作为目标的化工产品的沸点比水高的情况下， 作为目标的化工产品与原料化合物的分离容易变得困难。因此，通过降低 分离液(化工产品粗制液)中所含的原料化合物的浓度，可降低化工产品的 纯化(特别是蒸馏纯化)的负荷。
以下，对使用具有图1的构成的装置通过本发明的制造方法连续地制造 化工产品的一种实施方式进行说明。
[第一发酵工序]
本发明所述的化工产品的制造方法中，在第一发酵工序中，向含有菌 体的液体中供给原料化合物和氧进行发酵，获得包含通过发酵生成的化工 产品的第一发酵液。
本实施方式中，通过预先向培养槽80供给液状的培养基和菌体，在连 续地供给含氧的气体的同时，保持于规定的培养温度，从而获得培养液。 培养槽80内的液体(培养液)中的氧浓度和培养温度受到控制，从而维持在 适合于菌体增殖的培养条件。通常，在适合于菌体增殖的培养条件和适合 于采用发酵的化工产品制造的发酵条件中，优选的氧浓度条件不同。发酵 液中的优选的氧浓度一般比适合于培养的氧浓度条件低。
向第一发酵槽10内通过原料供给单元7供给规定量的含原料液。自原料 供给单元7的供给可连续进行，也可间歇进行。此外，向第一发酵槽10内通 过菌体供给单元8供给规定量的包含菌体的培养液。自菌体供给单元8的供 给可连续进行，也可间歇进行。此外，如后所述，自返回送液部4的管道41 连续或间歇地供给包含菌体的液体(分离单元中未被分离的非分离液)。自 原料供给单元7的含原料液供给量、自菌体供给单元8的包含菌体的培养液 的供给量和自返回送液部4的管道41的包含菌体的液体的供给量的总和(总 供给量)呈一定速度，自管道21送出的发酵液的送液量(送出量)呈一定速 度，且这两者的速度相等的情况下，第一发酵槽10内的液面水平恒定。另 一方面，总供给量和送出量并不需要一直为恒定值，这些值可断续地(间 歇地)反复升高降低。例如，在一定时间内使总供给量为某一值并使送出 量为零，使第一发酵槽内部的液量增加。使总供给量和送出量同时为零， 根据需要经过一定时间。然后，在总供给量保持为零的情况下，使送出量 为某一值。再使总供给量和送出量同时为零，根据需要经过一定时间。通 过反复进行这样的操作，液面水平升高降低。也可采用这样的准分批运转 方法。
将第一发酵槽10内的液温控制为规定的发酵温度，通过氧供给单元6 连续地向该液体中供给含氧的气体的同时，通过原料供给单元7连续或间歇 地供给原料化合物。由此，在该液体中进行发酵，氧和原料化合物被消耗， 生成化工产品(作为目标的化工产品和作为副产品的化工产品)。
第一发酵槽10内的液体通过以气体供给单元13连续地供给气体而产生 的搅拌作用变得大致均匀。第一发酵槽10内的第一发酵液的原料化合物的 浓度设为浓度(X)。刚从第一发酵槽10排出至第一发酵槽侧管道21后(图中 符号A表示的位置，以下称为A点)的第二发酵液中以与第一发酵槽10内的浓 度大致相同的浓度包含生成的化工产品、原料化合物、菌体和氧。即，A点 的第二发酵液的原料化合物的浓度与第一发酵槽10内的第一发酵液的原料 化合物的浓度(X)相同。因此，可对A点的液体采样来测定该浓度(X)。
第一发酵槽10的液体中的菌体(活菌)的量和在第一发酵槽10内的滞留 时间一定的情况下，目标化工产品的收率根据该液体中的氧浓度和原料化 合物的浓度而变化。
因此，控制氧的供给速度和原料化合物的供给速度的同时，根据需要 供给包含菌体的培养液，从而使第一发酵槽10的液体中的菌体(活菌)的量、 氧浓度和原料化合物的浓度保持在可获得良好的化工产品收率的范围内。
本说明书中的收率采用相对于原料化合物的收率。相对于原料化合物 的收率是将所得的化工产品除以所消耗的原料化合物的质量而得的值。例 如，消耗1g葡萄糖而获得0.9g乳酸的情况下，收率为90％。
本说明书中，在发酵槽内的平均滞留时间是将发酵槽的实效容量除以 平均体积流速而得的值。实效容量采用实际填充液体的容量。此外，平均 体积流速采用从发酵槽送出的单位时间的发酵液容量。第一发酵槽的情况 下，连续运转中，以单位时间内供给至发酵槽的液体(含原料液、培养液和 回送液)的总量与从发酵槽送出的发酵液容量相等的条件运转。
发酵槽10内的活菌的量通过事先的发酵试验求出优选的范围。即，通 过试验求出优选的活菌的菌体密度，乘以发酵槽10的实效容量作为活菌量。 菌体密度也根据菌体的种类和培养条件而不同，但为了控制发酵槽10的容 量，较好是进行密度高至一定程度的发酵。
发酵槽10内的氧浓度通过事先的发酵试验求出优选的范围。特别是本 发明的情况下，发酵中必须供给氧。但是，一般如果升高氧浓度，则原料 化合物的消耗速度加快，但作为目标的化工产品的生产速度并不加快，而 是优先发生菌体的增殖。因此，发酵槽10内的氧浓度较好是控制在较低的 值。
在发酵槽10内的平均滞留时间基于发酵速度算出。发酵速度采用单位 时间、单位菌体量的原料化合物的消耗速度。原料化合物的消耗速度通过 事先的发酵试验求出优选的范围。消耗速度受到原料化合物浓度的影响的 情况下，求出作为目标的原料化合物浓度区域内的消耗速度。
发酵槽10内的原料化合物浓度以低至消耗速度不会极度下降的程度的 条件确定。如果该原料化合物浓度设得过低，则发酵速度容易下降。此外， 如果该原料化合物浓度设得过高，则原料化合物的利用效率下降。
通过考虑到如上所述的条件设定各个值，可提高作为目标的化工产品 的生产速度。特别好是加快单位时间、发酵槽的单位体积的化工产品的生 产速度。但是，各个控制要素(原料化合物的供给速度、氧的供给速度、温 度、pH和自发酵槽的发酵液的送出速度等)互相影响，所以最终该发酵槽的 最适值应通过实际的运转来适当调整。
例如，使用酵母以葡萄糖为原料化合物将乳酸作为目标化工产品的情 况下，第一发酵槽10的液体中的活菌的量(菌体密度)以干燥重量换算较好 是12～72g/L，更好是24～48g/L。如果该活菌的量在上述范围的下限值以 上，则可提高发酵槽的单位体积的化工产品的生产速度。此外，如果在上 限值以下，则可将菌体承受的压力抑制得较低，同时容易使氧和原料化合 物充分且平均地到达菌体，所以优选。
后述的实施例等中示出的菌体浓度(以下记作“菌体浓度OD660”)是由 通过日本分光株式会社(日本分光社)制可见紫外分光器V550测定的波长 660nm的光的吸光度(OD660)换算的值。660nm的OD＝1相当于酵母干燥重量的 0.2g/L、湿重的0.8g/L。
第一发酵槽10的液体中的氧浓度、即溶存氧浓度较好是10～300ppb， 更好是20～150ppb。如果该溶存氧浓度在上述范围内的下限值以上，则可 抑制化工产品的生产速度的下降，如果在上述范围的上限值以下，则可抑 制收率的下降，所以优选。
第一发酵槽10的液体中的原料化合物的浓度(X)较好是5～500g/L，更 好是10～200g/L。如果该原料化合物的浓度在上述范围的下限值以上，则 容易抑制化工产品的生产效率的下降(菌体的原料化合物消耗速度的下 降)，同时容易提高所得的化工产品的浓度，所以优选。如果该原料化合物 的浓度在上限值以下，则容易维持较高的活菌的菌体密度，同时容易将发 酵槽内搅拌均匀，所以优选。
在第一发酵槽10内的平均滞留时间较好是0.1～120小时，更好是1～60 小时。
第一发酵槽10的液体中的目标化工产品的浓度较好是5～200g/L，更好 是10～150g/L。如果该目标化工产品的浓度在上述范围内的下限值以上， 则容易抑制化工产品的纯化成本，如果在上限值以下，则容易抑制化工产 品的生产效率的下降，所以优选。
第一发酵槽10中的压力(气相部的压力，与大气压的压力差)无特别限 定，较好是常压(大气压)以上、100kPa以下。
[第二发酵工序]
本发明所述的化工产品的制造方法中，在第二发酵工序中，取出第一 发酵液作为第二发酵液，在不供给原料化合物的情况下向第二发酵液中供 给氧进行发酵，使该第二发酵液中的原料化合物的浓度达到比所述第一发 酵液中的原料化合物的浓度(X)低的浓度(Y)。
本实施方式中，从第一发酵槽10排出的第二发酵液经第一发酵部侧管 道21连续或间歇地供给至第二发酵槽20，在第二发酵槽20滞留一定时间后， 经分离部侧管道22汇流至在分离部3的循环路31中流动的液体。
将第二发酵槽20内的液温控制为规定的发酵温度，通过氧供给单元6 连续地向该液体中供给含氧的气体，从而在该液体中进行发酵，消耗原料 化合物和氧，生成化工产品(作为目标的化工产品和作为副产物的化工产 品)。第二发酵槽20内的液体通过以氧供给单元6连续地供给气体而产生的 搅拌作用变得大致均匀。
第二发酵液通过第一发酵部侧管道21期间，为了维持液体中的菌体的 存活，根据需要对第一发酵部侧管道21内的液体供给含氧的气体。此外， 本实施方式中，第一发酵部侧管道21内的液温被保持为规定的发酵温度。 因此，在第一发酵部侧管道21内也继续发酵，消耗原料化合物和氧，生成 化工产品。
从第二发酵槽20排出的发酵液通过分离部侧管道22期间，为了维持液 体中的菌体的存活，根据需要对分离部侧管道22内的液体供给含氧的气体。 此外，本实施方式中，分离部侧管道22内的液温被保持为规定的发酵温度。 因此，从第二发酵槽20排出的发酵液中残存原料化合物的情况下，在分离 部侧管道22内也继续发酵，消耗发酵液中所含的原料化合物和氧，生成化 工产品。
本实施方式中，从第一发酵槽10排出的第二发酵液通过第一发酵部侧 管道21、第二发酵槽20和分离部侧管道22期间，第二发酵液中所含的原料 化合物被消耗。因此，第二发酵部2中得到的第二发酵液、即临导入分离部 3的循环路31之前(图中符号B所示的位置，以下称为B点)的第二发酵液中的 原料化合物的浓度与从第一发酵槽10排出的第二发酵液相比减少。
本发明中，浓度(Y)是从第二发酵部2取出并作为第三发酵液供给至分 离部3的液体中的原料化合物的浓度。
本实施方式中，第二发酵槽20内的液体通过以氧供给单元6连续地供给 气体而产生的搅拌作用变得大致均匀。此外，B点的第二发酵液中以与第二 发酵槽20内的浓度大致相同的浓度包含生成的化工产品和原料化合物。即， 本实施方式中，第二发酵槽20内的第二发酵液的原料化合物的浓度与B点的 第二发酵液的原料化合物的浓度相同，为浓度(Y)。
另外，通过控制第二发酵部2中的平均滞留时间、即自刚从第一发酵槽 10排出后至临导入分离部3的循环路31之前为止的平均滞留时间，可将第二 发酵液的原料化合物的浓度(Y)降低至所期望的程度。
该第二发酵部2中的平均滞留时间是第一发酵部侧管道21中的通过时 间、第二发酵槽20中的平均滞留时间、分离部侧管道22中的通过时间的总 和。
从操作不易复杂化的角度来看，较好是通过分别以规定值使第一发酵 部侧管道21和分离部侧管道22中的流量一定并调整第二发酵槽20中的平均 滞留时间来控制第二发酵液的原料化合物的浓度(Y)的方法。
本实施方式中，B点的第二发酵液中的原料化合物的浓度(即浓度Y)相 对于第一发酵液中的所述原料化合物的浓度(X)、即刚从第一发酵槽10排出 至第一发酵槽侧管道21后的A点的第一发酵液中的原料化合物的浓度(即浓 度X)较好是在80％以下，更好是在50％以下。
B点的原料化合物的浓度(Y)较好是在10g/L以下，更好是在8g/L以下， 进一步更好是在5g/L以下，特别好是在2g/L以下，从化工产品的纯化负荷 的观点来看，理想的是零。
如果B点的第二发酵液中的原料化合物的浓度在上述范围的上限值以 下，则可充分降低临导入分离部3的分离单元30之前(图中符号C所示的位 置，以下称为C点)的第三发酵液中的原料化合物的浓度。由此，可良好地 减少分离部3的分离液中所含的原料化合物的量。
本实施方式中，进行好氧性发酵(需要氧的发酵)的情况下，存在消耗 第一发酵液中的浓度的氧的时间比消耗第一发酵液的浓度的原料化合物的 时间短的倾向。因此，设置第二发酵部，在不供给原料化合物的情况下供 给氧，从而进行发酵而消耗原料化合物。通过这样的方法，原料化合物的 利用效率提高，作为目标的化工产品的收率也提高。此外，同时可降低所 得的化工产品的粗制液(分离液)中的原料化合物的浓度，减小化工产品的 纯化负荷。
第二发酵槽20内的液体中的氧浓度、即溶存氧浓度通过事先的发酵试 验求出优选的范围。第二发酵槽20内的液体中的溶存氧浓度的下限以不会 使第二发酵槽20内的发酵速度变得极慢的条件设定。另一方面，上限基本 上可设为饱和氧浓度。这是为了消耗原料化合物，降低分离部3中的原料化 合物的浓度。但是，如果还考虑到作为目标的化工产品的生产效率，则第 二发酵槽20内的液体中的溶存氧浓度较好是在与第一发酵槽10内的液体的 溶存氧浓度同样的范围内。第一发酵部侧管道21内的液体中和分离部侧管 道22内的液体中的溶存氧浓度较好是在与第二发酵槽20内的液体中的溶存 氧浓度同样的范围内。
第二发酵部中的平均滞留时间(具有与平均体积流速的倒数同样的含 义)以将第二发酵液中所含的原料化合物的浓度降低至规定浓度以下的条 件设定。如果平均滞留时间过短，则原料化合物的浓度难以下降。此外， 如果平均滞留时间过长，则装置不易大型化，所以不理想。
第二发酵部2中的温度较好是与第一发酵槽10中的温度相同或稍高。但 是，温度的条件根据菌体而不同。
通过考虑到如上所述的条件设定各个值，可降低原料化合物的浓度， 提高作为目标的化工产品的生产速度。特别好是加快单位时间、发酵槽的 单位体积的原料化合物的消耗速度。但是，各个控制要素(氧的供给速度、 温度、pH和自第一发酵槽的发酵液的送出速度等)互相影响，所以最终该发 酵槽的最适值应通过实际的运转而适当调整。
第二发酵槽20的液体中的溶存氧浓度较好是10～6000ppb，更好是20～ 500ppb。如果该溶存氧浓度在上述范围的下限值以上，则可抑制原料化合 物的消耗速度的下降，所以优选。从使作为目标的化工产品的收率提高的 观点来看，该溶存氧浓度的上限更好是500ppb以下，进一步更好是200ppb 以下。管道21、22的液体中的溶存氧浓度也与第二发酵槽20的液体中的氧 浓度同样。
在第二发酵部2中的平均滞留时间较好是5分钟～20小时，更好是20分 钟～5小时。第二发酵部2中的平均滞留时间在将第一发酵槽10中的平均滞 留时间设为1的情况下较好是0.001～1，更好是0.01～0.8。
[分离工序]
分离部3中，分离单元30中未分离的非分离液通过循环路31再次被导入 分离单元30，第二发酵部2中得到的第二发酵液与在该循环路31中流动的非 分离液汇流后，供给至分离单元30。
通过设置所述的循环路31，可使供给至分离单元30的液体的流量比第 二发酵部20的分离部侧管道22中的流量更大，由此能够在不改变第二发酵 部2的分离部侧管道22中的流速的情况下，加大供给至分离单元30的液体的 线速度。特别是分离单元30采用膜分离装置的情况下，通过加大流过分离 膜表面的液体的线速度，可使分离膜不易发生堵塞。
为了维持在循环路31中流动的液体中的菌体的存活，通过氧供给单元6 对循环路31内的液体供给含氧的气体(对循环路31内的液体供给含氧的气 体的管道省略图示)。氧供给单元6的设置位置和数量可适当改变。
此外，本实施方式中，循环路31内的液温被保持为规定的温度。因此， B点的第二发酵液中残存原料化合物的情况下，在从分离部侧管道22与循环 路31的汇流位置至临导入分离单元30之前为止的流路内也继续发酵，由于 循环路31内的流量大，因此该流路内的通过时间短，此处的发酵少至可忽 略的程度。
本实施方式中，C点的第三发酵液中的原料化合物的浓度较好是在8g/L 以下，更好是在5g/L以下，理想的是零。
C点的第三发酵液是B点的第二发酵液和在循环路31内流动的非分离液 的混合液。因此，该C点的第三发酵液中的原料化合物的浓度可通过B点的 第二发酵液中的原料化合物的浓度以及与在循环路31内流动的非分离液汇 流时的稀释倍数(根据该非分离液的流量和B点的第二发酵液的流量确定) 进行控制。
分离单元30中，获得包含化工产品且不含菌体的分离液以及包含残存 的原料化合物和菌体的非分离液。分离液经排出管51取出。从排出管51排 出的分离液(图中符号D所示的位置，以下称为D点)的原料化合物的浓度较 好是在10g/L以下，更好是在8g/L以下，进一步更好是在5g/L以下，特别好 是在2g/L以下，理想的是零。作为目标的化工产品的浓度较好是10～ 200g/L，更好是50～150g/L。
此外，收率较好是在40％以上，更好是在80％以上。
分离单元30内的液体中的氧浓度、即溶存氧浓度通过事先的发酵试验 求出优选的范围。分离单元30内的液体中的溶存氧浓度的下限以不会使菌 体的活菌率极度下降的条件设定。另一方面，上限基本上可设为饱和氧浓 度。
分离单元30中的分离液和非分离液的比由分离单元的性能决定。特别 是分离单元30采用膜分离装置的情况下，从抑制堵塞的观点来看，较好是 将膜表面的线速度保持在一定范围内。膜表面的线速度由1)从第二发酵部2 接受的液体的体积流速、2)作为分离液排出的液体的体积流速、3)循环路 31中的液体的体积流速和4)送出至返回送液部的液体的体积流速的平衡决 定。一般C点的体积流速设定为比B点的体积流速大一定程度。
分离单元30内的液体中的溶存氧浓度较好是10～6000ppb，更好是20～ 500ppb。
分离单元采用膜分离装置的情况下，其膜表面的线速度较好是0.1～ 3m/s，更好是0.3～2m/s。
[返回送液工序]
在分离部3的循环路31中流动的液体的一部分经由返回送液部4的管道 41连续或间歇地供给至第一发酵槽10。
通过设置返回送液工序，可连续发酵。即，可连续地进行如下的一系 列流程：向第一发酵部供给原料化合物，该原料化合物通过发酵被转化为 目标化工产品，在分离部获得目标化工产品。本发明的化工产品的制造方 法也可有效地适用于进行分批式发酵的情况。但是，本发明的化工产品的 制造方法在进行连续发酵的情况下也可稳定提高原料化合物的利用效率， 非常有效。
为了维持在管道41内流动的液体中的菌体的存活，根据需要供给含氧 的气体。
本实施方式中，临导入第一发酵槽10之前(图中符号E所示的位置，以 下称为E点)的液体中的菌体的浓度较好是A点的发酵液中的菌体浓度的80 ％以上，更好是90％以上。
管道41内的液体中的氧浓度、即溶存氧浓度与分离单元30内的液体中 的溶存氧浓度同样。
此外，管道41内的体积流速根据分离单元30中的液体的体积流速的平 衡确定。
管道41内的液体中的溶存氧浓度较好是10～6000ppb，更好是20～ 500ppb。
本实施方式中，可经由图2所示的排出管43排出非分离液的一部分。通 过进行该排出，菌体的一部分被从制造装置排出。对于在第一发酵部减少 的菌体，通过菌体供给单元8补充。通过该操作，用于发酵的菌体在经过一 定时间(平均滞留时间)后被取出。如果使从菌体供给单元8供给的菌体的量 与从排出管43排出的菌体的量相等，则若假定在第一发酵部或第二发酵部 菌体不大幅增殖，存在于第一发酵部和第二发酵部的菌体的量的总和大致 保持恒定。菌体的平均滞留时间可通过将根据第一发酵部、第二发酵部、 分离部和返回送液部的合计的总容量(实际运转时的液量)算出的总菌体量 除以单位时间内实际排出的菌体量而算出。菌体的平均滞留时间较好是 100～2000小时，更好是200～800小时。
如果采用本实施方式，则从第一发酵槽10排出的第二发酵液到达分离 单元30为止期间，供给氧而维持菌体的存活的同时，不供给原料化合物， 将液温保持为发酵温度，从而可消耗该第二发酵液中的原料化合物。
由此，供给至分离单元30的C点的液体中，原料化合物的浓度比A的液 体降低，分离单元30的分离液中所含的原料化合物的量减少。
因此，可使在第一发酵槽供给的原料化合物的利用效率提高。此外， 纯化透过液时应除去的原料化合物的量减少，因此纯化工序的负担减轻。
实施例
以下，示出实施例对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下 述记载的限定。本实施例中，含量的单位“％”在没有特别说明时表示“质 量％”。
[菌体]
通过国际公开编号WO2012/114979的说明书所记载的实施例中的方法 制备具有乳酸发酵能力的裂殖酵母。即，获得敲除丙酮酸脱羧酶基因(PDC2) 并在染色体中整合了人来源的L乳酸脱氢酶基因(L-LDH)的粟酒裂殖酵母的 转化子(ASP3054株)。将该ASP3054株作为菌体，用于以下的试验。
[培养液]
将菌体接种于150mL的YES培养基(含有0.5％的Difco酵母提取物、 30g/L的葡萄糖和50mL/L的20倍浓缩营养补充剂，pH调整至4.5的培养基)中 进行培养。接着，使用小松川化工机株式会社(小松川化工機社)制3L玻璃 容器培养装置，以1/10的量接种并进行培养(将pH控制为3.9，且溶存氧浓 度(以下略作“DO”)控制为2ppm)。培养基使用半合成培养基(含有20g/L的 酵母提取物、15g/L的(NH4)2SO4、22g/L葡萄糖、8g/L的KH2PO4、5.34g/L的MgSO4·7H2O、0.04g/L的Na2HPO4、0.2g/L的CaCl2·2H2O、微量金属和微量维生素， pH调整至4.5的培养基)，逐步追加的追加用培养基使用(含有50g/L的酵母 提取物、500g/L葡萄糖、9g/L的KH2PO4、4.45g/L的MgSO4·7H2O、3.5g/L的K2SO4、 0.14g/L的Na2SO4、0.04g/L的Na2HPO4、0.2g/L的CaCl2·2H2O、微量金属和微 量维生素，pH调整至4.5的培养基)。最终获得菌体浓度OD660为180(以酵母 干燥重量换算为36g/L)的含酵母液(培养液)。
[含原料液]
制备含有87.4g/L葡萄糖、0.5％的Difco酵母提取物、2.2g/L的Na2HPO4、 1.05g/L的MgCl2·6H2O、0.015g/L的CaCl2·2H2O、1.0g/L的KCl、0.04g/L的 Na2SO4、3.0g/L的苯二甲酸氢钾、微量金属成分、维生素和生物素的液体， 作为含原料液。
[制造装置]
按照图1所示的装置准备制造装置。准备2台小松川化工机株式会社制 1L玻璃容器培养装置，作为第一发酵槽10和第二发酵槽20。为了向各发酵 槽供给气体(空气)，从上部将管以其端部到达底面附近的方式插入。即， 气体的供给从发酵槽底部在液体中进行。将通过空气压缩机加压的压缩空 气用滤器过滤后用于空气的供给。此外，发酵槽具备用于对槽内进行搅拌 的搅拌叶片。作为送液用的泵(21a、22a、31a和71a)，使用盒式管泵(东京 理化器械株式会社(東京理科社)制，SMP-21)。作为分离单元30，使用膜分 离装置(平均孔径:0.2μm，聚砜制中空丝膜，GE医疗公司(GEHealthcare 社)制，XamplerCFP-2-E-3MA，膜面积110cm2)。DO的测定使用梅特勒-托利 多公司(メトラートレド社)制的InPro6900。葡萄糖、乳酸和乙醇的测定使 用王子计测机器株式会社(王子計測機器社)制的酶电极法生物传感器BF-5 和BF-7。使用这些准备图1所示的化工产品的制造装置。
(实施例1)
按照以下的条件将葡萄糖作为原料化合物制造作为目标化工产品的乳 酸。
按照第一发酵槽10的液量为500mL且第二发酵槽的液量为400mL的条件 将培养液加入各槽。其中，作为第二发酵槽的液量，包括前后的连接用软 管的容量。含原料液向第一发酵槽10的供给速度(泵71a的送液速度)和自分 离单元30的分离液的排出的送液速度分别设为33mL/小时。自第一发酵槽10 向第二发酵槽20的送液速度(泵21a的送液速度)和自第二发酵槽20向分离 单元30的送液速度(泵22a的送液速度)分别设为100mL/小时。即，第一发酵 槽10中的平均滞留时间设为5小时，且第二发酵槽20中的平均滞留时间设为 4小时。此外，分离单元30的入口的送液速度(泵31a的送液速度)设为300mL/ 分钟。由此，膜的一次侧(存在菌体的一侧)的膜表面的线速度设为0.5m/秒。 此外，透过流束为3L/m2/小时。
第一发酵槽10和第二发酵槽20的槽内的温度调节至28℃。此外，第一 发酵槽10和第二发酵槽20的槽内的压力设为大致常压。向第一发酵槽10的 空气(氧浓度21体积％，下同)的供给量设为0.25L/分钟，且向第二发酵槽 20的空气的供给量设为0.2L/分钟。调节搅拌叶片的转速，将第一发酵槽10 的槽内和第二发酵槽20的液体中的DO(即，第一发酵液的溶存氧浓度和第二 发酵槽的溶存氧浓度)设为70～100ppb(设定目标80ppb)。DO的偏移被认为 是由于含原料液的供给是间歇的，因而葡萄糖的消耗速度并不恒定。第一 发酵槽10的槽内的葡萄糖浓度在发酵开始(将开始液体循环时设为零)100 小时后基本恒定。此外，此时的第一发酵槽10的槽内和第二发酵槽20的槽 内的菌体浓度OD660为180。以该条件进行1000小时的连续运转。为了使第 一发酵槽10的槽内的菌体浓度OD660维持在180左右，根据需要将培养液供 给至第一发酵槽10。此外，同时为了使总液量恒定而将从分离单元30向第 一发酵槽输送的液体的一部分分流排出。
1000小时后的第一发酵液(第一发酵槽10内的液体)中的葡萄糖和乳酸 的浓度、第二发酵液(第二发酵槽20内的液体)中的葡萄糖和乳酸的浓度以 及分离液(D点的液体)中的葡萄糖、乳酸和乙醇的浓度以及分离液中的乳酸 的收率示于表1。此外，对同一时刻的发酵槽10的槽内的发酵液进行采样求 出活菌率。其结果示于表1。其中，活菌率的测定通过以下的方法进行。对 于C点的第三发酵液中的各原料化合物的浓度的测定值，虽然表1中未示出， 但在用于本实施例的装置中，显示与分离液(D点的液体)中的葡萄糖、乳酸 和乙醇的浓度同等的值。
取样10μL发酵液，进行离心分离(3300G，10分钟)。向除去上清后的 沉淀添加10μL台盼蓝染色液(台盼蓝0.4％溶液，MP生物医药公司(MP Biomedicals社)制)。进行显微镜观察，对总计300个左右确认染色的有无。 白色的菌体判定为活菌，蓝色的菌体判定为死菌。
(实施例2)
除了将第一发酵槽10中的液量设为600mL，平均滞留时间设为6小时， 向第一发酵槽10的空气的供给量设为0.3L/分钟，第二发酵槽20中的液量设 为300mL，平均滞留时间设为3小时，向第二发酵槽20的空气的供给量设为 0.15L/分钟以外，与实施例1同样地进行操作，制造乳酸。其结果示于表1。
(实施例3)
除了将第二发酵槽中的空气的供给量设为1L/分钟，第二发酵槽20的液 体中的DO设为4000ppb以外，与实施例1同样地进行操作，制造乳酸。其结 果示于表1。
(比较例1)
除了不设置第二发酵槽20和气体供给管道62、63、64，将第一发酵槽 与分离单元30的循环管道介以泵21a连接以外，与实施例1同样地进行操作， 制造乳酸。其结果示于表1。
(比较例2)
除了以0.2L/分钟供给氮气来代替第二发酵槽20中的空气的供给以外， 与实施例1同样地进行操作，制造乳酸。其结果示于表1。
[表1]
如表1的结果所示，通过向第二发酵槽20供给空气进行发酵，可良好地 减少分离单元30的透过液中所含的原料化合物的量。
工业上利用的可能性
如果采用本发明，则在分离发酵液获得包含化工产品的分离液时，可 减少该分离液中所含的原料化合物的量，由此可使原料化合物的利用效率 提高，同时纯化分离液时要除去的原料化合物的量减少，因此可减轻纯化 工序的负担，在通过发酵由原料化合物制造化工产品的方法中有用。
在这里引用2013年3月28日提出申请的日本专利申请2013-070323号的 说明书、权利要求书、附图和摘要的所有内容作为本发明说明书的揭示。
符号的说明
1第一发酵部
2第二发酵部
3分离部
4返回送液部
6氧供给单元
7原料供给单元
8菌体供给单元
10第一发酵槽
20第二发酵槽
21第一发酵部侧的管道
21a泵
22分离部侧的管道
22a泵
30分离单元
31循环路
31a泵
32缓冲罐
41、42管道
43排出管
51排出管
60气体储存槽
61、62、63、64、65气体供给管道
70原料槽
71含原料液供给管道
71a泵
80培养槽
81培养液供给管道
81a泵