(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的制备方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201510605671.5

申请日:

20150922

公开号:

CN105132488A

公开日:

20151209

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:

IPC分类号:

C12P13/00

主分类号:

C12P13/00

申请人:

江苏理工学院

发明人:

汪斌,梁国斌,刘维桥,顾梦涛,翟良创,张春勇,周全法

地址:

213001 江苏省常州市钟楼区中吴大道1801号

优先权:

CN201510605671A

专利代理机构:

常州市江海阳光知识产权代理有限公司

代理人:

孙晓晖

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内容摘要

本发明公开了一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,它是以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物,以固定化卤醇脱卤酶为催化剂,在pH值为6.5~8.0的条件下与氰化盐反应得到;固定化卤醇脱卤酶的制备方法如下:将吸附树脂加入到卤醇脱卤酶溶液中,使卤醇脱卤酶吸附到吸附树脂上,然后用双功能交联剂进行交联,最后将吸附树脂从酶溶液中分离出来,洗涤得到。本发明的固定化卤醇脱卤酶酶活回收率高,操作稳定性高,有利于生产成本的降低,用其制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,工艺简单,拆分效果优良,e.e.值可达99%,尤其是后处理更为简单,而且收率可达91%以上。

权利要求书

1.一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:它是以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物,以固定化卤醇脱卤酶为催化剂,在pH值为6.5~8.0的条件下与氰化盐反应得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯;所述固定化卤醇脱卤酶的制备方法如下:将吸附树脂加入到卤醇脱卤酶溶液中,使卤醇脱卤酶吸附到吸附树脂上,然后用双功能交联剂进行交联,最后将吸附树脂从酶溶液中分离出来,洗涤得到固定化卤醇脱卤酶。 2.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述卤醇脱卤酶溶液中的蛋白含量为1~15mg/mL。 3.根据权利要求2所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述吸附树脂与酶蛋白的重量比为5∶1~30∶1。 4.根据权利要求1或3所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述的吸附树脂为弱酸阳离子树脂或者弱碱阴离子树脂或者大孔吸附树脂。 5.根据权利要求4所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述的弱酸阳离子树脂为724型、CD-180型、DK110型、D151/D152型、D113型或者110型。 6.根据权利要求4所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述的弱碱阴离子树脂为330型、D345型、D301型、D301G型、D311型、D314/D315型、D318型或者D941型。 7.根据权利要求4所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述的大孔吸附树脂为AB-8型、D101型、CAD-40型、D1300型、X-5型、H103型或者DM11型。 8.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述的双功能交联剂为戊二醛,戊二醛与酶液的体积比为0.2~1.0%,交联时间为0.2~1h。 9.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,其特征在于:所述所述固定化卤醇脱卤酶的加入量与(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重量之比为1∶10~1∶40。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医药中间体的制备方法,具体涉及一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的制备方法。

背景技术

(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯是合成阿托伐他汀钙的一种重要中间体,其制备方法主要包括化学法和酶法。

其中,化学法主要有以下几种:

(1)以S-环氧氯丙烷为起始原料,经过水解反应、酯化反应、手性中心保护反应以及脱保护反应制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见文献LettOrgChem,2012年,第9期,第520-521页);该方法的不足在于:收率较低,产物光学纯度也较低,从而限制了其在工业中的应用。

(2)以L-苹果酸为起始原料,经过酯化反应、还原反应以及取代反应制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见文献ChinJOrgChem,2009年,第29期,第1997-1999页);该方法的不足在于:收率较低,还原剂较为昂贵,导致生产成本较高,从而限制了其在工业中的应用。

(3)以麦芽糊精为起始原料合成,经过若干步骤后制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见文献TetrahedronAsymmetry,2005年,第16期,第2717-2721页);该方法的不足在于:收率较低,产物光学纯度也较低,从而限制了其在工业中的应用。

(4)以(S)-3,4-环氧丁酸盐为原料,经过氰化反应、酯化反应以及酸化反应制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见美国专利文献US6586616B1和世界专利文献WO2000046186);该方法的不足在于:会产生大量的副产物以及酸性含氰废水,对环境污染较大,从而限制了其在工业中的应用。

酶法也有以下几种:

(1)以脂肪酶为催化剂,以4-氰基-3-羟基丁酸乙酯为底物,经转酯化反应制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见美国专利文献US7485452B2);该方法的不足在于:收率较低,只有50%左右,从而限制了其在工业中的应用。

(2)以腈水解酶为催化剂,以3-羟基戊二腈为底物,经水解反应制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见文献ApplEnvironMicrobiol,2004年,第70期,第2429-2436页);该方法的不足在于:底物3-羟基戊二腈合成困难,从而限制了其在工业中的应用。

(3)以羰基还原酶为催化剂,以2-甲基-4-氯-3-氧化丁烷酸为底物,在辅酶的作用下制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见文献CurrMedChem,2001年,第8期,第345-369页和文献BiosciBiotechnolBiochem,2006年,第70期,418-426页);该方法的不足在于:辅酶较为昂贵,导致生产成本较高,从而限制了其在工业中的应用。

(4)以卤醇脱卤酶为催化剂,以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物,经脱卤反应、环氧化反应以及氰化反应制得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(参见文献BiochemSocTrans,2006年,第34期,第291-295页和文献EnzymMicrobTechnol,2002年,第30期,第251-258页和)。该方法由于反应条件温和,产品纯度较高等特点被广泛应用在工业生产中。

但是,现有的卤醇脱卤酶催化法仍然存在以下不足:(1)卤醇脱卤酶不能重复使用,从而导致生产成本较高。(2)反应结束后,需要采用活性炭等将卤醇脱卤酶从反应体系中吸附出来,一方面,会有少量卤醇脱卤酶残留在反应液中,且在后续精馏过程中也很难去除,从而影响了产品的品质;另一方面,活性炭在吸附卤醇脱卤酶的同时也会吸附一部分(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,从而影响了产品的收率,尤其是增加了后处理的复杂程度。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的卤醇脱卤酶法生产成本较高、后处理较为复杂、收率较低的问题,提供一种生产成本较低、后处理简单、收率较高的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法。

实现本发明目的的技术方案是:一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,它是以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物,以固定化卤醇脱卤酶为催化剂,在pH值为6.5~8.0的条件下与氰化盐反应得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯。

所述固定化卤醇脱卤酶的加入量与(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重量之比为1∶10~1∶40。

所述的催化反应温度为40~60℃,优选50℃。

所述的氰化盐为氰化钠或者氰化钾。

所述固定化卤醇脱卤酶的制备方法如下:将吸附树脂加入到卤醇脱卤酶溶液中,使卤醇脱卤酶吸附到吸附树脂上,然后用双功能交联剂进行交联,最后将吸附树脂从酶溶液中分离出来,洗涤得到固定化卤醇脱卤酶。

所述的卤醇脱卤酶为HheA、HheB或者HheC。

所述卤醇脱卤酶溶液中的蛋白含量为1~15mg/mL,优选10mg/mL。

所述的吸附树脂为弱酸阳离子树脂或者弱碱阴离子树脂或者大孔吸附树脂;所述的弱酸阳离子树脂为724型、CD-180型、DK110型、D151/D152型、D113型或者110型,优选D151/D152型;所述的弱碱阴离子树脂为330型、D345型、D301型、D301G型、D311型、D314/D315型、D318型或者D941型,优选D314/D315型;所述的大孔吸附树脂为AB-8型、D101型、CAD-40型、D1300型、X-5型、H103型或者DM11型。

所述吸附树脂与酶蛋白的重量比为5∶1~30∶1,优选10∶1~20∶1,更优选15∶1。

所述吸附温度为15~30℃,优选25℃。

所述吸附时间为6~12h,优选8h。

所述的双功能交联剂为戊二醛,戊二醛与酶液的体积比为0.2~1.0%,交联时间为0.2~1h。

在采用双功能交联剂进行交联之前,还可以用包埋材料对吸附树脂进行包埋,包埋材料为卡拉胶、明胶、聚乙二醇等。

本发明具有的积极效果:(1)本发明的固定化卤醇脱卤酶酶活回收率高,操作稳定性高,重复使用5批次后活力仍然达到初始活力50%以上,有利于生产成本的降低。(2)采用本发明的固定化卤醇脱卤酶制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯工艺简单,拆分效果优良,e.e.值可达99%,尤其是后处理更为简单,而且收率可达91%以上。

具体实施方式

(实例1)

本实例为固定化卤醇脱卤酶的制备方法:

S1:将商业购买的HheC卤醇脱卤酶液(初始酶活力为800万U/g蛋白)稀释至蛋白含量为10mg/mL,得到卤醇脱卤酶溶液。

S2:取200mL步骤S1得到的卤醇脱卤酶溶液(酶蛋白为2g),加入30g的D151/D152型吸附树脂,在25℃的温度下搅拌吸附8h。

S3:加入2mL的戊二醛溶液(25%,v/v),交联0.5h。

S4:最后,过滤,用缓冲溶液洗涤3次,得到固定化卤醇脱卤酶。

固定化卤醇脱卤酶保存在4℃下,待用。

本实例制得的固定化卤醇脱卤酶的酶活力为18.91万U/g。

酶活力定义:30℃恒温条件下,在含有5mmol/L底物(2-溴乙醇)的50mMTris/SO4缓冲液(pH8.0)中每分钟降解底物生成1μmol溴离子的酶量定义为一个单位(U)。

(实例2~实例10)

各实例的固定化卤醇脱卤酶的制备方法与实例1基本相同,不同之处见表1。

表1

吸附树脂 蛋白含量 吸附时间 包埋材料 酶活力 实例1 D151/D152型 10mg/mL 8h 无 18.91万U/g 实例2 D151/D152型 5mg/mL 8h 无 11.48万U/g 实例3 D151/D152型 15mg/mL 8h 无 15.67万U/g 实例4 D314/D315型 10mg/mL 6h 无 9.75万U/g 实例5 D314/D315型 10mg/mL 8h 无 16.44万U/g 实例6 D314/D315型 10mg/mL 10h 无 18.16万U/g 实例7 D101型 10mg/mL 8h 无 13.47万U/g 实例8 D151/D152型 10mg/mL 8h 卡拉胶 15.38万U/g 实例9 D151/D152型 10mg/mL 8h 明胶 14.88万U/g 实例10 D151/D152型 10mg/mL 8h 聚乙二醇 11.97万U/g

由表1可以看出,在其它条件相同的情况下,采用实例1和实例6制备的固定化卤醇脱卤酶的酶活力最高。

(实施例1)

本实施例的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的制备方法,具有以下步骤:

①在2L的反应釜中加入400g水和900g浓度为30wt%的氰化钠溶液,用浓度为30wt%稀硫酸缓慢调节pH值至8.0,然后向反应釜中加入910g的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(e.e.值99%),再用浓度为30wt%的氰化钠溶液将pH值调至7.0±0.2。

②缓慢升温至50℃,然后加入15g实例1制得的固定化卤醇脱卤酶,加完再滴加浓度为30wt%的氰化钠溶液调节pH值为7.0±0.2,通过气相检测跟踪反应进程,当(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量达到50%以上时,再补加15g实例1制得的固定化卤醇脱卤酶,继续保持温度为50℃以及pH值为7.0±0.2反应,当检测到(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯含量在1%以下时终止反应。

③反应结束后,在真空条件下脱氰酸20分钟,用滤布将固定化卤醇脱卤酶过滤。滤液用2500g乙酸乙酯萃取三次。有机层合并,减压蒸馏得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯粗品,重结晶得到(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯成品781g,e.e.值99%,收率91%。

将过滤回收的固定化卤醇脱卤酶重新投入新的反应体系中,反应条件与步骤①~③相同。当重复实验所需时间超过步骤②所需时间2倍时,重复性实验终止,计算重复性次数。

(实施例2~实施例4)

各实施例的制备方法与实施例1基本相同,不同之处见表2。

(对比例)

本对比例的制备方法与实施例1基本相同,不同之处见表2。

表2

卤醇脱卤酶 (R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯 重复次数 实施例1 30g实例1 781g,e.e.值99.0%,收率91% 5 实施例2 30g实例6 778g,e.e.值98.8%,收率91% 4 实施例3 30g实例8 772g,e.e.值98.5%,收率90% 7 实施例4 30g实例9 776g,e.e.值98.6%,收率91% 6 对比例 游离卤醇脱卤酶 695g,e.e.值98.3%,收率81% 0

由表2可以看出,在其它条件相同的情况下,采用实例1的固定化卤醇脱卤酶,产物e.e.值最佳,采用实例8的固定化卤醇脱卤酶,重复次数最高。

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本发明公开了一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的制备方法,它是以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物,以固定化卤醇脱卤酶为催化剂,在pH值为6.58.0的条件下与氰化盐反应得到;固定化卤醇脱卤酶的制备方法如下:将吸附树脂加入到卤醇脱卤酶溶液中,使卤醇脱卤酶吸附到吸附树脂上,然后用双功能交联剂进行交联,最后将吸附树脂从酶溶液中分离出来,洗涤得到。本发明的固定化卤醇脱卤酶酶活回收率高,操作稳定性高。

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