技术领域
本发明涉及一种天然植物提取物及其应用技术，特别涉及化合物2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉(2-Furanmethanol-(5′→11)-1，3-cyclopentadiene-[5，4-c]-1H-cinnolin)及其作为抗氧化剂在食品、化妆品和药品中的应用。
技术背景
自由基是导致油脂类产品氧化变质和造成机体氧化应激损伤的主要因素，因此防止和清除自由基的抗氧化剂是防止食品变质和防治氧化损伤相关疾病的最主要手段之一。
栽培菊苣(CichoriumendiviaL.)是菊科菊苣属的一种栽培植物，源自欧洲，是欧美地区备受欢迎的食用蔬菜。有研究发现，苦菊中含有一定量的抗氧化活性成分，是其防止多种与氧化应激损伤相关的慢性疾病的理论基础(YangR.etal..Contentanddistributionofflavonoidsamong91edibleplantspecies.AsiaPacJClinNutr，2008，17(S1)：275-279)。
发明内容
本发明提供一种化合物2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉，该化合物是本发明人在具有抗氧化活性的栽培菊苣提取物(公开号CN101869348A)中发现的化合物，分子式为C16H12N2O2，其结构式为：
经质谱和核磁的结构鉴定如下：ESI-MS：m/z265[M+H]+，287[M+Na]+，263[M-H]-，299[M+Cl]-；HRESIMS：m/z287.0794[M+Na]+(calcdforC16H12N2O2Na，287.0791).1HNMR(300MHz，CD3OD)δ：8.21(1H，d，J＝5.1Hz)，8.10(1H，d，J＝8.1Hz)，7.92(1H，d，J＝5.1Hz)，7.63(1H，d，J＝8.1Hz)，7.51(1H，t，J＝7.5Hz)，7.21(1H，d，J＝7.5Hz)，7.16(1H，d，J＝3.0Hz)，6.52(1H，d，J＝3.0Hz)，4.70(1H，s).13CNMR(100MHz，CD3OD)δ：157.2，154.2，143.0，138.5，134.3，132.5，132.1，130.0，122.5，122.1，121.2，114.9，113.2，111.0，111.0，57.6.
本发明提供的2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉的制备方法包括三个步骤：
(1)粉碎干燥的栽培菊苣于，加入20～100％的乙醇溶液浸泡，提取比例1∶5～1∶30，提取1～4h，重复浸提4次，过滤。提取液浓缩后，混悬于30～95％乙醇溶液中，用石油醚萃取1～6次(石油醚与混悬液的比例是1∶1～1∶10)。将石油醚萃取后的水层挥干至无醇味，加水混悬，用乙酸乙酯萃取1～4次(乙酸乙酯与混悬液的比例是1∶1～1∶10)。乙酸乙酯萃取后的水层过大孔吸附树脂，用水和60％乙醇洗脱，其中60％乙醇层经浓缩，真空干燥。
(2)60％乙醇部分溶解于正丁醇中，用5％NaHCO3水溶液萃取1～5次，水洗至中性，减压浓缩得正丁醇部分。
(3)正丁醇部分溶于甲醇，使用不同浓度的甲醇水溶液在制备RP-HPLC中反复洗脱得到。
本发明的2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉具有很好的抗氧化能力，有效清除自由基，其中抗氧化能力要比阳性药抗坏死酸更佳。2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉可以作为天然食品抗氧化剂在制备食品及化妆品中的应用，以及作为清除人体自由基、抗衰老的食品或药品的应用。
具体实施方式
1.2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉的提取分离
为了更好地理解本发明的实质，下面将用栽培菊苣中提取分离2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉的实验及结果来说明其在食品、化妆品和制药领域的用途。但本发明的实施方式不限于此。
栽培菊苣干燥全草5.8kg，95％乙醇回流提取三次(80L×2h、70L×1h、68L×1h)，过滤，合并滤液，减压浓缩，所得浸膏混悬于70％乙醇溶液中(3.5L)，石油醚萃取四次(2L，1.5L，1.5L，1.5L)，醇层减压浓缩至无醇味，加水混悬约2300ml，乙酸乙酯萃取三次(1.5L，1.2L，1.2L)，萃取后的水层约2200ml，过大孔吸附树脂，分成水部分(14L)，60％乙醇部分(15L)。60％乙醇部分浓缩后挥干重约40g。60％乙醇部分溶解于500ml正丁醇中，用5％NaHCO3水溶液萃取3次(200ml×3)，水洗至中性，减压浓缩得正丁醇部分5.5g。正丁醇部分溶于甲醇，使用60％、80％和100％的甲醇水溶液在制备RP-HPLC中洗脱得到13个部位，其中部位13使用70％的甲醇水溶液在制备RP-HPLC中反复分离得到2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉(13mg)。利用上述方法得到的2-糠醇-(5′→11)-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉进行下述抗氧化试验。
2抗氧化活性的测定
(1)ORAC抗氧化能力测试
ORAC是Oxygenradicalabsorbancecapacity的缩写，即抗氧化能力指数测定。方法以偶氮类化合物AAPH作为氧自由基来源，荧光素钠(SodiumFlourescein，FL)为荧光指示剂，观察自由基与荧光素钠作用后其荧光强度衰退过程，并以维生素E水溶性类似物(Trolox)为定量标准，检测各种抗氧化剂加入这个反应体系中延缓荧光素钠荧光强度衰退的能力，以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。本试验使用荧光微孔板分析仪进行分析。ORAC测定的操作步骤如下：配制75mmol/L的磷酸三钾缓冲液(pH＝7.4)作为反应体系的溶剂，FL和AAPH皆溶于该缓冲液中配制成相应浓度的溶液。一定浓度的测试物溶于DMSO，并以磷酸三钾缓冲液稀释至DMSO浓度为1％的测试液。在96孔的黑色荧光酶标板内加入不同浓度的测试液20μl和122.4nmol/L的FL溶液100μl，37℃共孵育5min后加入47.5mmol/L的AAPH溶液80μl。在荧光酶标仪于485nm激发波长和538nm的发射波长内连续测定荧光强度，整个体系保持在37℃，每间隔1min测定一次荧光强度，每次测定前震动孔板10s，测定时程直到荧光强度衰减至不足初始值的5％为止。实验所得的绝对荧光强度数据与其初始时间的荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度计算荧光衰退曲线下面积(AUC)，其公式为：
AUC＝0.5×[2×(f0+f1+…+fn-1+fn)-f0-fn]×Δt
其中fn表示第n个测定点的相对荧光强度，Δt是相邻两个时间点之间的时间间隔。本测试结果以ORAC值表示，首先计算测试物作用下的AUC与无抗氧化剂存在时AAPH作用的AUC之差，得到净AUC(netAUC)，以标准参照物trolox的浓度与净AUC做标准曲线，把待测物的净AUC待入曲线中计算出对应的trolox浓度，即Trolox当量。待测样品的ORAC值以μmolTrolox当量/μmol待测样品表示。以抗坏死酸为阳性对照。
(2)DPPH自由基清除能力检测
通过酶标仪检测待测物与DPPH·作用后的颜色的变化，评价待测样品的抗自由基能力。其操作步骤如下：反应体系在96孔板中进行，溶于DMSO的待测溶液每孔加入20μl，随后迅速加入100μmol/L的DPPH·(溶于无水乙醇)180μl，震荡混匀后采用酶标仪于517nm波长处检测OD值，同时以20μlDMSO代替待测液作为空白对照，空白调零孔加入20μlDMSO加180μl的无水乙醇。经过多个时间点的检测，以不再发生改变的OD值作为最终测量值。DPPH·清除率的计算公式为：
DPPH·清除率＝[1-(ODs/ODc)]×100％
其中ODc为空白对照组的OD值，ODs为待测样品组的OD值。本试验以DPPH清除率达到50％时所需待测液的浓度(EC50)作为评价指标。以抗坏死酸作为阳性对照。
结果见表1
表1样品清除DPPH自由基、ORAC抗氧化试验和福淋酚还原能力测试