一种重组基因VII型新城疫多表位疫苗.pdf

本发明涉及一种重组基因VII型新城疫多表位疫苗的制备与应用。所述疫苗以基因VII型新城疫病毒主要囊膜糖蛋白：融合蛋白(F)、血凝素‑神经氨酸酶蛋白(HN)及核衣壳蛋白(NP)Th表位、CTL表位以及B细胞表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接，克隆入pRSETA载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的新城疫多表位疫苗。动物实验表明，重组基因VII型新城疫多表位疫苗不仅安全性良好，而且能够激发有效的体液免疫与细胞免疫反应。

1.一种基因VII型新城疫多表位疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNo.2。 2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述融合蛋白，其核酸序列为SEQIDNo.1。 3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。 4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。 5.一种用于预防基因VII型新城疫的疫苗，其包含权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。 6.权利要求1所述的融合蛋白在制备重组基因VII型新城疫多表位疫苗中的应用。

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种重组基因VII型新城疫多表位疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将与新城疫病毒感染有关的两个主要囊膜糖蛋白：融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)及核衣壳蛋白(NP)的B细胞表位、Th表位以及CTL表位串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化工艺制备，得到重组新城疫多表位疫苗以及该疫苗在预防新城疫中的应用。

背景技术

NDV属于副粘病毒科，副粘病毒属病毒，是由NDV(Newcastle Disease Virus) 引起的侵害禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病，是威胁世界养禽业的主要疾病之一，被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病，可感染大多数禽类。我国于1948年首次分离到NDV，至今ND在我国全国范围内发病仍然比较普遍，制约着我国养禽业的发展及禽产品的出口，也对食品安全及人类健康存在潜在的危害。尽管新城疫免疫接种已经普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍时有发生。

基因VII型NDV自20世纪80年代早期就已经在东亚流行(Aldous.et al.， 2003)。1995年，我国台湾地区暴发了严重的ND大流行，Yang等证实了基因VII 型NDV是造成台湾地区 1995年至今ND流行的主要病原。严维巍等首次报道了基因VII 型在大陆的存在。Liu X F等对1985-2001年中国部分地区鸡群和鹅群中分离到的新城疫毒株基因型分析发现，29株NDV中有14株属于基因VII型；Qin等从我国 1996-2005年全国各个地区鸡，鸭、鹅体内分离到30株NDV，其中17株属于基因 Vll型；Liu H L等对2005年NDV分离株分析发现，基因VII型毒株占分离总数的 77％；Zhang rui等根据我国2001-2009年分离到的17株NDV发现基因VII型NDV 所占的比重呈逐年上升的趋势。随着时间的推移，基因VII型分离株逐渐变为优势毒株。

新城疫病毒是有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组为15kb，编码至少六种蛋白，顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，分别为核衣壳蛋白(NP蛋白)、磷蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、融合蛋白((F蛋白)、血凝素-神经氨酸酶(HN蛋白)、大分子蛋白((L 蛋白)。NDV中有两个主要的成分-融合蛋白(F)和血凝素一神经氨酸酶(HN)都与病毒感染有关。HN介导病毒与宿主细胞受体的结合，使病毒吸附到细胞膜上；F介导病毒囊膜与宿主细胞浆膜的融合，促进病毒的穿入，还可以促进病毒在细胞间的感染。 F和HN均是病毒囊膜上的糖蛋白，均能产生中和抗体，都是重组疫苗的候补对象。研究人员发现将NDV F和HN基因插入FPV中构建重组病毒，FPV-NDV-F和 FPV-NDV-HN均可提供对发病和死亡的保护。Iritani等(1991)证明常规NDV疫苗和重组FPV-NDV结合使用比单独使用免疫效果好，Taylor等(1996)构建了表达NDV F 和HN基因的重组禽痘病毒，无论将其用于SPF鸡还是商品鸡都能有效的保护鸡抵抗强毒的攻击。

F蛋白是NDV中功能最多的蛋白之一，位于病毒的囊膜上，由1792bp组成，成熟的F蛋白由553个氨基酸残基组成，主要负责病毒囊膜与细胞膜的融合，是病毒感染细胞所必须的重要成分。在病毒的长期进化过程中，F蛋白的结构和功能保持着高度的稳定性，Toyoda等对多株NDV的F蛋白的氨基酸序列进行了比较，结果表明相互之间保守程度很高，同源性可达到89.3％～99.6％。其与病毒的感染作用密切相关，对病毒的毒力发挥决定作用，但不是唯一的决定因子。F蛋白含有三个已知的抗原表位，分别在161、72、343氨基酸残基处，Leu-343位于F1亚基C末端，这个部位高度保守并且含有大量的半胱氨酸，该表位在病毒的抗原性以及结构和功能上起重要作用。F1和F2的裂解位点之间有一个半胱氨酸残基，有利于位于F2亲水区的位点Asp-72同F1N末端接近，形成与抑制融合相关的抗原表位。位点Thr-161 位于F1N端，与前两个位点相比，该区的亲水性较低，被认为是病毒的融合体，它使病毒与细胞之间通过疏水作用而融合大多数毒株F蛋白氨基酸的变异集中在信号肽区(1～32aa)，因此，它不是F蛋白功能区的组成成分。最重要的差异存在于F蛋白的裂解区域(112-117aa)，其氨基酸序列及裂解能力是决定病毒毒力的关键，F0蛋白对蛋白水解酶的敏感性与其毒力强弱呈正相关。

HN蛋白是NDV除F蛋白之外另一种较大表面的糖蛋白，HN蛋白是一种纤突状糖蛋白，具有多种生物学功能，同时具有血凝素和神经氨酸酶活性。成熟的HN是一种四聚体寡聚蛋白。亚单位之间通过二硫键相连形成二聚体，两个二聚体非共价结合形成四聚体。HN蛋白是以氨基酸作为跨膜区的，不同NDV毒株HN蛋白的氨基酸序列差异主要集中在氨基端。HN蛋白的胞外区可以分为两个区域：一是靠近囊膜的柄状区，另一为末端球状区。球状区上面分布了受体结合位点和神经氨酸酶活性位点，但对柄状区的几个保守氨基酸进行突变，也会影响这种生物学功能。Stone-Huslande 等研究表明，HN蛋白的促进融合功能与HN和F蛋白间七肽重复序列的互动有关。

NP蛋白基因长度为1746bp，共编码489个氨基酸，分子量为56kD。NP蛋白是保守性相对较高的一个，NP基因在基因组中的位置正好是靠近病毒基因组RNA的位置，其与病毒的复制繁殖密切相关(Peeters et al.2000；Phillips et al.1998)。NP上分布了三类活性位点，即P蛋白结合位点、NP-NP相互结合位点和与RNA结合的位点。 NP蛋白可能是病毒转录与复制的切换因子，感染细胞内游离NP的浓度是控制病毒 RNA转录和复制的主要因素。NDV基因组的3’端和5’端均有一段RNA序列作为衣壳化信号。P蛋白通过和NP蛋白之间的相互作用，抑制NP对不含引导序列RNA 的结合，这种作用还提供了可溶性的Np蛋白来对新合成的RNA衣壳化。在NDV的多个蛋白中，随着分子生物学技术的不断发展，NP基因的研究价值越来越受到众多学者的重视。Kho等用体外蛋白结合试验证明P蛋白发生结合的位点位于NP蛋白N 端的前25个氨基酸区域，并且NP-P蛋白在此区域的结合是相当牢固的。Ahmad-Raus 等用一组单抗分析了NP蛋白上的抗原位点，结果发现，NP蛋白上存在3个抗原位点，一个位于NP蛋白C端441-489位氨基酸，另外两个在N端26-121位和122-375 位氨基酸之间。王同燕(2009)运用反向遗传技术构建重组病毒的试验表明，决定NDV 毒力的区域主要位于NP基因的编码区，并且是NP基因的保守区位置。

活疫苗一般由感染胚尿囊液冻干而成，它可以大规模饮水免疫，经济实惠，也可用于喷雾和气雾，在短时间内免疫大量鸡。B1株和LaSota株是天然弱毒株，几乎无致病性，可作为缓发型疫苗，经滴鼻，点眼，饮水，气雾等途径接种免疫，能达到较好的保护效果。而H株、Roakin株等属中发型的疫苗，由于毒力较强，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株等作活疫苗的，也能达到良好的免疫效果。活病毒感染能刺激机体产生局部免疫，免疫后可较快的得到保护，一般接种后3～5天就能产生抗体，抗体一般可维持20～30天。

灭活苗一般是由灭活的感染性尿囊液与载体佐剂混合后而制得的。目前，广泛使用的灭活苗为油乳剂灭活苗，多用Ulster2e，B1，LaSota及Rokin等作毒种来生产，这些毒株均能在鸡胚中大量增殖，并且在实际生产中也多用来制造二联苗或多联疫苗。灭活苗能够刺激机体产生有效的免疫应答反应，使抗体以较高的水平在体内持续较长时间，易于储存，使用多联苗可以节省劳动力，免疫效力受母源抗体影响较小，免疫后副作用小。但注射剂量和疫苗对免疫效果有很大的影响，由于灭活疫苗中需要添加佐剂，所以大大提高了免疫的成本。同时，接种灭活苗的机体产生针对病毒的特异性抗体，干扰了临床检测和检疫以及流行病学调查，这是以灭活苗防治ND的最大障碍。

抗原表位(epitope)又称做抗原决定簇(antigen determinant)，由参与抗原抗体分子间键形成的部分氨基酸残基组成，是抗原的核心组成部分，是能够被抗体分子或T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别抗原的特定区域。被Ab识别的抗原表位成为B细胞抗原表位，被TCR/MHC复合体识别的抗原表位称为T细胞抗原表位。这些表位是抗原性产生的结构基础，在此基础上提出了表位疫苗。表位疫苗存在着不需要分离传染性病原体、不会散毒、减少不同免疫优势抗原表位的互相干扰等优点。

发明概述

本发明以基因VII型新城疫病毒主要表面糖蛋白：融合蛋白(F)、神经氨酸酶(HN) 以及核衣壳蛋白(NP)B细胞表位、Th表位、CTL表位作为疫苗框架结构，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组基因VII 型新城疫多表位疫苗。本疫苗免疫靶动物后可诱导有效的体液免疫和细胞免疫反应。

本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防基因VII型新城疫的重组多表位疫苗多肽及其疫苗组合物；本发明的目的之二在于提供了所述新城疫多表位疫苗的构建及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述新城疫多表位疫苗的基因工程菌株；本发明的目的之四在于提供了所述多表位疫苗的制备方法；本发明的目的之五在于提供了所述新城疫多表位疫苗在预防基因VII型新城疫中的用途。

在第一方面，本发明提供了一种用于预防的重组基因VII型新城疫多表位疫苗多肽及其组合物。其含有主要囊膜糖蛋白：融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(NH) 及核衣壳蛋白(NP)的Th表位、CTL表位以及B细胞表位。所述的新城疫多表位疫苗蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。重组基因VII型新城疫多表位疫苗多肽氨基酸序列如下：

STSGGRRQKRFIGGGLPNMPRDKEAGGYLMYKQKAQQKTLGGSNSKLEKVNGSG AVNRVVLENEEGGISKTEDKVTGGDDTQNRKSGGKYVIYKRHNNTGSGLNSDDPE DRWNFAGDIPGCKVRIFLVSELKRGRNTAGGSSTYYNGGGRVQKKYILHPVCRSGS GTRIPAPLTLGSGGRVFFSTLRGGPSCFGTMLDDEQARLNPVGGKDWVANYPGVG GGSFGSGLEAYNRTLTTLLTPLGSGRIAVSEDANKPLRQGALISL

在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的新城疫多表位疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得新城疫多表位疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和 3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下：

tcc acg tct gga gga agg aga caa aaa cgc ttt ata ggt ggt ggt ctc ccg aat atg ccc aga gat aaa gag gca ggt ggt tac ctg atg tac aaa cag aag gca caa caa aag acc ttg ggt ggt agc aac agc aag cta gaa aaa gtc aat ggt tct ggt ctg gag aat gag gaa aga gaa gca aag aac aca ggt ggt atc tcc aag aca gaa gat aag gtt acg ggt ggt gat gac acc caa aat cgg aag tcc ggt ggt aaa tat gta ata tac aag cgc cat aac aac aca ggt tct ggt ctt aac agt gat gac cca gag gat aga tgg aat ttt gcg ggt gat atc cca ggt tgc aag gtc cgt att ttc tta gtt agt gag ctc aag agg ggc cgc aat aca gca ggt ggg agc tct aca tat tac aac ggt ggt ggt aga gtt cag aag aag tac atc ctt cac cct gta tgc agg agc ggt tct ggt acc agg atc cca gca cct cta acg ctg ggt tct ggt ggg agg gta ttc ttt tct act ctg cgc ggt ggt cca tct tgt ttc ggg acg atg ctt gat gat gaa caa gcg agg ctt aac ccc gta ggt ggt aag gat tgg gtg gca aat tac ccg gga gtg gga gga ggg tct ttt ggt tct ggt ttg gag gca tat aac aga aca ctg act act ctg ctc act cct ctt ggt tct ggt cgg att gct gtt agc gag gat gcc aac aaa cca ctc agg caa ggt gct ctt ata tcc ctc

在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码基因IIV型新城疫多表位疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。本发明中优选大肠杆菌BL21(DE3，Plys)作为表达载体。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的基因VII型新城疫多表位疫苗多肽。

在第五方面，本发明提供了一种基因VII型新城疫多表位疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达基因VII型新城疫疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。

在第六方面，本发明提供了一种用于预防基因VII型新城疫的重组新城疫多表位疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述多表位疫苗能够预防基因VII型新城疫的爆发。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。

在第七方面，本发明提供了第六方面所述的重组基因VII型新城疫多表位疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射接种动物，能够产生足够有效的体液免疫和细胞免疫反应(见实施例五、六、七、八、九、十)，刺激中和抗体产生，诱导外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞增殖，同时提供抗病毒活性，显著减少排毒，保护动物免于基因VII型新城疫病毒流行毒株的攻击。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行实验室安全性试验，表明本发明所述的重组基因VII型新城疫多表位疫苗是安全的(见实施例四)。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1重组基因VII型新城疫多表位疫苗表达质粒pRSETA-NDV(VII)构建图；图2pRSETA-NDV(VII)载体质粒酶切图，其中泳道1为DNAmarker，从上至下分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道2为酶切质粒，泳道3为未酶切质粒，泳道4为空质粒；图3SDS-PAGE检测图，其中泳道1为蛋白 Marker，从上至下依次为97KD、66KD、43KD、31KD、20KD、14KD，泳道2为未诱导对照样品，泳道3为诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白；图4Westernblot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为200KD、140KD、100KD、80KD、 60KD、50KD、40KD、30KD、20KD，泳道2为空白对照，泳道3为目的蛋白。图5 为发酵样品SDSPAGE图：其中泳道1为蛋白Marker，从上至下依次为97KD、66KD、 43KD、31KD、20KD、14KD，泳道2为阳性对照，泳道3为发酵诱导样品，泳道4 为未诱导样品；图6为发酵样品Westernblot检测图，其中泳道1为预染marker，从上至下依次为200KD、140KD、100KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD，泳道2为阴性对照，泳道3为阳性对照，泳道4为发酵纯化样品。图7为ELISA方法检测疫苗免疫原性结果；图8为亚单位疫苗免疫SPF鸡血清抗体滴度检测结果；图 9为疫苗免疫SPF鸡HI抗体检测结果；图10 SPF鸡外周血淋巴细胞增殖检测结果；图11为SPF鸡外周血CD4+T淋巴细胞百分含量检测；图12为SPF鸡外周血CD8+T 淋巴细胞百分含量检测。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。

实施例一 基因VII型新城疫多表位疫苗蛋白的设计思路

本发明根据目前国内基因VII型新城疫主要流行株基因组中与病毒感染有关两个囊膜糖蛋白：融合蛋白(F)、神经氨酸酶(HN)以及核衣壳蛋白(NP)氨基酸序列，利用相关生物信息学软件DNASTAR、Bcepred、Multipre、BIMAS和SYFPEITHI对流行株的F蛋白、HN蛋白及NP蛋白进行Th表位、CTL表位以及B细胞表位分析。将所设计表位串联后在大肠杆菌中表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的基因VII型新城疫多表位疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防基因VII型新城疫。

综合分析国内基因VII型新城疫病毒流行株基因组序列、抗原结构、流行病学研究进展，对重组新城疫多表位疫苗进行了优化设计。本发明利用生物信息学软件对基因VII型新城疫流行株的F蛋白、HN蛋白及NP蛋白进行了亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性等生物信息进行分析，预测可能的B细胞抗原表位、CTL表位以及T 细胞表位的基础上，根据表位位置和氨基酸序列的相似性，分析各流行毒株共有抗原表位，并参考GenBank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性，从而确定Thelper抗原表位多肽3段，CTL抗原表位多肽2段，CTL与Thelper联合抗原表位1段，B细胞抗原表位多肽3段，将所有表位串联后形成疫苗的骨架结构。该疫苗的总体结构为：

F B Cell Epitope-HN B Cell Epitope-NP B Cell Epitope-NP CTL+Thelper Epitope-F CTL Epitope-HN CTL Epitope-HN Thelper Epitope-F Thelper Epitope-NP Thelper Epitope

实施例二 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

1 将设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamHI(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，把这片段合成后分别克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为pMD18T-NDV(VII)。用相应的限制性内切酶将质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETA质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New England Biolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切 1.5小时。酶切结束后加入1μl 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.86kb pRSETA质粒和800bp NDV(VII)片段切下，按照Qiagen 公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1∶2～3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒分别命名为pRSETA-NDV(VII)，(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

2 转化：将pRSETA-NDV(VII)置冰上融化，加入2μl连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1mL LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12～16小时，直至克隆形成。

3 鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，可以切出相应新城疫疫苗基因大小片段的克隆，800bp，可初步确定为阳性克隆(见图2)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

4 诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.2mM IPTG，继续培养4小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在33KD(见图3)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养， SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图 4)；经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名pRSETA-NDV(VII)/BL21(DE3，Plys)。

实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化

1 发酵 取生产菌种pRSETA-NDV(VII)/BL21(DE3，Plys)，接种于2mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH 及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在40％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500mL，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.2mM)诱导表达，连续诱导5个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况(见图5)。

2 纯化 将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(I％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl (pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白 1∶100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24 小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；即得重组基因VII型新城疫多表位疫苗半成品原液，取半成品原液做westerblot检定(见图6)。

3乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至100μg/mL。取法国赛比克公司的 Montanide ISA 50V2佐剂，经过121℃，灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶ 50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80～100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。

实施例四 重组基因VII型新城疫多表位疫苗安全性试验

1 试验动物 30日龄SPF鸡20羽。

2 疫苗 由公司研发中心提供，批号为140505、140506、140507。

试验采用单因子完全随机化的试验设计，随机将20只30日龄试验动物随机分为 4组，3个批号组和对照组，每组5只，组间无体重差异。免疫组于每只鸡腿部肌肉注射疫苗0.3ml/头，观察至10日，对照组使用生理盐水乳化液0.3ml。免疫后，观察各实验动物的采饲、饮水、精神是否正常、是否有中毒症状、是否产生过敏反应、是否死亡或出现其他异常情况。免疫前及试验结束后，全部动物称重。对称重结果进行统计学分析。

3 结果

3.1 临床观察

3个免疫组动物免疫后均未观察到任何过敏反应或中毒症状，SPF鸡的精神、采饲、饮水、活动、粪便等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，且无死亡发生。

3.2 体重变化

结果见表1，与对照相比，三个免疫组动物体重增长与对照组差异不显著(P＞ 0.05)，表明免疫重组基因VII型新城疫多表位疫苗对动物的体重无不良影响。

表1 重组基因VII型新城疫多表位疫苗对SPF鸡体重变化的影响

批号 免疫前体重(g) 免疫后10天体重(g) 日增重(g) P 140505 251.72±22.86 428.63±39.94 17.26±3.31 ＞0.05 140506 247.65±20.69 422.25±41.57 16.92±2.15 ＞0.05 140507 255.37±25.51 433.71±44.62 18.84±2.88 ＞0.05 对照组 261.08±23.27 425.66±36.83 17.09±3.17 -

实施例五 动物试验分组及免疫

1 疫苗与攻毒用病毒

重组疫苗由红桥明勤研发中心提供，批号为140505、140506、140507，新城疫攻毒毒株LL01及La sota株活疫苗由广东永顺制药研发中心惠赠，批号为2014053。

2 试验动物

一日龄SPF鸡25只，预饲一周，适应环境。

3 分组与免疫分为5组，每组5只。

将两周龄SPF鸡分为5组，多表位疫苗组、活疫苗组及PBS对照组。免疫组分别肌肉注射多表位疫苗和活疫苗(La sota株)，0.2mL/只，首免后14天相同剂量加强免疫，PBS对照组免疫PBS乳化液，0.2mL/只。分别于免疫后7天、14天、21天、 28天翅静脉采血并用于疫苗免疫原性检测、HI抗体滴度检测以及细胞免疫水平检测 (淋巴细胞增殖测定及CD4+/CD8+T细胞亚群动态变化检测)，并于免疫后28天进行攻毒试验，攻毒剂量为105EID50/0.1ml，观察鸡发病死亡情况。发病的判定：羽毛蓬松、精神沉郁，对外界刺激反应不明显，饮食欲废退，出现上述症状之一即判为发病。于攻毒后1天、3天、5天、7天、10天采集咽喉拭子及泄殖腔拭子，用于排毒检测。

实施例六 重组蛋白免疫原性及抗体滴度检测

1 方法 采集首次免疫后的1、2、3、4周的血清，用终点稀释ELISA检测特异性IgG抗体。微孔板(Nunc Maxisorp，Nalge Nunc International，Denmark)用纯化的疫苗蛋白包被，2～8℃过夜；5％脱脂牛奶于37℃封闭1h，将采集的抗血清作1∶ 100倍稀释同时用免疫PBS的血清作为阴性对照，加入微孔板，100μL/孔，于37℃孵育1h，然后用兔抗鸡IgG-HRP的酶标二抗(1∶10000，Sigma)，加入微孔板，100 μL/孔，于37℃孵育1h。TAB底物避光显色10min，2M H2SO4终止反应，于450nm 波长下检测吸光度值。同时将检测为阳性的血清样本进行1∶10，1∶102，1∶103，1∶104， 1∶105，1∶106，1∶107，1∶108倍稀释，按照上述方法做ELISA检测。以最高血清稀释度的倒数作为抗体滴度，其平均吸光值(≥0.2)高于免疫前血清的平均吸光值+2SD，作为cutoff值。ELISA及HI效价检测，所得数值通过Microsoft Excel进行平均值及标准差计算。

2 结果

2.1 免疫原性检测

在首免后的第1周，免疫动物与对照动物的抗体水平无差异。首免后第2周，部分免疫组动物就发生了抗体阳转，平均抗体水平均高于免疫组，但未呈现显著差异。在随后的3、4周抗体水平依次升高，并明显高于对照组，呈现显著差异。对照组的SPF 鸡血清ELISA效价值始终在0.08-0.2之间波动。首免后3、4周，三个多表位疫苗及活疫苗组免疫血清ELISA效价在0.4-1.27之间波动。但三个多表位免疫组免疫SPF 鸡抗体水平与活毒疫苗组无显著差异(如表2及图7)。

表2 疫苗免疫原性检测

2.2 抗体滴度检测

由于首免后1、2周抗体水平较低，未进行抗体滴度检测。首免后3、4周，抗体水平上升明显，第3周四个免疫组最终平均抗体水平达到了1∶103以上，第4周四个免疫组最终平均抗体水平达到了1∶105以上，活疫苗组与多表位疫苗组差异不显著，免疫组抗体滴度检测显著高于对照组小鼠的血清抗体(见图8)。以上结果表明本发明设计的重组基因VII型新城疫多表位疫苗能够诱导高水平的特异性抗体。

施例七 血凝抑制(HI)抗体的检测

1 1％红细胞悬液的制备

采集实验组鸡血用2％的柠檬酸钠盐水抗凝，加5倍体积的生理盐水洗涤红细胞， 1000rpm离心10min，连续洗三次后加入细胞压积100倍体积的生理盐水重悬红细胞，摇匀后置4℃备用。

2 微量血凝试验(HA)

病毒血凝效价测定：取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加 25μL PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25μL PBS。吸取25μL标准新城疫抗原(北京康农兴牧科技)加入到第1列孔中，吹打3～5次充分混匀。从第1列孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25μL弃之，设第12列孔为红细胞对照。自右向左依次向各孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温(20～25℃)静置30min后观察结果，出现100％红细胞凝集的病毒最高稀释度即为该样品的病毒凝集价。

3 微量血凝抑制试验(HI)

在v型96孔血凝抑制板每排的第1到第11孔加入25μL PBS溶液，第12孔加入50μL PBS溶液作为阴性对照；在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL 加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL，设第11孔为病毒对照，第12孔为红细胞对照。在第1～11孔各加入25μL 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温下静置30min。自右向左依次向各孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温(20～25℃)静置40min 后观察结果，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

4 结果

所有免疫组的HI抗体水平随着时间逐渐升高，至免疫后28天，对照组未检测到 HI抗体。重组多表位疫苗组的HI抗体滴度均超过7.5，免疫组间不形成显著差异(P ＞0.05)。所有免疫组与PBS对照组形成极显著差异(P＜0.01)(见表3及图9)。

表3 SPF鸡免疫后不同时间段的HI抗体水平检测

实施例八 攻毒后排毒率检测

1 RNA 提取 于攻毒后第1天、3天、5天、7天、10天分别采集咽喉和泄殖腔棉拭子，用RT-PCR方法检测各组试验鸡的排毒情况：将咽喉拭子和泄殖腔棉拭子分别放入盛有1mL灭菌的0.01moL/L pH7.0～7.4PBS(内含青霉素2000IU/mL，链霉素 2mg/mL)中，加盖、编号。按照Trizol试剂盒说明书提取各样品病毒总RNA。

2 cDNA 的合成 体系RNA 6μL加入随机引物(10μmol/L)2μL、dNTP (10mmol/Leach)2μL、RNase抑制剂(RNasin)0.5μL(40U/μL)、AMV反转录酶 0.5μL(5U/μL)及5×RT缓冲液4ml，最后用DEPC水补至20μL。42℃反转录45分钟，然后94℃ 10min。

3 PCR扩增

根据Genebank上已发表的基因VII型新城疫毒株的基因序列，用Primer 5.0 软件设计针对F特异性引物一对，上游引物Primer1：5’-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3’，下游引物Primer2：5’-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3’，扩增片段大小为362bp。

4 PCR反应体系内含P1、P2引物各1μL(10μmol/L)、dNTP2μL(10mmol/L)、 TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)、cDNA3μL、10×PCR缓冲液5μL，最后用双蒸水补至 50μL。稍作离心后，进行PCR扩增。PCR最佳反应条件：95℃预变性5min，95℃变性 30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35cycles；最后72℃延伸10min。

5 鉴别：进行常规琼脂糖凝胶电泳，100v，30min凝胶成像系统下观察结果，在362bp处可见明显扩增片段为阳性结果，即排毒。

6 结果

免疫后1天，只有对照组出现一只SPF鸡排毒现象，未呈现明显临床症状。免疫后三天，免疫组SPF鸡开始排毒，除多表位疫苗140506组，其他三组均出现鸡只排毒，活疫苗组有2只免疫SPF鸡出现咽喉排毒，1只泄殖腔排毒，多表位疫苗140505、 140507组均出现一只免疫SPF鸡排毒。免疫后5天～7天，活苗组和多表位疫苗组各有一只SPF鸡仍旧排毒。免疫后10天，所有免疫组未发现排毒现象。整个攻毒期间，免疫组未表现为明显的临床症状。对照组在免疫后3天全部鸡只表现为明显的临床发病症状：腹泻、呼吸困难、精神不振、少食或不食。免疫后5天全部死亡(表4)。攻毒试验结果表明本发明所述的多表位疫苗具有抵抗基因VII型新城疫病毒感染的效力。

表4 攻毒后各组棉拭子的病毒检出结果

注：排毒率＝排毒动物数量/本实验组动物总量

实施例九 淋巴细胞增殖测定

1 无菌免疫后7天、14天、21天、28天SPF鸡外周抗凝血2mL，并与等体积的Hank′s液轻轻混匀，将稀释了的抗凝血缓慢加入含有4mL淋巴细胞分离液的离心管。常温下，2000rpm离心15min。用移液器小心转移位于离心管中间的白色细胞层。用无菌RPMI1640营养液洗2遍，每分钟1500rpm，离心，15min。台盼蓝染色，细胞统计，活细胞大于90％后，用RPMI 1640营养液调整细胞浓度为2.5×106个/ml，加入到96孔板中，每孔80μL，再加20μL PHA，每孔终体积为100μL。置于5％ CO2培养箱，39.5℃培养44h后，每孔加入20μL 5.0mg/mL MTT溶液，继续培养4h后，每孔加裂解液100μL，将细胞版置于微量振荡器上，振荡5分钟，使其完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm处的吸光值，作为T淋巴细胞增殖的指标。

2 结果

淋巴细胞增殖是反应集体细胞免疫水平的一个重要指标。细胞免疫可以通过致敏淋巴细胞与相应抗原作用而发挥病原体感染、抗肿瘤、协助B淋巴细胞产生抗体等作用。本实验表明与阴性对照相比，多表位疫苗与活疫苗均具有增强淋巴增殖的作用，并且具有一定的剂量效应从表5可以看出，除免疫后7～14天，免疫组各时间点A570值均显著高于空白对照组(P＜0.05)，免疫组组间差异不明显(P＞0.05)。所有免疫组在首免后28天达到高峰(表5及图10)。结果表明本发明所述新城疫多表位疫苗能够有效刺激细胞免疫，具有增强淋巴细胞增殖的作用。

表5 鸡外周血淋巴细胞增殖检测

组别 7天 14天 21天 28天 2014053活苗 0.162a±0.022 0.199c±0.033 0.367e±0.048 0.384g±0.055 140505多表位 0.178a±0.014 0.225c±0.029 0.371e±0.031 0.386g±0.074 140506多表位 0.181a±0.008 0.218c±0.014 0.374e±0.065 0.402g±0.061 140507多表位 0.165a±0.011 0.192c±0.023 0.359e±0.027 0.373g±0.044 对照组 0.156a±0.013 0.182c±0.021 0.177f±0.009 0.149h±0.036

注：同列数据后小写字母不同者表示差异显著(P＜0.05)

实施例十 鸡外周血T细胞亚群动态变化检测

1 预处理 取抗凝血0.1ml，加8ml红细胞裂解液，室温作用10分钟，1500r/min 离心10分钟，弃上清液，加5ml PBS混悬，1500r/min离心10分钟，重复2次。

2 荧光标记FITC标记大鼠抗小鼠单克隆抗μl(0.1μg)，4℃作用1小时，PBS 缓冲液洗1遍，将管底细胞用1ml PBS悬浮并测样。

3 统计分析FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学处理，计算其平均值。

4 结果

4.1 外周血CD4+T淋巴细胞百分含量的变化重组多表位疫苗免疫组及活疫苗组外周血CD4+T淋巴细胞数整体趋势为随免疫时间逐渐增加，到21天到达高峰， 28天开始略有下降。免疫后一周所有组间外周血CD4+T淋巴细胞百分含量无显著差异(P＞0.05)，两周后所有免疫组外周血CD4+T淋巴细胞数显著高于对照组细胞数异(P＞0.05)，两周后所有免疫组外周血CD4+T淋巴细胞数显著高于对照组细胞数 (P＜0.05)，多表位疫苗组与活疫苗组外周血CD4+T淋巴细胞数无显著差异(P＞ 0.05)(表6及图11)。

表6 疫苗免疫小鼠外周血CD4+T淋巴细胞百分含量变化

4.2 外周血CD8+T淋巴细胞百分含量的变化重组多表位疫苗免疫组及活疫苗组外周血CD8+T淋巴细胞数整体趋势为随免疫时间逐渐增加，与CD4+T淋巴细胞百分含量变化趋势类似，到首免后21天到达高峰，28天开始略有下降。免疫后一周， 140505多表位组及对照组外周血CD8+T淋巴细胞百分含量明显低于其他免疫组，两周后所有免疫组外周血CD8+T淋巴细胞数显著高于对照组细胞数(P＜0.05)，但多表位疫苗组与活疫苗组外周血CD8+T淋巴细胞数无显著差异(P＞0.05)(表7及图 12)。

表7 疫苗免疫小鼠外周血CD8+T淋巴细胞百分含量变化