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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510122517.2 (22)申请日 2015.03.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106032368 A (43)申请公布日 2016.10.19 (83)生物保藏信息 CGMCC No.8278 2013.09.27 (73)专利权人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103号 (72)发明人 李占林华会明王文静张金玲 李丹毅 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 靳玲 (51)In。
2、t.Cl. C07D 323/00(2006.01) C12P 17/08(2006.01) A61K 31/365(2006.01) A61P 35/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (56)对比文件 Robert A et al.Hot off the press. Nat. Prod. Rep. .2004,第21卷(第4期),第 H13-H15页. 辛华雯 等.聚酯型儿茶素对HL-60细胞的诱 导分化作用及其机制研究. 中国药理学通报 .2000,第16卷(第4期),第462-466页. Wen-Jing Wang et al.Caryophyllene 。
3、Sesquiterpenes from the Marine-Derived Fungus Ascotricha sp.ZJ-M-5 by the One Strain-Many Compounds Strategy. Journal of Natural Products .2014, (第77期),第 1367-1371页. 审查员 周静 (54)发明名称 一种聚酮化合物及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明属于医药技术领域， 涉及从一株刺囊 壳属真菌 （Ascotrichasp.） 中分离得到的一个 具有抗肿瘤活性的聚酮化合物及其制备方法。 本 发明所涉及的化合物结构新颖， 对人急性早。
4、幼粒 白血病HL-60细胞株和人白血病K562细胞株具有 显著的生长抑制作用， 并且其发酵工艺和提取分 离方法简便， 有利于对其进行进一步的药理和临 床研究， 开发其在制备抗白血病药物中的应用。 权利要求书1页 说明书6页 附图9页 CN 106032368 B 2018.09.25 CN 106032368 B 1.具有如式I结构的聚酮化合物： 2.一种制备如权利要求1所述聚酮化合物的方法， 其特征在于， 挑取刺囊壳属真菌 Ascotricha sp.ZJ-M-5， 保藏编号为CGMCC No.8278的孢子， 直接接种到液体培养基中静置 培养756天， 其中培养基由蒸馏水配制， 包含蔗糖2。
5、4， NaNO3 0.20.4， CaCl2 0.12 0.92， K2HPO4 0.050.15， KCl 0.030.07， FeSO47H2O 0.00050.0015， 培 养温度为2030， 发酵产物经过滤除去发酵液后， 菌丝体采用丙酮超声提取13次， 将提 取物合并后经120倍量200300目硅胶柱色谱分离， 以体积配比为5： 1-1： 1的石油醚-丙 酮混合溶剂梯度洗脱， 其中体积配比为3： 1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分得到式I化合 物。 3.一种药物组合物， 包括权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。 4.权利要求1所述的化合物或权利要求3所述的组合物在制备抗白血病药。
6、物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106032368 B 2 一种聚酮化合物及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及从一株刺囊壳属(Ascotricha sp.ZJ-M-5)真菌发 酵所得菌丝体中分离得到的一种具有抑制人白血病细胞株生长的聚酮化合物及其制备方 法。 背景技术 0002 微生物能够产生结构新颖并具有抗肿瘤、 抗感染等多样生物活性的次级代谢产 物， 因此从微生物中寻找药物先导化合物一直是创新药物研究的热点。 传统的微生物培养 采用提供丰富营养物质促进其生产的方式， 然而在此条件下， 大多数微生物的合成次级代 谢产物的基因处于沉默状态， 导。
7、致产生的次级代谢产物数量较少， 含量较低， 并且往往产生 很多诸如脂肪酸、 环二肽等非活性物质干扰提取分离。 有鉴于此， Axel Zeeck等人提出 OSMAC(one strain many compounds， 单菌多物)策略(ChemBioChem， 2002， 3： 619-627)， 即 通过改变培养基成分、 培养条件及添加酶抑制剂等方法， 激活在传统培养条件下微生物次 级代谢的 “沉默途径” ， 从而获取结构更为新颖、 活性更为多样和产量更为丰富的微生物来 源活性天然产物。 0003 刺囊壳属真菌(Ascotricha sp.ZJ-M-5)是通过化学和生物活性筛选， 从浙江奉化 。
8、市莼湖镇桐照村黄滩涂地的海泥样品中分离得到的一株能够产生抗肿瘤化合物的微生物。 发明人前期工作中， 从该菌株含有丰富营养物质的培养基发酵产物中获得了环橙花二醇类 衍生物(Natural Product Research， 2013， 27： 847-850)和一个C3， 4位裂环的羊毛脂烷型 三萜类化合物(药学学报， 2013， 48： 89-93)。 然而， 采用OSMAC策略， 通过改变培养基组成， 发 现该菌株在寡营养条件下的次级代谢与在含有丰富营养物质培养基条件下的次级代谢存 在显著的差异。 从其寡营养培养物的菌丝体中， 通过简单的提取分离工艺， 得到了一个新的 具有28元大环内酯结构。
9、的聚酮化合物。 0004 大环多聚内酯类化合物在自然界非常罕见， 仅由真菌产生， 从生合成角度考虑为 醋酸-丙二酸途径合成的不同片段之间相互缩合而成。 目前报道的该类结构主要由2,4-二 羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸片段和3-羟基丁酸或3,4-二羟基丁酸片段组成， 如NG-011和 NG012(The Journal of Antibiotics， 1992， 45： 1559-1565)， BK223-B和BK223-C(The Journal of Antibiotics， 1993， 46： 1101-1108)， 以及从Hypoxylon oceanicum LL-15G256 。
10、菌株中分离得到的15G156 系列衍生物(The Journal of Antibiotics， 1998， 51： 296-302； Tetrahedron， 2002， 58： 6825-6835)。 但如式I结构中， 含有2,4-二羟基-6-(4-羟基-2-酮-戊 基)-苯甲酸片段的大环多聚内酯类化合物国内外均未见报道。 大环多聚内酯类化合物目前 报道具有抗真菌和神经生长因子促进作用， 但其抗肿瘤活性， 尤其是对白血病细胞株的生 长抑制作用国内外均未见报道。 发明内容 0005 本发明提供一种从刺囊壳属真菌Ascotricha sp.ZJ-M-5中分离得到的对人白血 说明书 1/6 页 。
11、3 CN 106032368 B 3 病细胞株具有显著生长抑制作用的聚酮化合物。 本发明所述化合物的结构如式I所示： 0006 0007 本发明的制备技术方案包括如下步骤： 0008 挑取刺囊壳属真菌(Ascotricha sp.ZJ-M-5， 保藏号CGMCC No.8278)的孢子， 直接 接种到液体培养基中静置培养756天， 其中培养基由蒸馏水配制， 包含蔗糖24， NaNO30.20.4， CaCl2 0.120.92， K2HPO4 0.050.15， KCl 0.030.07， FeSO4 7H2O0.00050.0015， 培养温度为2030。 发酵产物经过滤除去发酵液后， 菌丝。
12、体采用 丙酮超声提取13次， 将提取物合并后经120倍量200300目硅胶柱色谱分离， 以体积配 比为5： 1-1： 1的石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱， 其中体积配比为3： 1的石油醚-丙酮混合溶 剂洗脱部分得到式I化合物。 0009 所得化合物经过系统结构鉴定结果如下： 主要利用高分辨电喷雾质谱、 二级低分 辨电喷雾质谱、 核磁共振谱(1H NMR， 13C NMR， 2D-NMR)。 0010 式I化合物为白色粉末(甲醇)， 20D-52.0 (c 0.25， CH3OH)， 易溶于甲醇。 0011 HRESI-MS(图1)给出准分子离子峰m/z： 819.2465M+Na+， 795.2。
13、501M-H-确定化 合物分子式为C40H44O17。 0012 1H NMR(600MHz， DMSO-d6)谱(图2)中给出6个酚羟基质子信号： 10.80(1H， s)、 10.36(1H， s)、 10.28(1H， s)、 10.19(1H， s)、 9.90(1H， s)、 9.86(1H， s)， 在 6.23(1H， d， J 2.3Hz)和6.14(1H， d， J2.3Hz)处给出一组间位偶合的芳香质子信号， 在 6.166.18范围 内给出4个呈单峰的芳香质子信号， 在 5.35(2H， m)、 5.30(1H， m)和4.99(2H， m)处给出5个 sp3杂化的连氧次。
14、甲基质子信号， 在 3.89(1H， d， J17.4Hz)和3.78(1H， d， J17.4Hz)处给 出sp3杂化亚甲基上一组偕偶的质子信号， 在 2.613.03处给出10个sp3杂化碳上质子信 号， 在高场区给出5个甲基双峰质子信号： 1.30(3H， d， J6.2Hz)、 1.25(3H， d， J6.2Hz)、 1.19(3H， d， J6.2Hz)、 1.11(3H， d， J6.2Hz)和1.08(3H， d， J6.2Hz)。 13C NMR(150MHz， DMSO-d6)谱(图3)中共给出40个碳信号， 其中包括1个酮羰基碳信号： 204.3， 5个酯羰基碳 信号： 。
15、169.3、 169.2、 168.6、 168.3和168.2， 18个苯环上的碳信号， 5个sp3杂化的连氧次甲 基碳信号： 71.3、 71.2、 68.2、 68.1和67.6， 6个sp3杂化的亚甲基碳信号： 49.4、 46.9、 40.2、 40.0、 39.6和39.4， 以及5个甲基碳信号： 19.8、 19.4、 19.3、 19.2和19.2。 通过HSQC(图4)图 谱将以上碳氢信号归属， 进一步通过HMBC(图5)图谱推导出式I化合物结构中存在两个3-羟 基丁酸片段， 两个2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸片段和一个2,4-二羟基-6-(4-羟 基-2-酮-。
16、戊基)-苯甲酸片段， 并通过HMBC谱(图5)归属了上述5个片段中的碳氢信号。 从上 述片段中连氧次甲基质子信号位于较低场区及酯羰基碳信号化学位移大小， 结合化合物分 说明书 2/6 页 4 CN 106032368 B 4 子式判断， 以上各片段中羧基均和另一个片段的醇羟基形成酯， 即式I化合物结构中不存在 游离的羧基和醇羟基， 而是一个大环多聚内酯结构。 由于在HMBC(图5)谱图中没有观察到各 片段之间连氧次甲基质子信号和相应酯羰基之间的远程相关， 片段之间的连接方式借助低 分辨ESI-MS(图6)二级碎片离子(图7)的结构归属来完成。 在负离子模式下， 对m/z 795.4 M-H-进。
17、行裂解(图8)， 可以观察到其发生麦氏重排后脱去1个2,4-二羟基-6-(2-羟基丙 基)-苯甲酸片段后形成的m/z 601.1碎片(图8)， 该碎片继续脱去1个3-羟基丁酸片段后形 成的m/z 515.1碎片(图8)， 以及m/z 515.1碎片脱去1个2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲 酸片段后形成的m/z 320.9碎片(图8)， m/z 515.1碎片发生麦氏重排形成的m/z 279.0碎片 (图8)， m/z 515.1碎片脱去2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸-3-羟基丁酸酯形成的 m/z 234.9碎片(图8)， 以及m/z 515.1碎片脱去1个2,4-二羟基。
18、-6-(2-酮-3-戊烯基)-苯甲 醛形成的m/z 296.9碎片(图8)。 以上碎片可以很明确地将式I化合物各个片段的连接顺序 确定为2,4-二羟基-6-(4-羟基-2-酮-戊基)-苯甲酸2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯 甲酸3-羟基丁酸2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸3-羟基丁酸， 然后末 端的3-羟基丁酸片段的醇羟基又与2,4-二羟基-6-(4-羟基-2-酮-戊基)-苯甲酸的羧基成 酯， 从而形成式I化合物的28元大环内酯结构。 其各结构片段1H NMR和13C NMR信号归属于表 1中。 0013 0014 表1.式I化合物的1H NMR和13C NMR信号归属 说。
19、明书 3/6 页 5 CN 106032368 B 5 0015 0016 式I化合物结构中手性碳原子的绝对构型通过对其生合成片段测试比旋光度或圆 二色谱(CD)进行确定。 其中从该菌株的发酵液中， 分离得到比旋光度为-54 .4 的 orthosporin， 而文献Tetrahedron， 1996， 52： 7159-7162中该化合物结构中手性碳为S构 型时其旋光方向为右旋， 由于orthosporin应该为2,4-二羟基-6-(4-羟基-2-酮-戊基)-苯 甲酸通过分子内烯醇化和酯化反应而得， 因此确定式I化合物结构中2,4-二羟基-6-(4-羟 说明书 4/6 页 6 CN 1060。
20、32368 B 6 基-2-酮-戊基)-苯甲酸片段的C-11位手性碳为R构型。 此外， 从该菌株发酵液中， 分离得到 6-hydroxymellein， 测得其CD图谱(图9)与文献Tetrahedron， 2002， 58： 6825-6835中报道 的手性碳为R构型， 且旋光方向为左旋的该化合物的CD图谱一致， 即在267nm呈负的Cotton 效应， 由于6-hydroxymellein应该为2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸通过分子内酯化 反应而得， 因此确定式I化合物结构中2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸片段的手性中 心， 即C-21和C-35位为R构型。 根据。
21、生合成途径中3-羟基丁酸片段应该与2,4-二羟基-6-(4- 羟基-2-酮-戊基)-苯甲酸片段和2,4-二羟基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸片段共用相同的酮 基还原酶， 以及式I化合物比旋光度也为左旋， 确定3-羟基丁酸片段中手性中心， 即C-25和 C-39位手性碳为R构型。 综上， 确定了式I化合物的平面结构及绝对构型。 0017 对所得到的式I化合物进行人白血病细胞株生长抑制活性的测试。 实验结果表明 式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白血病K562细胞株具有显著的 生长抑制作用， GI50值为6.77.7 M， 且作用强度均高于阳性对照药顺铂数倍， 因此， 本发明。
22、 所述的新聚酮化合物具有制备临床白血病预防和治疗药物的前景。 0018 本发明的优点在于， 所得到的化合物结构新颖， 在国内外未见其结构类似物的报 道， 且其具有抑制肿瘤细胞生长的活性。 其发酵培养基组成简单， 提取分离方法简易， 发酵 产量高， 便于对其进行进一步的药理和临床研究， 为开发疗效好且毒副作用小的新型抗白 血病药物提供先导化合物。 0019 本发明所用的菌种ZJ-M-5由中国科学院微生物研究所鉴定为刺囊壳属真菌 (Ascotricha sp.)， 检验鉴定报告编号： (2011)微检字第227号， 并于2013年9月27日由中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC。
23、)保藏， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1 号院3号， 保藏编号为CGMCC No.8278。 附图说明： 0020 图1： 式I化合物的高分辨ESI-MS谱； 0021 图2： 式I化合物的1H NMR谱； 0022 图3： 式I化合物的13C NMR谱； 0023 图4： 式I化合物的HSQC谱； 0024 图5： 式I化合物的HMBC谱； 0025 图6： 式I化合物的低分辨ESI-MS一级谱； 0026 图7： 式I化合物的低分辨负离子ESI-MS二级谱； 0027 图8： 式I化合物的低分辨负离子ESI-MS二级谱中主要碎片离子结构归属； 0028 图9： 由式I化合物中2 ,4-二羟。
24、基-6-(2-羟基丙基)-苯甲酸片段形成的6- hydroxymellein的CD图谱。 具体实施方式： 0029 下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明， 但不以任何方式限制 本发明。 实施例1： 式I化合物的制备： 0030 挑取刺囊壳属真菌(Ascotricha sp.ZJ-M-5， 保藏号为CGMCC No.8278)的孢子， 直 接接种到液体培养基中静置培养28天， 其中培养基由蒸馏水配制， 含有蔗糖3， 说明书 5/6 页 7 CN 106032368 B 7 NaNO30.3， CaCl20.46， KCl 0.05， FeSO47H2O 0.001， K2HPO40。
25、.1， 培养温度为25 。 发酵产物经过滤除去发酵液后， 菌丝体采用丙酮超声提取3次， 将提取液合并回收溶剂 后经3倍量200300目硅胶柱色谱分离， 以体积配比为5： 1-1： 1的石油醚-丙酮混合溶剂梯 度洗脱， 其中体积配比为3： 1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分， 经Sephadex LH-20柱色谱， 甲醇为洗脱剂纯化后得到式I化合物， 收率为12mg/L。 0031 实施例2： 式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白血病K562 细胞株的生长抑制实验： 0032 HL-60或K562细胞培养于含有10经加热灭活的胎牛血清、 100IU/mL青霉素、 100 g/。
26、mL链霉素及1mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液中， 置37、 5CO2的饱和湿度培养 箱中孵育， 待细胞70-80融合使用。 称取台盼蓝， 加少量蒸馏水研磨， 加双蒸水稀释到 4的储存浓度， 用滤纸过滤， 4保存。 使用时， 将该储存液用PBS稀释至0.4工作浓度。 取 HL-60或K562细胞以3104个/mL密度， 每孔1mL接种于24孔板中后， 随即加入不同浓度药物 或阳性对照药(终浓度为0.1、 0.5、 1、 3、 10、 30、 100 M)， 对照组加入等容积DMSO。 孵育72小时 后制备单个细胞悬液， 取50 L细胞悬液加入50 L的0.4台盼蓝溶液， 混匀。
27、， 在3分钟内， 于 显微镜下观察， 用血球计数板分别计数各组活细胞和死细胞(死细胞被染成蓝色， 而活细胞 拒染)。 利用下列公式求得细胞生长抑制率并计算GI50， 结果如表2所示。 抑制率1(加药 孔细胞数/对照孔细胞数)100。 0033 表2 式I化合物对HL-60和K562细胞的生长抑制作用GI50SE( M),n6 0034 0035 体外实验结果表明式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白 血病K562细胞株表现出显著的生长抑制作用， 其作用均强于阳性对照药顺铂， 因此具有开 发成为抗白血病药物的前景。 说明书 6/6 页 8 CN 106032368 B 8 图。
28、1 说明书附图 1/9 页 9 CN 106032368 B 9 图2 说明书附图 2/9 页 10 CN 106032368 B 10 图3 说明书附图 3/9 页 11 CN 106032368 B 11 图4 说明书附图 4/9 页 12 CN 106032368 B 12 图5 说明书附图 5/9 页 13 CN 106032368 B 13 图6 说明书附图 6/9 页 14 CN 106032368 B 14 图7 说明书附图 7/9 页 15 CN 106032368 B 15 图8 说明书附图 8/9 页 16 CN 106032368 B 16 图9 说明书附图 9/9 页 17 CN 106032368 B 17 。