Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103451291 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451291 A *CN103451291A* (21)申请号 201310390769.4 (22)申请日 2013.09.02 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 金芜军 宛煜嵩 徐潮 张秀杰 苗朝华 黄卫红 (74)专利代理机构 北京知本村知识产权代理事 务所 11039 代理人 刘江良 (54) 发明名称 Cry1Ab/Cry。

2、1Ac 抗虫基因 RPA 检测方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 适 用 于 重 组 酶 聚 合 酶 等 温 扩 增 技 术 （Recombinase Ploymerase Amplification， RPA）用于鉴定含有转 Cry1Ab/ Cry1Ac 基 因 （Cry1Ab 基 因， Cry1Ac 基 因 或 Cry1Ab/c融合基因） 抗虫植物的引物及探针组合， 其正向引物序列如 SEQIDNo.1 所示， 反向引物序 列如 SEQIDNo.2 所示， 探针序列如 SEQIDNo.3 所 示。 同时， 本发明还公开了一种鉴定转有该基因植 物的方法 ： 提取待测样品的 。

3、DNA 作为模板， 利用所 述的引物进行 RPA 快速扩增及实时荧光检测， 如 果得到明显的扩增曲线， 则证明所检样品 DNA 中 含有转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因成分。本发明提供了 转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因抗虫作物的基因特异性的 RPA 检测方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103451291 A CN 103451291 A *CN103451291A* 1/1 页 2 1。

4、.一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因成 分的 RPA 引物和探针组合， 其特征在于 ： 其正向引物序列如 SEQ ID No.1 所示， 反向引物序 列如 SEQ ID No.2 所示， 探针序列如 SEQ ID No.3 所示。 2. 一种鉴定含有转 Cry1Ab 和 / 或 Cry1Ac 基因抗虫植物的试剂盒， 其特征在于 ： 该试 剂盒包含权利要求 1 所述的引物和探针组合。 3. 一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转 Cry1Ab 和 / 或 Cry1Ac 基因抗虫 植物的方法， 其特征在于 ： 提取待测样品的 DNA 作为模板， 利。

5、用权利要求 1 所述的引物和 探针组合进行快速扩增及实时荧光检测， 如果得到明显的扩增曲线， 则证明所检样品为转 Cry1Ab 和 / 或 Cry1Ac 基因产品。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 向 RPA 扩增试剂盒推荐反应的 50L 扩增体系中加入 10mol/L 的引物各 2L， 10mol/L 的探针 0.5L， 模板 DNA 50ng ； 扩增程序为 ： RPA 扩增检测仪或荧光定量 PCR 仪于 39 摄氏度反应 15 分钟， 或者当待测 样品的 DNA 为粗提取 DNA 为模板时， 反应 30 分钟。 权 利 要 求 书 CN 103451291 A 2 1。

6、/4 页 3 Cry1Ab/Cry1Ac 抗虫基因 RPA 检测方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及的是用于重组酶聚合酶等温扩增技术 （Recombinase Ploymerase Amplification, RPA）技术快速鉴定抗虫转 Bt 基因植物中 Cry1Ab/Cry1Ac 基因 （Cry1Ab 基因， Cry1Ac 基因或 Cry1Ab/c 融合基因） 成分。 背景技术 0002 目前 DNA 扩增是核酸检测的主要方法， 常用的 PCR 检测需要精密的仪器以及繁琐 的试验程序， 难以满足非实验室环境下现场检测的要求。 近年来， 核酸恒温扩增技术得到了 长足的发展。

7、， 与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪， 可在短时间内快速扩 增出目的片段， 具有简便， 快速， 灵敏等优点。RPA 技术是模拟生物体内 DNA 复制、 基于重组 酶聚合酶介导的扩增原理发展而来， 利用重组酶和引物形成微丝在模板 DNA 上搜索到与之 完全互补的序列时 , 在单链 DNA 结合蛋白的帮助下 , 使模板 DNA 解链 , 引物与模板 DNA 开始配对形成复制所需自由的3 羟基末端， 在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸, 形成新 的 DNA 互补链反应产物也是以指数级增长。与常规 PCR 反应不同， RPA 反应所需引物长度 通常为30-35nt。 引物设计时为了。

8、避免形成引物内部及之间的二级结构， 其长度的增加也使 引物设计及选择难度增加， 引物序列的设计与选择对 RPA 的结果至关重要。在 RPA 扩增体 系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测， 该探针中部两个 T 碱基上各 标记一个荧光集团 （FAM 和 BHQ1） ， 在两个集团之间有一个脱碱基位点 （dSpacer） ， 该位点可 被一种来自大肠杆菌的核酸外切酶识别， 该酶具有 3 -5 外切酶活性， 可以使两个荧光集 团分离， 从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步。结合一个便携式的荧光扩增检测仪便 可在 10-20 分钟内检测到荧光曲线。RPA 技术极大地缩短了检测时间， 简化。

9、了反应程序， 与 DNA 快速提取技术相结合使野外检测成为可能， 具有广泛的应用前景。 0003 PCR 技术对转基因产品检测的方法有筛选检测， 基因特异性检测， 构建特异性检测 和转化体特异性检测。其中基因特异性检测是指对转化的外源目的基因进行检测。苏云金 芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis） 是一种寄生在昆虫体内的细菌， 它可以产生由 Bt 基 因编码的杀虫晶体蛋白使一些宿主害虫致病。通过生物技术手段将 Bt 杀虫基因整合到农 作物基因组中， 使一些作物具有抗虫特性。 0004 目前转 Bt 基因植物及其产品种类繁多， 引起了公众的广泛关注， 建立一种快速简 便的室外。

10、检测方法具有重要意义， 可用于市场监管和例行监测， 为转基因生物安全管理提 供技术支撑。在已报道的转基因植物检测方法中， 主要是利用 PCR 仪在实验室中进行常规 的检测， 该方法还不能进一步满足转基因产品的快速检测。国内外目前还没有利用 RPA 技 术对转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因植物做基因特异性鉴定。 发明内容 0005 针对上述领域的空白， 本发明提供了准确、 快速、 简便检测转Cry1Ab和/或Cry1Ac 基因 （Cry1Ab 基因， Cry1Ac 基因或 Cry1Ab/c 融合基因） 的水稻、 玉米及棉花等基因特异性 说 明 书 CN 103451291 A 3 2/4 页。

11、 4 的 RPA 检测方法。 0006 本发明提供的技术方案是 ： 一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转 Cry1Ab 和 / 或 Cry1Ac 基因抗虫植物的引物， 其正向引物序列如 SEQ ID No.1 所述， 反向引 物序列如 SEQ ID No.2 所述， 探针如 SEQ ID No.3 所示。 0007 本发明还提供一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因植物的方法 ： 提取待测样品的DNA作为模板， 利用权利要求1所述的引物进行荧光快速 检测， 如果得到明显的扩增曲线， 则证明所检样品为转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因产品。实施步。

12、骤 为 ： 向 RPA 扩增试剂盒推荐反应的 50L 扩增体系中加入引物各 2L（10mol/L） ， 探针 0.5L（10 mol/L） ， 模板 DNA 50ng。RPA 扩增检测仪 （或荧光定量 PCR 仪） 39 摄氏度反 应 15 分钟， 或者当待测样品的 DNA 为粗提取 DNA 为模板时， 反应 30 分钟。 0008 本发明方法是通过比对Cry1Ab基因、 Cry1Ac基因及Cry1Ab/c融合基因的序列， 寻 找保守区段， 设计大量 RPA 引物及探针， 从中筛选出一套可快速有效检测出 Cry1Ab/Cry1Ac 基因成分的引物及探针组合。利用该对引物进行快速扩增及实时荧光检。

13、测， 以转基因水稻 华恢 1 号 （TT51-1） 等 6 种阳性样品的基因组 DNA 为模板可以得到明显的扩增曲线， 以非转 基因水稻明恢63和玉米两种阴性样品的基因组DNA为模板扩增均没有扩增曲线 （图1） 。 将 阳性模板 TT51-1 基因组 DNA 用水稀释至 10000， 2000， 500， 100， 50 个拷贝， 结果都有扩增 曲线 （图 2） ， 该方法具有较高的灵敏度。以转基因水稻 TT51-1 和棉花 Mon531 叶片为材料 进行 DNA 简单粗提取， RPA 实验结果表明阳性材料均有扩增曲线 （图 3） ， 这样极大摆脱了检 测过程中对仪器的要求并缩短了检测时间， 。

14、为 RPA 方法用于野外检测提供了有力的技术支 持。本发明首次提供转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因抗虫作物的基因特异性的 RPA 荧光检测方法。 该方法使生物技术产品在准确、 快速检测方面的能力得到提高。 0009 附图说明 0010 图 1 为 Cry1Ab/Cry1Ac 特异性检测图， 其中， 1 ： 转 Cry1Ab 基因玉米 Bt11 ； 2 ： 转 Cry1Ab/c 融合基因水稻 TT51-1 ； 3 ： 转 Cry1Ac 基因水稻科丰 6 号 ； 4 ： 转 Cry1Ab 基因水稻克 螟稻 1 ； 5 ： 转 Cry1Ac 基因棉花 Mon531 ； 6 ： 转 Cry1Ac 。

15、基因棉花 Mon15985 ； 7 ： 非转基因水稻 明恢 63 ； 8 ： 非转基因玉米。 0011 图 2 为灵敏度试验图， 从 1 到 6 模板拷贝数依次为 10000 ； 2000 ； 500 ； 100 ； 50 ； 0 图 3 为植物叶片基因组粗提取用于 RPA 方法分析图， 其中， 1 和 2 ： TT51-1 ； 3 和 4 ： Mon531 ； 5 ： 明恢 63。 具体实施方式 0012 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明， 但并不是对本发明的限 制， 仅仅作示例说明。 0013 下面实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambroo。

16、k 等 的 分子克隆 ： 实验室手册 （New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001） 中所述条件， 或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。 0014 首 先， 设 计 引 物 ： 根 据 TT51-1 （Cry1Ab/c, GenBank No. EU880444） 、 Mon531 说 明 书 CN 103451291 A 4 3/4 页 5 （Cry1Ac, GenBank No. AR656168） 、 Bt11（Cry1Ab, GenBank No. GV597352） 和 Mon15985 （Cry1Ac, GenBank 。

17、No. EA135632） 四种材料中含有的不同抗虫基因序列进行对比并在在 保守区设计通用引物和探针。RPA 对引物长度要求为 30-35nt， 这就容易导致在恒温条件下 产生大量的引物二聚体从而影响实验效果， RPA 实验需要从靶标序列两端设计多对引物进 行优化， 筛选， 个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。 本实验中设计并筛选 出了一对灵敏度高且特异性好的引物用于 RPA 荧光检测， 引物和探针序列见 SEQ ID NO.1， SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.3（表 1） 。 0015 注 ： FAM: 发光基团 ； dSpacer ： 脱碱基位点 ； BHQ1。

18、 ： 淬灭基团 ； phosphate ： 磷酸基团 1实验材料 （1） 植物材料 转基因水稻 TT51-1 （转 Cry1Ab/c 融合基因） ， 转基因水稻科丰 6 号 （转 Cry1Ac 基因） ， 转 基因水稻克螟稻 1 （转 Cry1Ab 基因） ， 非转基因水稻明恢 63， 转基因棉花 Mon531 （转 Cry1Ac 基因） ， 转基因棉花 Mon15985（转 Cry1Ac 基因） 种子粉末 （含量 1%） ， 转基因玉米 Bt11 种子 粉末 （转 Cry1Ab 基因） ， 非转基因棉花。 0016 （2） 酶与试剂 分子生物学试剂， TwistAmp DNA Amplifi。

19、cation Exo Kits 购自TwistDX公司， 其他生 化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京生工生物技术有限公司合成。 0017 （3） 实验仪器 DNA 处理仪器 ： 低温混合球磨仪 MM400（Retsch） 荧光检测仪 ： RPA 扩增检测仪 （Twista） 或荧光定量 PCR 仪。 0018 其它仪器包括 ： 恒温水浴锅、 电子天平、 离心机、 涡旋仪、 纯水仪、 恒温培养箱等。 0019 2实验方法和过程 （1） 植物基因组 DNA 的提取 a.水稻嫩叶片或玉米、 棉花种子粉末作为DNA提取材料， 依照TianGen Plant Genomic DNA Kit。

20、（Cat#DP-305） 试剂盒的操作手册， 进行植物总 DNA 的提取。 0020 b. 植物基因组粗提取 ： 剪取水稻或棉花叶片 100mg 放于 2.0mL 离心管中， 将离心 管放入液氮中冷冻片刻， 拿出后迅速用枪头将其捣碎。向管中放入 600mL 去离子双蒸水溶 解， 之后可将溶解液作为模板直接加入 RPA 反应体系中进行检测。 0021 （2） DNA 浓度和纯度测定 使用 NanoDrop 1000 分光光度计 （Thermo Scientific） 测定 DNA 的纯度和浓度， 并用 去离子双蒸水调节 DNA 浓度至 40-50ng/L。 0022 （3） 引物扩增 说 明 书。

21、 CN 103451291 A 5 4/4 页 6 本实施例中用于 PRA 方法扩增植物基因组中外源插入基因的一个片段， 以此来鉴定转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因水稻， 棉花和玉米， 模板浓度为 40-50ng/L。 0023 RPA扩增体系为 ： 总体系50L， 向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中 加入再水化缓冲液 29.5L， 醋酸镁溶液 2.5L（280mmol/L） ， 引物各 2L（10mol/L） ， 探针 0.5L（10mol/L） ， 模板 DNA 50ng， 剩余用水补足 ； 引物扩增程序 ： RPA 扩增检测仪 39 摄氏度反应 15 分钟 。

22、（粗提取 DNA 为模板反应 30 分 钟） 。 0024 3实验结果 根据 Cry1Ab/Cry1Ac 基因序列设计正向引物和反向引物， 对转基因水稻 TT51-1 等 8 种 样品基因组DNA进行RPA荧光检测， 能够快速准确地鉴定出样品中是否含有Cry1Ab/Cry1Ac 基因， 其中在 TT51-1 等 6 种样品有明显的荧光曲线， 而非转基因水稻明恢 63 和非转基因玉 米两种材料中均没有扩增曲线， 结果与预期相符， 如图1中所示。 将模板用水稀释至10000， 2000， 500， 100， 50 个拷贝， 结果都有扩增曲线 （图 2） 。以转基因水稻 TT51-1 和棉花 Mon。

23、531 叶片为材料进行 DNA 简单粗提取， RPA 实验结果表明阳性材料均有扩增曲线 （图 3） ， 说明利 用本发明设计的引物和方法鉴定转 Cry1Ab/Cry1Ac 基因植物具有较高的准确性， 灵敏性， 且使用于植物田间的转基因检测。 说 明 书 CN 103451291 A 6 1/1 页 7 中国农业科学院生物技术研究所 Cry1Ab/Cry1Ac 抗虫基因 RPA 检测方法 3 1 35 DNA 1 GCTATCCCAT TGTTCGCAGT CCAGAACTA CCAAGT 2 35 DNA 2 CCTAGTAAGG TCGTTGTAAC GGCTATTGAT GGTTG 3 45 DNA 3 TAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTACGGTTTGGGCAAAG 序 列 表 CN 103451291 A 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103451291 A 8 2/3 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103451291 A 9 3/3 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103451291 A 10 。