技术领域
本发明属于生物学领域，涉及CYP2D6等位基因第3177位的单碱基突变。更具体地，本发明涉及包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段、鉴定所述突变位点的试剂、检测方法和鉴定该位点在指导用药中的应用。
背景技术
细胞色素P4502D6（CYP2D6）是CYP酶家族重要的成员之一。其基因位于第22号染色体上，包括9个外显子，基因全长9432bp（GenBank注册号M33388，外显子区位于第1620-5909位）。人体内该细胞色素的量只占肝脏酶总量的2%～4%，却参与临床上20%～30%药物的代谢，这样药物包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药、止咳药、止吐药、抗糖尿病药及β受体阻滞药等，研究其代谢多态性具有十分重要的临床应用价值（参见参考文献1）。
CYP2D6基因具有高度多态性。目前为止，NCBI SNP数据库中已经收录了超过300个突变位点。由CYP450国际命名委员命名的等位基因也已有150多个，另外还有多种新发现的突变型尚未被命名（http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm）。每个等位基因都不同程度涉及点突变、缺失、插入、重排等，从而影响CYP2D6的活性，进而影响对药物的代谢活性，产生不同程度的药物效应。除去野生型CYP2D6*1外，目前研究较多且临床意义较大的突变型主要包括以下7种：CYP2D6*2、*3、*4、*5、*10、*17、*41，其中人种分布最广、研究最多、中国人群研究资料相对最丰富的突变型是CYP2D6*2（2850C>T；4180G>C）和CYP2D6*10（100C>T；4180G>C）（参见参考文献1、2、3）。
根据目前的临床研究显示，CYP2D6基因的这种多态性是造成CYP2D6酶活性在个体之间差异显著的主要原因，携带不同CYP2D6基因型的个体间可引起药物疗效的极大差异，甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此，研究CYP2D6基因多态性对药物疗效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据（参见参考文献3、4）。
发明内容
本发明的目的是提供CYP2D6基因的新的单碱基突变位点，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在用药指导中的应用。
本发明的第一个方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第3177位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第3177位的核苷酸是A；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1006位的核苷酸是A；或者所述核酸片段为上述核酸片段的反向互补序列。
本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第3177位或对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点的核苷酸是A；所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。
本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析本发明的单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含能够作为引物扩增所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段；所述单碱基对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位。
本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸在检测CYP2D6基因突变中的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用于制备检测CYP2D6基因突变的药物的应用；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
本发明的第五个方面是提供一种用药指导，包括检测待测样品中CYP2D6基因的对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的单碱基突变；根据检测到的突变，调整由CYP2D6代谢的药物的给药量。
本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第3177位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸。
本发明的第七个方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第336位的天冬酰胺，并且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个 连续氨基酸。
本发明提供了包含新的单碱基突变的CYP2D6基因和编码序列。该基因在对应于SEQ ID NO.2的第1006位核苷酸由G突变为A（1006G>A），从而引起其编码的氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺，即对应于SEQ ID NO.3的第336位的天冬酰胺。该突变的CYP2D6蛋白（命名为D336N）对药物的代谢活性与野生型相比降低。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。
附图说明
图1是实施例1中的对应于本发明的SEQ ID NO.1序列的杂合子携带者测序图谱，其中箭头所指为CYP2D6基因第3177位核苷酸；
图2是实施例2构建的双基因表达载体pIRES-Gluc-2D6的结构示意图谱；
图3是实施例2中所示的CYP2D6.1（野生型）、CYP2D6.2（缺陷型突变体）、CYP2D6.10（缺陷型突变体）和本发明的D336N蛋白针对丁呋洛尔的代谢能力检测结果，其中*表示p值<0.05；
图4是实施例2中所示的CYP2D6.1（野生型）、CYP2D6.2（缺陷型突变体）、CYP2D6.10（缺陷型突变体）和本发明的D336N蛋白针对丁呋洛尔代谢的典型LC-MS/MS检测图谱；箭头所指处分别为底物丁呋洛尔（右）及其代谢产物1’-羟基丁呋洛尔（左）的信号峰；其中横坐标表示保留时间，丁呋洛尔和1’-羟基丁呋洛尔的保留时间分别为6.9和5.1分钟，纵坐标表示信号响应值cps。
具体实施方式
通过下述具体实施方式说明本发明，但本发明内容不限于此。
如无其它说明，本发明的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的（如基因组的）或合成的。
本发明中，“突变”指在检测的基因，即CYP2D6基因中存在与野生型CYP2D6基因序列不同的核苷酸位点。“突变位点”指碱基发生突变的位置。在本发明中，所述突变位点是对应于SEQ ID NO.1所示序列的第3177位或SEQ ID NO.2所示序列中的第1006位。
国际P450等位基因命名委员会关于CYP2D6等位基因命名规则中规定：以CYP2D6基因组DNA参考序列（GenBank注册号M33388）中起始密码子ATG的第一个碱基A作为CYP2D6等位基因的第1位（起始密码子的第一个碱基A位于M33388序列的第1620位），则本发明确定的突变点位于CYP2D6 等位基因的第3177位（SEQ ID NO.1）。
本发明内容涉及CYP2D6基因的非同义突变。由于该突变位点位于基因的编码序列中，因此，本领域技术人员可知，所述突变位点既可以在基因组DNA中表现，也可以在编码序列（即CDS）中表现。本领域技术人员根据待检测样品，可以在基因组DNA或mRNA水平上对该突变位点进行检测。本申请中，SEQ ID NO.1是根据国际P450等位基因命名委员会的规定定义的本发明的CYP2D6等位基因序列，其中第3177位是本发明涉及的突变位点。SEQ ID NO.2是具有所述突变位点的CYP2D6基因的cDNA序列，其中第1006位是本发明涉及的突变位点。本领域技术人员可知，在本文中，对应于SEQ ID NO.1的第3177位位点和对应于SEQ ID NO.2的第1006位位点同义互用。
在本发明中，“等位基因特异性”指特异地与等位基因杂交，如在严谨条件下进行杂交，使得鉴定对应于SEQ ID NO.1所示序列的第3177位或SEQ ID NO.2所示序列的第1006位核苷酸为A。
本发明中，核苷酸和氨基酸的缩写采用本领域公知的缩写方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示组氨酸，I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示赖氨酸，M表示蛋氨酸，F表示苯丙氨酸，P表示脯氨酸，S表示丝氨酸，T表示苏氨酸，W表示色氨酸，Y表示酪氨酸，V表示缬氨酸。
本发明的内容是基于CYP2D6基因的新的单碱基突变位点。所述突变位点是位于CYP2D6基因的编码区内，对应于SEQ ID NO.2的第1006位，该位点由野生型的G突变为A；此外，由该突变的CYP2D6基因编码的蛋白的第336位由天冬氨酸突变为天冬酰胺（D336N）。
在第一个方面，本发明提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第3177位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第3177位的核苷酸是A；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1006位的核苷酸是A；或者为上述核酸片段的反向互补序列。
在一种实施方式中，所述核酸片段的长度可以是如10-100、101-200、201-500或501-1000个核苷酸。优选地，所述核酸片段的长度是10-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-100或101-300个核苷酸。
所述突变位点可以位于所述核酸片段的任何位置。
在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.1所示的序列。
在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.2所示的序列。
在其它实施方式中，所述核酸片段可以是SEQ ID NO.14-18所示的序列。
本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第3177位或对应于SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的突变位点的核苷酸是A；所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。
在一种实施方式中，所述的寡核苷酸用作探针。所述探针能够在严谨条件下与包含突变位点的靶序列特异性杂交。本领域技术人员已知，所述探针不需要与靶序列完全互补，只要能与靶序列特异杂交即可。在优选的实施方案中，所述杂交条件可以满足使探针仅与靶序列特异性杂交。所述探针的长度可以是5-100个核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。所述突变位点可以出现在探针的任何位置。在优选的实施方式中，所述突变位点出现在探针序列的中心或大约中心处。
在另一种实施方式中，所述寡核苷酸用作指导DNA合成的引物，如本领域公知的测序引物或合成引物等。所述引物不需要与模板完全互补，但应当与模板互补杂交以指导DNA合成。所述引物的长度可以是15-40个核苷酸长度，优选地为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。所述突变位点可以出现在所述引物的任何位置；优选地，所述突变位点出现在所述引物的3’末端。
在一些优选的实施方式中，所述寡核苷酸是如SEQ ID NO.19-23所示的序列。
基于此，本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含能够作为引物扩增所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段；所述单碱基对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位。优选地，所述试剂盒包含SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.12所示的序列片段。
本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸用于检测CYP2D6基因突变的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物；或 者本发明的核酸片段或寡核苷酸用于制备检测CYP2D6基因突变的药物的应用；或者本发明的核酸片段或寡核苷酸用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。
本发明的第五个方面是提供用药指导，包括检测待测样品中CYP2D6基因的对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的碱基。当检测到的CYP2D6基因在对应于SEQ ID NO.1的第3177位或SEQ ID NO.2的第1006位的位点为A时，相对应地调整经CYP2D6代谢的药物的给药量。在具体的实施例中，当CYP2D6基因在SEQ ID NO.2的第1006位的位点为A时，该基因编码的CYP2D6蛋白酶活性下降，故需要调整经CYP2D6代谢的药物的给药量，如下调给药量。
本发明中所述的经CYP2D6代谢的药物包括：β受体阻滞剂，普萘洛尔、美托洛尔、烯丙洛尔、丁呋洛尔、噻吗洛尔、布尼洛尔、卡维地洛、阿普洛尔、奈必洛尔；抗心律失常药，英卡胺、司巴丁、氟卡胺、普罗帕酮、阿普林定、美西律、恩卡胺、普鲁卡因胺；抗高血压药，异喹胍、吲哚拉明；抗心绞痛，哌克昔林、特罗地林；镇痛药，曲马多；抗精神药，氯丙嗪、奋乃静、氟哌啶醇、利培酮、硫利达嗪、珠氯噻醇、阿立哌唑；三环类抗抑郁药，阿米替林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、地昔帕明、去甲替林；其他抗抑郁药，氟西汀、帕罗西汀、文拉法辛、氟伏沙明、阿米夫胺、米安色林、溴法罗明、马普替林、托莫西汀、苯丙胺、西酞普兰、氟戊肟胺、米那普林、度洛西汀、吗氯贝胺；止咳平喘药，双氢可待因、乙基吗啡、可待因、右美沙芬；抗糖尿病药，苯乙双胍；其他，扑尔敏、甲氧氯普胺、阿托西汀、右旋芬氟拉明、昂丹司琼、安非他命、利多卡因、奥坦西隆、非那西丁、三苯氯胺、右芬氟拉明、异丙嗪。
本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第3177位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸。
在一种实施方式中，所述方法可以是限制性片段长度多态性分析（RFLP）。本领域技术人员可以根据本发明内容设计实验以分析SEQ ID NO.1的序列的核酸中的第3177位的核苷酸或SEQ ID NO.2的序列的核酸中的第1006位的核苷酸是否为A。
在另一种实施方式中，所述方法可以是测序法，包括分离并测定来自基因组DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第3177位的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中的对应于第1006位的核苷酸是否为A。测序法可以是本领域已知的任何可用 的测序方法。测序引物可以根据本领域技术人员的常识进行设计，如在待检测位点的上下游适当位置处设计引物，以扩展包含该待测位点的片段，从而判断该位点的核苷酸。也可以采用本发明的寡核苷酸作为引物序列。
在另一种实施方式中，所述方法是利用探针杂交的方法，特异性地鉴定检测样品中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第3177位的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸是否为A；所述方法中采用的探针是本发明的寡核苷酸。例如，从待测样品中分离出核酸，在允许探针与核酸中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下使探针与核酸接触；可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标记过的探针来实现；例如，用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。标记探针、用标记探针检测样品中是否存在靶序列的方法都是本领域技术人员所熟知的。
在一种具体的实施方式中，提供以Taqman探针SNP检测法检测对应于SEQ ID NO.1的第3177位的核苷酸的方法，包括：
1）设计引物用于特异性扩增包含对应于SEQ ID NO.1的第3177位的PCR产物，同时设计两条Taqman-MGB探针，分别针对对应于SEQ ID NO.1的第3177位的G和A等位基因。
引物设计原则为:
（1）序列选取应在基因的保守区段；
（2）避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；
（3）引物长度在18到24个核苷酸；
（4）Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
（5）引物之间的Tm值相差避免超过2℃；
（6）引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
（7）PCR扩增片段长度在50bp－150bp；
（8）引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个的G和C。
Taqman MGB探针设计原则为：
（1）探针的5’端避免出现G；
（2）Tm值应为65-67℃；
（3）尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp；
（4）尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，避免出现4个或4个以上的G重复出现；
（5）将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
荧光基团可以采用FAM、VIC等来标记两个等位基因。
2）利用上述引物和探针，对待测样本进行实时定量PCR。
PCR条件：95℃预变性10分钟后进入30个扩增循环：92℃变性12秒，60℃退火及延伸1分钟（此阶段检测荧光信号）。
3）数据分析。
分析实验结果，根据样本两种荧光的强弱判定待测样本CYP2D6基因是否存在3177G>A突变。
本发明中，所述样品可以是任何包含核酸的样品，如血液；优选所述样品来自于人。所述核酸可以是DNA或编码RNA，优选为基因组DNA。本发明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA为目标物。本领域技术人员可知，当以DNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第3177位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ ID NO.1的序列设计；当以RNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第1006位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ ID NO.2的序列设计。
本发明的第七个方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第336位的天冬酰胺，且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸，如10-20、21-50或51-100个氨基酸。
下面将通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下具体的实施例仅出于示例性的目的。
实施例1：人CYP2D6基因新的突变位点的鉴定
本实施例中，采集汉族正常健康人群血液样本，提取血液中的基因组DNA，设计测序引物对CYP2D6基因的9个外显子进行序列扩增、测序，分析其CYP2D6基因是否存在突变位点。
1）提取DNA：
从被测者采取5ml静脉EDTA抗凝血液样本；然后按照普通盐析法和/或采用专门的DNA提取试剂盒（购自美国Omega公司的DNA提取试剂盒）提取待测血样的基因组DNA。
2）PCR扩增：
设计扩增引物，对获得的基因组DNA样品中CYP2D6基因的9个外显子 序列进行扩增。所述扩增引物对序列见表1。
采用30μL PCR反应体系，包括：1×GC PCR缓冲液、1.5mM MgCl2、100ng的基因组DNA、上下游引物均为0.2μM、dNTP为0.2mM、TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1.5U。使用美国ABI公司的GeneAmp PCR System9700扩增仪扩增。PCR扩增循环参数如下：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸3分钟，35个循环后再延伸3分钟。引物序列信息见表1。
表1：扩增引物对序列信息
3）纯化扩增产物：
将获得的扩增产物按照MultiScreen HTSTM试剂盒（美国Millipore公司）的使用说明，进行目的条带的DNA回收纯化。
4）测序：
以回收后的产物为模板，使用测序引物按照BigDye Terminator v3.1测序试剂盒（美国ABI公司）使用说明进行测序PCR反应，反应结束后纯化扩增产物，使用美国ABI公司的Prism3730XL型基因测序仪进行分离以判读扩增产物的序列。测序引物序列信息见表2。
表2：测序引物序列信息表
区域 测序引物(5’-3’) 外显子1 AGGAAGCAGGGGCAAGAAC(SEQ ID NO.8) 外显子2 CGCCCTCTCTGCCCAGC(SEQ ID NO.9) 外显子3&4 TTGGAGTGGGTGGTGGA(SEQ ID NO.10) 外显子5&6 AGGARGTYAGGCTTACAGGA(SEQ ID NO.11) 外显子7 GCACAGGCTTGACCAGGAT(SEQ ID NO.12) 外显子8&9 TGTTTGGTGGCAGGGGTCC(SEQ ID NO.13)
5）数据分析：
将测得的序列与野生型CYP2D6*1序列（GenBank注册号M33388）进行比对。
通过比对分析，发现2129例受试者中有1人的CYP2D6基因组DNA序列携带一种全新的突变类型，对应的CYP2D6等位基因的第3177位的核苷酸由G变为A（如图1所示，其中R表示G和A杂合）。该突变位于CYP2D6基因的第7外显子内，突变点位于cDNA第1006位，据此推断该CYP2D6基因编码的蛋白质中，第336位氨基酸由天冬氨酸（D）突变为天冬酰胺（N）。
本实施例示例性地给出了鉴定新突变位点的方法。本领域技术人员根据上述内容可以清楚地得知特异性地检测待测样品中包含对应于SEQ ID NO.1的第3177位核苷酸的方法：分离样品中的核酸，在本实施例中对应的实验条件下进行扩增反应，引物使用引物对SEQ ID NO.6和7；用测序引物SEQ ID NO.12对扩增的产物进行测序；将测序结果与野生型结果比对，分析对应于SEQ ID NO.1的第3177位位点的核苷酸。
实施例2：体外酶代谢活性分析
根据现有的研究结果，野生型（*1型）对各种药物的代谢活性均比较高，而*2型的代谢活性比野生型的代谢活性有明显下降，*10型的代谢活性比*2型更低（参见文献6、7）。因此，在本领域中已有这样一种共识：同一个基因型所表达的酶对特异性底物的代谢活性可以代表对其它底物药的代谢活性。从而，根据某一基因型所表达的酶对特异性底物代谢活性数据可以类推该基因型所表达的酶对其它底物药的代谢活性（如，可以将该基因型所表达的酶的代谢活性与野生型所表达的酶的代谢活性进行比较）。
在本实施例中，根据上述的突变位点，以野生型CYP2D6（*1）基因为模板，定点突变了CYP2D6基因编码区的第1006位的核苷酸（由G变为A），构建表达突变型CYP2D6蛋白（命名为D336N）的表达载体，转染293FT细胞后，添加CYP2D6特异性探针底物——丁呋洛尔，经孵育后，通过分析底物和代谢产物量来检测该突变型CYP2D6蛋白的体外代谢活性，以判断与野生型CYP2D6.1相比，其酶促代谢活性是否发生改变。该实验设计类似于我们在CYP2C9新突变体体外药代活性分析时的操作步骤，其科学性已被国际药物基因组学领域最权威的杂志Pharmacogenomics J认可（见参考文献5）。
1）CYP2D6变异体的体外表达
以包含野生型CYP2D6（*1）全长cDNA的质粒载体（购买自Thermo Scientific公司）为模板，利用定点诱变技术分别获得CYP2D6*2、CYP2D6*10和本发明的D336N突变体的cDNA。定点诱变技术是本领域公知技术，本领域技术人员根据确定的模板和目标，可以毫无疑义地知道如何完成该步骤。将经检测序列正确的各目的基因及内参基因Gluc（一种分泌型荧光素酶，其翻译产物可分泌到培养基中，并通过特定试剂盒检测到荧光信号；其骨架载体是pIRES pGluc-Basic，购自NEB公司，货号N8082S）分别连接至双基因表达载体pIRES（购自Clontech公司，货号631605）的A、B多克隆位点中，使一种目的基因和内参基因位于同一CMV启动子控制下，最终获得双基因表达载体pIRES-Gluc-2D6（结构示意图谱见图2）。构建分别包括CYP2D6（*1）cDNA、CYP2D6*2cDNA、CYP2D6*10cDNA和本发明的D336N突变体的cDNA的四种CYP2D6双基因表达载体。
将5×105个293FT细胞（人肾上皮细胞来源，购自Invitrogen公司）均匀铺于6孔板；过夜培养后，利用脂质体lip2000（Invitrogen公司）转染2μg质粒载体pIRES-Gluc-2D6，以表达各种目的蛋白CYP2D6及内参蛋白Gluc。转染24h后进行western杂交检测，确定上述四种目的蛋白已正确表达。
细胞培养和脂质体转染是本领域公知技术，参照Invitrogen公司提供的说明方法便可进行。
2）活细胞体外孵育探针药物
继续培养24小时后，将6孔板内单孔细胞消化并重悬至300μl培养基中（使用EP管进行）。使用CYP2D6经典探针药丁呋洛尔（购买自加拿大Toronto Research Chemicals公司）来检测该酶的活性，该药的终浓度为10μM。在37℃下，在5%CO2培养箱中，300rpm震荡孵育3h。从CO2培养箱中取出培养物，加入20μL的0.1M NaOH并震荡涡旋1min（原因是丁呋洛尔是弱碱，溶液用NaOH碱化后将以分子形态存在，在下一步萃取过程中容易进入有机相从而被萃取出来）。加入800μL冰乙酸乙酯，震荡涡旋2min后置于-40℃冰箱30min，直至下层冰冻。取出样品，在4℃下，以12000g离心10min。将上层乙酸乙酯转移至新的EP管中，在37℃氮吹仪上将乙酸乙酯吹干。加入200μL各自初始流动相溶液复溶，震荡涡旋1min后以12000g离心5min。上清使用初始流动相溶液按1:10稀释后转移至进样瓶中。
3）LC-MS/MS检测
萃取纯化后样品在1260-6410型仪器（美国安捷伦公司）上进行LC-MS/MS 检测，HPLC采用ZORBAX SB-C18柱(150mm×4.6mm，直径5μm)。
丁呋洛尔检测条件：
色谱条件：
柱温：30℃
色谱柱：ZORBAX SB-C18(Agilent，5μm，4.6×150mm)
进样体积：1μL
流速：0.6mL/min
运行时间：10min
表3：丁呋洛尔流动相比例
时间(min) 10mM乙酸铵(%，v/v) 甲醇(%，v/v) 0.01 30 70 0.8 5 95 3 5 95 4.01 30 70 10 30 70
质谱条件：
电喷雾（ESI）离子源（正离子），多反应检测扫描（MRM）模式；
离子源的温度（TEM）：350℃；
帘气速度：11L/min；
毛细管电压：4000V；
丁呋洛尔Q1/Q3：262.2/188.1；268.2/186.1；
碰撞能=10；
母离子碎裂电压=110；
1’-羟基丁呋洛尔Q1/Q3：278.2/186.1；278.2/159.1；
碰撞能=15；
母离子碎裂电压=90。
4）LC-MS/MS检测数据分析
配制不同梯度浓度的丁呋洛尔及相应代谢产物1’-羟基丁呋洛尔(丁呋洛尔：1000、500、250、100、50、25ng/mL；1’-羟基丁呋洛尔：800、400、200、100、50、25ng/mL)，利用LC-MS检测后生成标准曲线，并用以检测各型CYP2D6蛋白对丁呋洛尔的代谢情况，然后用[产物/（产物+底物）]来表示该 探针药的代谢率，经内参Gluc数值校正后，用突变型的代谢率与野生型的代谢率的比值来表示突变型蛋白的酶活性。每种蛋白针对丁呋洛尔的体外代谢实验重复4次，取平均值后统计结果分别见表4和图3；各种蛋白对丁呋洛尔的典型质谱检测结果见图4。CYP2D6变异体的代谢能力越强，底物（丁呋洛尔）峰的峰面积就会越小，而产物（1’-羟基丁呋洛尔）峰的峰面积就会越大，从图中可以看出，新变异体D336N的代谢能力明显较野生型降低，也明显小于典型突变体CYP2D6.2，但大于典型突变体CYP2D6.10。
表4：293FT细胞孵育探针药物丁呋洛尔的酶活性结果
*指与野生型CYP2D6.1的相对值
**p值<0.05
检测结果显示，相对于野生型CYP2D6.1型，已知典型缺陷型突变体CYP2D6.2对丁呋洛尔的代谢活性下降幅度约为16%；另外一种典型缺陷型突变体CYP2D6.10针对探针药物的代谢活性明显下降，下降幅度约为90%，这一结果与已有文献基本一致，表明我们的体外检测体系获得的数据具有非常高的可信度（参见参考文献6、7）。
利用该体外检测体系可以看出：D336N突变体对探针药物丁呋洛尔的代谢活性分别为野生型的54.48%。统计学分析表明，与野生型相比，D336N突变体的代谢活性下降，具有显著性差异，提示该突变可引起所表达的酶的代谢活性明显降低。因此，在实践中，需要考虑对携带该基因型的个体在用药剂量上进行适当调节，如减少药物的使用量和避免药物不良反应的发生。这种通过基因导向的药物调整对于个体差异较大的药物（如丙咪嗪、阿米替林等）更为重要。
参考文献
1.Zhou SF.Polymorphism of Human Cytochrome P4502D6and Its Clinical Significance:Part I.Clinical Pharmacokinetics.2009,48(11):689-723.
2.Qin S,Shen L,Zhang A,et al.Systematic polymorphism analysis of the CYP2D6gene in four different geographical Han populations in mainland China.Genomics.2008,92(3):152-158.
3.ZHOU SF.Polymorphism of Human Cytochrome P4502D6and Its Clinical Significance Part II.Clinical pharmacokinetics.2009,48(12):761-804.
4.徐艳娇,龚森,纪洪艳,等.CYP2D6基因多态性及其临床意义.医药导报.2012,31(10):1337-1340.
5.Dai DP,Xu RA,Hu LM,Wang SH,Geng PW,Yang JF,et al.CYP2C9polymorphism analysis in Han Chinese populations:building the largest allele frequency database.Pharmacogenomics J.2013,DOI:10.1038/tpj.2013.2.
6.Wennerholm A,Johansson I,Hidestrand M,Bertilsson L,Gustafsson LL,Ingelman-Sundberg M.Characterization of the CYP2D6*29allele commonly present in a black Tanzanian population causing reduced catalytic activity.Pharmacogenetics2001,11:417-427.
7.Sakuyama K,Sasaki T,Ujiie S,Obata K,Mizugaki M,Ishikawa M et al.Functional characterization of17CYP2D6allelic variants(CYP2D6.2,10,14A-B,18,27,36,39,47-51,53-55,and57).Drug Metab Dispos.2008,36:2460-2467。
序列：
SEQ ID NO.1：等位基因序列
ATGGGGCTAGAAGCACTGGTGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTGCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAACATGGATGGTGGGTGAAACCACAGGCTGGACCAGAAGCCAGGCTGAGAAGGGGAAGCAGGTTTGGGGGACGTCCTGGAGAAGGGCATTTATACATGGCATGAAGGACTGGATTTTCCAAAGGCCAAGGAAGAGTAGGGCAAGGGCCTGGAGGTGGAGCTGGACTTGGCAGTGGGCATGCAAGCCCATTGGGCAACATATGTTATGGAGTACAAAGTCCCTTCTGCTGACACCAGAAGGAAAGGCCTTGGGAATGGAAGATGAGTTAGTCCTGAGTGCCGTTTAAATCACGAAATCGAGGATGAAGGGGGTGCAGTGACCCGGTTCAAACCTTTTGCACTGTGGGTCCTCGGGCCTCACTGCCTCACCGGCATGGACCATCATCTGGGAATGGGATGCTAACTGGGGCCTCTCGGCAATTTTGGTGACTCTTGCAAGGTCATACCTGGGTGACGCATCCAAACTGAGTTCCTCCATCACAGAAGGTGTGACCCCCACCCCCGCCCCACGATCAGGAGGCTGGGTCTCCTCCTTCCACCTGCTCACTCCTGGTAGCCCCG GGGGTCGTCCAAGGTTCAAATAGGACTAGGACCTGTAGTCTGGGGTGATCCTGGCTTGACAAGAGGCCCTGACCCTCCCTCTGCAGTTGCGGCGCCGCTTCGGGGACGTGTTCAGCCTGCAGCTGGCCTGGACGCCGGTGGTCGTGCTCAATGGGCTGGCGGCCGTGCGCGAGGCGCTGGTGACCCACGGCGAGGACACCGCCGACCGCCCGCCTGTGCCCATCACCCAGATCCTGGGTTTCGGGCCGCGTTCCCAAGGCAAGCAGCGGTGGGGACAGAGACAGATTTCCGTGGGACCCGGGTGGGTGATGACCGTAGTCCGAGCTGGGCAGAGAGGGCGCGGGGTCGTGGACATGAAACAGGCCAGCGAGTGGGGACAGCGGGCCAAGAAACCACCTGCACTAGGGAGGTGTGAGCATGGGGACGAGGGCGGGGCTTGTGACGAGTGGGCGGGGCCACTGCCGAGACCTGGCAGGAGCCCAATGGGTGAGCGTGGCGCATTTCCCAGCTGGAATCCGGTGTCGAAGTGGGGGCGGGGACCGCACCTGTGCTGTAAGCTCAGTGTGGGTGGCGCGGGGCCCGCGGGGTCTTCCCTGAGTGCAAAGGCGGTCAGGGTGGGCAGAGACGAGGTGGGGCAAAGCCTGCCCCAGCCAAGGGAGCAAGGTGGATGCACAAAGAGTGGGCCCTGTGACCAGCTGGACAGAGCCAGGGACTGCGGGAGACCAGGGGGAGCATAGGGTTGGAGTGGGTGGTGGATGGTGGGGCTAATGCCTTCATGGCCACGCGCACGTGCCCGTCCCACCCCCAGGGGTGTTCCTGGCGCGCTATGGGCCCGCGTGGCGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGTGTCCACCTTGCGCAACTTGGGCCTGGGCAAGAAGTCGCTGGAGCAGTGGGTGACCGAGGAGGCCGCCTGCCTTTGTGCCGCCTTCGCCAACCACTCCGGTGGGTGATGGGCAGAAGGGCACAAAGCGGGAACTGGGAAGGCGGGGGACGGGGAAGGCGACCCCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAGGACGCCCCTTTCGCCCCAACGGTCTCTTGGACAAAGCCGTGAGCAACGTGATCGCCTCCCTCACCTGCGGGCGCCGCTTCGAGTACGACGACCCTCGCTTCCTCAGGCTGCTGGACCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCGGGCTTTCTGCGCGAGGTGCGGAGCGAGAGACCGAGGAGTCTCTGCAGGGCGAGCTCCCGAGAGGTGCCGGGGCTGGACTGGGGCCTCGGAAGAGCAGGATTTGCATAGATGGGTTTGGGAAAGGACATTCCAGGAGACCCCACTGTAAGAAGGGCCTGGAGGAGGAGGGGACATCTCAGACATGGTCGTGGGAGAGGTGTGCCCGGGTCAGGGGGCACCAGGAGAGGCCAAGGACTCTGTACCTCCTATCCACGTCAGAGATTTCGATTTTAGGTTTCTCCTCTGGGCAAGGAGAGAGGGTGGAGGCTGGCACTTGGGGAGGGACTTGGTGAGGTCAGTGGTAAGGACAGGCAGGCCCTGGGTCTACCTGGAGATGGCTGGGGCCTGAGACTTGTCCAGGTGAACGCAGAGCACAGGAGGGATTGAGACCCCGTTCTGTCTGGTGTAGGTGCTGAATGCTGTCCCCGTCCTCCTGCATATCCCAGCGCTGGCTGGCAAGGTCCTACGCTTCCAAAAGGCTTTCCTGACCCAGCTGGATGAGCTGCTAACTGAGCACAGGATGACCTGGGACCCAGCCCAGCCCCCCCGAGACCTGACTGAGGCCTTCCTGGCAGAGATGGAGAAGGTGAGAGTGGCTGCCACGGTGGGGGGCAAGGGTGGTGGGTTGAGCGTCCCAGGAGGAATGAGGGGAGGCTGGGCAAAAGGTTGGACCAGTGCATCACCCGGCGAGCCGCATCTGGGCTGACAGGTGCAGAATTGGAGGTCATTTGGGGGCTACCCCGTTCTGTCCCGAGTATGCTCTCGGCCCTGCTCAGGCCAAGGGGAACCCTGAGAGCAGCTTCAATGATG AGAACCTGCGCATAGTGGTGGCTGACCTGTTCTCTGCCGGGATGGTGACCACCTCGACCACGCTGGCCTGGGGCCTCCTGCTCATGATCCTACATCCGGATGTGCAGCGTGAGCCCATCTGGGAAACAGTGCAGGGGCCGAGGGAGGAAGGGTACAGGCGGGGGCCCATGAACTTTGCTGGGACACCCGGGGCTCCAAGCACAGGCTTGACCAGGATCCTGTAAGCCTGACCTCCTCCAACATAGGAGGCAAGAAGGAGTGTCAGGGCCGGACCCCCTGGGTGCTGACCCATTGTGGGGACGCATGTCTGTCCAGGCCGTGTCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGCAGGTGCGGCGACCAGAGATGGGTGACCAGGCTCACATGCCCTACACCACTGCCGTGATTCATGAGGTGCAGCGCTTTGGGGACATCGTCCCCCTGGGTGTGACCCATATGACATCCCGTGACATCGAAGTACAGGGCTTCCGCATCCCTAAGGTAGGCCTGGCGCCCTCCTCACCCCAGCTCAGCACCAGCACCTGGTGATAGCCCCAGCATGGCTACTGCCAGGTGGGCCCACTCTAGGAACCCTGGCCACCTAGTCCTCAATGCCACCACACTGACTGTCCCCACTTGGGTGGGGGGTCCAGAGTATAGGCAGGGCTGGCCTGTCCATCCAGAGCCCCCGTCTAGTGGGGAGACAAACCAGGACCTGCCAGAATGTTGGAGGACCCAACGCCTGCAGGGAGAGGGGGCAGTGTGGGTGCCTCTGAGAGGTGTGACTGCGCCCTGCTGTGGGGTCGGAGAGGGTACTGTGGAGCTTCTCGGGCGCAGGACTAGTTGACAGAGTCCAGCTGTGTGCCAGGCAGTGTGTGTCCCCCGTGTGTTTGGTGGCAGGGGTCCCAGCATCCTAGAGTCCAGTCCCCACTCTCACCCTGCATCTCCTGCCCAGGGAACGACACTCATCACCAACCTGTCATCGGTGCTGAAGGATGAGGCCGTCTGGGAGAAGCCCTTCCGCTTCCACCCCGAACACTTCCTGGATGCCCAGGGCCACTTTGTGAAGCCGGAGGCCTTCCTGCCTTTCTCAGCAGGTGCCTGTGGGGAGCCCGGCTCCCTGTCCCCTTCCGTGGAGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAG
SEQ ID NO.2：编码序列
ATGGGGCTAGAAGCACTGGTGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGTTGCGGCGCCGCTTCGGGGACGTGTTCAGCCTGCAGCTGGCCTGGACGCCGGTGGTCGTGCTCAATGGGCTGGCGGCCGTGCGCGAGGCGCTGGTGACCCACGGCGAGGACACCGCCGACCGCCCGCCTGTGCCCATCACCCAGATCCTGGGTTTCGGGCCGCGTTCCCAAGGGGTGTTCCTGGCGCGCTATGGGCCCGCGTGGCGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGTGTCCACCTTGCGCAACTTGGGCCTGGGCAAGAAGTCGCTGGAGCAGTGGGTGACCGAGGAGGCCGCCTGCCTTTGTGCCGCCTTCGCCAACCACTCCGGACGCCCCTTTCGCCCCAACGGTCTCTTGGACAAAGCCGTGAGCAACGTGATCGCCTCCCTCACCTGCGGGCGCCGCTTCGAGTACGACGACCCTCGCTTCCTCAGGCTGCTGGACCTAGCT CAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCGGGCTTTCTGCGCGAGGTGCTGAATGCTGTCCCCGTCCTCCTGCATATCCCAGCGCTGGCTGGCAAGGTCCTACGCTTCCAAAAGGCTTTCCTGACCCAGCTGGATGAGCTGCTAACTGAGCACAGGATGACCTGGGACCCAGCCCAGCCCCCCCGAGACCTGACTGAGGCCTTCCTGGCAGAGATGGAGAAGGCCAAGGGGAACCCTGAGAGCAGCTTCAATGATGAGAACCTGCGCATAGTGGTGGCTGACCTGTTCTCTGCCGGGATGGTGACCACCTCGACCACGCTGGCCTGGGGCCTCCTGCTCATGATCCTACATCCGGATGTGCAGCGCCGTGTCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGCAGGTGCGGCGACCAGAGATGGGTGACCAGGCTCACATGCCCTACACCACTGCCGTGATTCATGAGGTGCAGCGCTTTGGGGACATCGTCCCCCTGGGTGTGACCCATATGACATCCCGTGACATCGAAGTACAGGGCTTCCGCATCCCTAAGGGAACGACACTCATCACCAACCTGTCATCGGTGCTGAAGGATGAGGCCGTCTGGGAGAAGCCCTTCCGCTTCCACCCCGAACACTTCCTGGATGCCCAGGGCCACTTTGTGAAGCCGGAGGCCTTCCTGCCTTTCTCAGCAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAG
SEQ ID NO.3：蛋白质序列
MGLEALVPLAVIVAIFLLLVDLMHRRQRWAARYPPGPLPLPGLGNLLHVDFQNTPYCFDQLRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAAVREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGVFLARYGPAWREQRRFSVSTLRNLGLGKKSLEQWVTEEAACLCAAFANHSGRPFRPNGLLDKAVSNVIASLTCGRRFEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKVLRFQKAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLRIVVADLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPDVQRRVQQEINDVIGQVRRPEMGDQAHMPYTTAVIHEVQRFGDIVPLGVTHMTSRDIEVQGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHFLDAQGHFVKPEAFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGVFAFLVSPSPYELCAVPR
SEQ ID NO.14：核酸片段
CAGGAGATCAACGACGTGAT
SEQ ID NO.15：核酸片段
TCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGC
SEQ ID NO.16：核酸片段
CCGTGTCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGCAGGTG
SEQ ID NO.17：核酸片段
CCAGGCCGTGTCCAACAGGAGATCAACGACGTGATAGGGCAGGTGCGGCG
SEQ ID NO.18：核酸片段
CGTGTCCAACAGGAGATCAACGAC
SEQ ID NO.19：寡核苷酸片段
CCTATCACGTCGTTG
SEQ ID NO.20：寡核苷酸片段
CCTGCCCTATCACGTCGTTG
SEQ ID NO.21：寡核苷酸片段
CACCTGCCCTATCACGTCGTTGA
SEQ ID NO.22：寡核苷酸片段
TCACGTCGTTGATCTCCTGT
SEQ ID NO.23：寡核苷酸片段
CCCTATCACGTCGTTGATCTCCTGTTGGAC。