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1、(10)授权公告号 CN 101575595 B (45)授权公告日 2011.06.22 CN 101575595 B *CN101575595B* (21)申请号 200910087365.1 (22)申请日 2009.06.19 C12N 11/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) (73)专利权人 中国水产科学研究院黄海水产研 究所 地址 266071 山东省青岛市南京路 106 号 (72)发明人 孙谧 刘均忠 王海英 郑媛 平芮巾 郝建华 王跃军 (74)专利代理机构 北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318 代理人 史和初 CN 101225369 。
2、A,2008.07.23, 全文 . 平芮巾等.产海洋细菌MP-2酯酶菌株的鉴定 及酯酶理化性质的研究 .渔业科学进展 .2009, 第 30 卷 ( 第 2 期 ), 全文 . (54) 发明名称 海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备 方法 (57) 摘要 本发明涉及海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法， 包括将海藻酸钠与海洋细菌 MP-2酯酶溶于甘氨酸(NaOH)的缓冲液中， 混合均 匀后， 滴入 CaCl2溶液中成球、 静置、 固定化、 再洗 涤干燥得颗粒状固定化海洋细菌MP-2酯酶。 该方 法体系稳定， 相容性好， 反应温和， 活力高， 作为己 酸乙酯催化剂， 合成。
3、转化率高， 并可重复使用， 应 用前景广阔。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黎舒婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 CN 101575595 B1/1 页 2 1. 海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法， 其特征在于包括下列步骤 ： 海藻酸钠与海洋细菌MP-2酯酶分别溶于0.1mol/L pH10的甘氨酸NaOH的缓冲液中， 溶解成溶液后， 两溶液在搅拌下充分混合均匀， 其中海藻酸钠与海洋细菌 MP-2 酯酶在混合 溶液中质量比为 1 6 至 1 10， 海藻酸纳浓度为 2-4 质量 ； 。
4、在固定化反应器中， 将步骤的混合溶液在搅拌下逐滴注入 CaCl2溶液中成球， CaCl2溶液的浓度为 1-3 质量， 成球后在室温下静置进行固定化， 固定化时间为 30-80 分 钟， 然后用蒸馏水洗涤数次以除去多余离子， 冷风吹干后， 得粒子直径为 0.5-1.5mm 的颗粒 状固定化海洋细菌 MP-2 酯酶。 2.根据权利要求1的海藻酸钙固定化海洋细菌MP-2酯酶的制备方法， 其特征在于所述 海藻酸钠溶液浓度为 3.0 质量 ； 所述海藻酸钠与海洋细菌 MP-2 酯酶的质量比为 1 8 ； 所述 CaCl2溶液浓度为 2.0 质量 ； 固定化时间为 60 分钟。 权 利 要 求 书 CN 。
5、101575595 B1/5 页 3 海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及海洋微生物酯酶领域， 特别是涉及海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯 酶的制备方法。 背景技术 0002 微生物酯酶 (Esterase， EC3.1.1.1) 属于水解酶类 (Hydrolases)， 来源于微生物 体内， 指能够催化水解羧酸酯的所有酶的总称。作为生物催化剂， 具有很高的催化功能、 底 物特异性和反应特异性， 利用其水解反应、 酯转换及酯合成反应广泛应用于医药、 化工、 食 品、 能源及环保等领域。 尤其是近年来随着非水相酶学研究的不断深入， 酯酶在酯类化合物。
6、 的合成和手性药物的拆分方面已成为国内外的关注热点， 显示出潜在的应用前景。而且海 洋微生物为适应海洋低温高盐高压这一生命极限环境， 海洋微生物酶表现了比陆源性微生 物酶更为独特的酶学性质与生理功能。 然而， 由于游离酯酶的成本、 高效性与稳定性等问题 的存在， 其应用仍然面临诸多困难。 因此对于现代工业来说， 游离酯酶不是一种理想的催化 剂。为了克服其缺点， 采用固定化海洋微生物酯酶技术， 不仅能保持原酶的特性， 而且将会 大大提高酶的稳定性， 可以连续长期使用而不易失活， 也易与产物的分离， 利于酶的重复多 次使用及产品的纯化， 从而显著降低酶的使用成本， 因此具有更为广阔的应用前景。 0。
7、003 近年来， 国内外对固定化酶进行了研究报道认为海藻酸钠是糖醛酸的钠盐聚合 物， 对生物的毒性较小且不易被降解， 用它与钙盐形成的凝胶来包埋酶， 凝胶机械强度较 好， 内部成多孔结构， 反应条件温和， 操作简单， 酶活力的损失小。催化学报， 2005， 26(11)， P877-981 报道以海藻酸钠固定化根霉脂肪酯的制备报道， 食品工业科技 2006， 27(9)， 69-71 报道海藻酸钠固定化谷氨酰胺转氨酶稳定性的研究。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服上述现有技术存在诸多缺点， 经发明人长期开发研究海洋 微生物及其分泌产物和生产实践可以提供一种体系稳定， 相容性好， 反应温。
8、和， 酶活率保留 高的海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法。 0005 本发明提供的海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法包括下列步骤 ： 0006 海藻酸钠与海洋细菌 MP-2 酯酶分别溶于 0.1mol/L pH10 的甘氨酸 NaOH 的缓 冲液中， 溶解成溶液后， 两溶液在搅拌下充分混合均匀， 其中海藻酸纳浓度为 2-4 质量， 优选为 3 质量， 海藻酸钠与海洋细菌 MP-2 酯酶在混合溶液中 1 6 至 1 10， 优选为 1 8 ； 0007 在固定化反应器中， 将步骤的混合溶液在搅拌下逐滴注入 CaCl2溶液中成球， CaCl2溶液的浓度为 1-3 质量，。
9、 优选为 2 质量 ； 成球后在室温下例如 25下静置进行 固定化， 固定化时间为 30-80 分钟， 优选为 60 分钟， 然后用蒸馏水洗涤数次， 以除去多余离 子， 冷风吹干后， 得颗粒状固定化海洋细菌 MP-2 酯酶 ( 简称固定化酯酶 )， 其颗粒大小约为 0.5-1.5mm， 4保存。 说 明 书 CN 101575595 B2/5 页 4 0008 本发明提供的海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法中， 所述海洋细菌 MP-2 酯酶是由中国水产科学研究院黄海水产研究所从海洋底泥培养分离得到高产酯酶菌 株 MP-2， 称高产酯酶为海洋细菌 MP-2 酯酶 ； 由黄海水产研究。
10、所提供， 即商品市售。 0009 酯酶在固定化过程中， 随着酯酶量的增加， 固定化酯酶的活力呈先升后降的趋势 而活力回收率逐渐下降。酯酶与海藻酸钠载体的比例为 6 1 至 10 1 为 8 1( 质量 比 ) 时， 此时相对酶活力最高。这也许由于随着酯酶量递增， 载体上吸附的酯酶增加， 使固 定化酯酶活力逐渐升高， 但是由于载体只能吸附有限的酯酶量， 当载体量相对减少时， 单位 数量的载体所包埋的酯酶量相对较多， 造成酯酶分子相互聚集成团， 酶分子的活性中心有 可能被遮盖， 催化活力仍然会下降。因此， 只有酯酶与载体适当配比时， 才能使固定化酯酶 表现出较高的活性。 0010 所述海藻酸钠在酯。
11、酶固定化过程中作为载体而存在， 海藻酸钠浓度不仅影响凝胶 的机械强度， 质量传递， 进而会影响到固定化酯酶的活力。当海藻酸钠浓度较低时， 凝胶孔 径较大， 凝胶内的酯酶分子容易流失， 故酶活力较低 ； 当海藻酸钠浓度过高时， 凝胶孔径太 小， 此时限制了底物及产物的扩散， 同样导致酶活力下降。同时浓度过高， 虽然凝胶的强度 增大， 但包埋剂粘性也增加， 不便于固定化的操作。 因此， 载体浓度应控制在适当的范围内， 如当海藻酸钠浓度为 2-4 质量， 优选 3.0时， 相对酶活力最高。 0011 所述固定剂中 CaCl2的 Ca2+在固定化过程中， 与海藻酸根离子形成不溶于水的海 藻酸钙凝胶， 。
12、从而将酯酶包埋固定。作为固定剂的 CaCl2对形成凝胶的机械强度也有重要 影响。因此， CaCl2浓度应控制在适当的范围内。随着 CaCl2浓度的增加， 固定化酯酶活力 呈先升后降的趋势， 当 CaCl2浓度为 2-4 质量， 为优选 2时， 固定化酯酶相对活力最高。 0012 所述固定化时间是指新制备的固定化酯酶凝胶颗粒在 CaCl2溶液中静置的时间。 固化定时间过长或过短均使固定化酯酶活力下降， 例如 30-80 分钟， 优选为 60 分钟固定化 酯酶的相对酶活力最高。这是因为随着固定化时间延长， 凝胶强度提高， 高分子链结较致 密， 不利于基质传递， 底物扩散阻力增加， 由此导致固定化酯。
13、酶活力降低。 0013 本发明提供的固定化海洋细菌 MP-2 酯酶在上述最适条件下， 固定化海洋细菌 MP-2 酯酶 ( 简称固定化酯酶 ) 的活力达到 616.2U/g， 此时酶活力回收率为 52.8。 0014 与未固定化海洋细菌 MP-2 酯酶 ( 或称游离酯酶 ) 的酶学性质比较 ： 0015 酯酶的活性测定 0016 A ： 游离酯酶活力的测定 ： 采用 p-NPP 法， 将 20l 酶液加到 2ml 含 4mmol/LMg2+， 17mmol/L 底物 p-NPP 的 0.1mol/L 的甘氨酸 -NaOH(pH10.0) 缓冲体系中， 以 60、 pH10.0 条件下作用10mi。
14、n后， 加入2mol/L NaOH溶液终止酶反应， 另以沸水水浴中失活的酶液代替 原酶液为空白， 在 405nm 处测定反应产物对硝基苯酚的吸光值， 每次测两个平行样， 重复三 次。以每 min 分解对硝基苯棕榈酸酯 (p-Nitrophenyl palmitate) 释放出 1mol 对硝基 苯酚 (p-Nitrophenol) 所需的酶量定义为 1 个酶活力单位， 以 U 表示。 0017 B ： 固定化酯酶活力的测定 ： 以 0.1g 固定化酶取代游离酶， 在 60振荡水浴中保 温， 按游离酶方法测定酶活力 (U/g)。 0018 固定化酯酶与游离酯酶最适作用温度比较 0019 在 4 。
15、100温度范围内进行酯酶水解活性的测定。 0020 由图 1 可知， 固定化酯酶的最适温度为 80， 比游离酯酶的提高了 20， 在 50 说 明 书 CN 101575595 B3/5 页 5 80范围内它仍保持较高活性， 说明酯酶被固定化后其耐热性增加， 这可能是由于固定化 后酶分子与载体多点连接， 可防止酶分子伸展变形， 从而稳定了酶分子的构象， 进而使酶的 临界变性温度提高。 0021 固定化酯酶与游离酯酶热稳定性的比较 0022 将固定化酯酶与游离酯酶分别溶于pH10的0.1mol/L NaOH-甘氨酸的缓冲液中， 置于不同温度 (60 80 ) 下， 恒温水浴处理 2h， 每隔 2。
16、0min 取样， 迅速冷却， 测定其残余 酶活， 以不经处理的酶活力为 100， 其余折合成剩余酶活力的百分数。 0023 由图2可知， 70时游离酯酶保温1h酶活力仅存10， 而固定化酯酶保温2h酶活 力仍保持 80， 80时游离酯酶保温 45min 酶活力则完全丧失， 而固定化酯酶保温 2h 酶活 力仍保持70。 可见， 固定化酯酶的热稳定性远高于游离酯酶， 这是由于游离酯酶经固定化 后， 蛋白质分子被固定在凝胶之中， 分子整体运动受限， 抑制了酶的自身降解， 活性中心的 稳定性也随之增加。 0024 固定化酯酶与游离酯酶最适作用 pH 的比较 0025 取一定量的固定化酯酶与游离酯酶分别。
17、加入到不同 pH 的缓冲液中， 再加入底物 测其活性。 0026 由图3可知， 固定化酯酶的最适作用pH提高到11。 这可能是由于海藻酸钠是带负 电荷的载体会吸引溶液中的阳离子， 包括 H+， 使其附着在载体表面， 结果使固定化酯酶扩散 层 H+浓度比周围的外部溶液高， 这样周围环境中的 pH 必须向碱性偏移， 才能抵消微环境作 用， 使酯酶表现最大活力。 0027 固定化酯酶与游离酯酶 pH 稳定性比较 0028 将一定量的固定化酯酶与游离酯酶分别溶于不同 pH(2 12) 的缓冲液中， 置 于 4下， 保温 48h 后， 再将酶溶液调回至最适 pH10， 以最适条件下保温所得的酶活力为 1。
18、00， 其余折合成剩余酶活力的百分数。 0029 由图 4 可知， 固定化酯酶在 pH9 11 范围内均保持较高的酶活力， 与之相比游离 酯酶在这个范围内除了 pH10 外， 其酶活力均较低。这说明酯酶被固定化后其耐酸碱性明显 增强。这可能是由于酶固定化后所处的微环境与活性中心受到载体的影响， 活性基团的解 离性发生变化。 0030 金属离子对固定化酯酶与游离酯酶活性的影响 0031 将一定量的固定化酯酶与游离酯酶分别加入各种金属离子， 并保持测活反应体系 中金属离子浓度为 0.01mol/L， 以缓冲液作对照测活。 0032 由图 5 可知， Co2+， Li+对固定化酯酶与游离酯酶均有激活。
19、作用并且对固定化酯酶 的激活作用更为显著 ； Ca2+对游离酯酶没有显著影响， Cu2+、 Pb2+、 Ag+、 Mn2+、 Zn2+、 Fe3+、 Ba2+、 Mg2+对游离酯酶活性有抑制作用， 而 Ca2+、 Cu2+、 Mn2+对固定酶的影响不显著， 同时 Pb2+、 Zn2+、 Fe3+、 Ba2+、 Mg2+对固定化酯酶的抑制作用具有忍耐性 ； Ag+几乎完全抑制了游离酯酶的活性 而对固定化酯酶的活性仍能保持34.2。 由此说明固定化酯酶比游离酯酶对金属离子的稳 定性好， 这是因为酶固定化后， 其空间结构相对稳定。 0033 固定化酯酶与游离酯酶的米氏常数 Km 0034 取不同浓度。
20、的底物 p-NPP， 分别加入固定化酯酶和游离酯酶， 测定两种酶水解底物 的反应初速率， 借助 Curve Expert 软件回归拟合做米氏方程曲线 ( 图 6， 7) 求得 Km( 固 ) 说 明 书 CN 101575595 B4/5 页 6 2.08mmol/L， Km( 游 ) 3.34mmol/L， 这说明该酯酶经固定化后米氏常数 Km 减小， 这可 能由于酶的高级结构发生变化及载体的影响引起酶与底物的亲和力增加， 从而使 Km 减小。 0035 固定化酯酶与游离酯酶的贮存稳定性 0036 将固定化酯酶与游离酯酶置于 4下贮存， 每隔 10d 取样测定酶活， 固定化酯酶与 游离酯酶的。
21、活性都随着时间的延长而降低， 由图 8 可知， 游离酯酶放置 60d 后只能维持在 25.8， 而固定化酯酶的活力仍能保持在 45以上， 也许这因为经过固定化后结构更加稳 定， 抑制了自身降解， 提高了稳定性。 0037 固定化酯酶的贮存半衰期 0038 半衰期按此式计算 ： t1/2 0.693t/2.303lg(E0/E) 0039 其中 ： t1/2固定化酯酶半衰期 ； t 为工作时间 ； E0/E 是工作时间 t 后酶活力残留分 数固定化酯酶在 4贮存 15d 后酶活保留 82.9， 而游离酯酶保留 64.8 ； 固定化酯酶的 贮存半衰期是 55d。由此可见， 海洋微生物酯酶经固定化后。
22、稳定性明显增强。 0040 本发明提供的海藻酸钙固定化海洋细菌 MP-2 酯酶的制备方法， 特点为 ： 0041 以成本低廉且无毒无副作用的海藻酸钙凝胶为载体， 采用包埋法成功地固定化 了海洋细菌 MP-2 酯酶。海藻酸钠与 Ca2+形成亲水的多孔性海藻酸钙凝胶， 其体系稳定， 相 容性好、 反应温和。在最佳固定化的条件下， 固定化酯酶的活力达到 616.2U/g， 此时酶活 力回收率为52.8。 海洋细菌MP-2酯酶经过固定化后， 最适温度有所升高， 最适pH值发 生了偏移且其热稳定性、 pH 稳定性、 操作稳定性、 贮存稳定性与对金属离子的稳定性均比游 离酯酶有所增强， 米氏常数 Km 减。
23、小， 亦表明该固定化酯酶与底物的亲和力有所增加。导致 酶与底物之间存在海藻酸钙凝胶， 底物通过吸附与扩散过程才能结合发生酶促反应， 在同 样条件下由于该作用的存在， 减缓了表观反应速率， 从而使最适酶促反应温度升高， 最适 pH 范围变宽， 稳定性得到提高。 以固定化酯酶为催化剂， 在以正己烷非水溶剂中合成己酸乙 酯， 合成的转化率达 65.8。重复使用 6 次后， 固定化酯酶仍保持 85的酶活力， 说明该固 定化酯酶的稳定性良好。 海洋微生物酯酶的固定化使其具有良好的产业化与更广泛的应用 前景， 从而进一步开拓了海洋微生物酶资源的开发与利用。 附图说明 0042 图 1 为温度对固定化酯酶与。
24、游离酯酶活力的影响 0043 图 2 为固定化酯酶与游离酯酶的热稳定性 0044 图 3 为 pH 对固定化酯酶与游离酯酶活力的影响 0045 图 4 为固定化酯酶与游离酯酶 pH 稳定性 0046 图 5 为金属离子对固定化酯酶与游离酯酶活力的影响 0047 图 6 为固定化酯酶米氏方程曲线 0048 图 7 为游离酯酶米氏方程曲线 0049 图 8 固定化酯酶与游离酯酶贮存稳定性 具体实施方式 0050 本发明用下列实施例来进一步说明本发明， 但本发明的保护范围并不限于下列实 施例。 说 明 书 CN 101575595 B5/5 页 7 0051 实施例 1 0052 取 1.125 克。
25、海藻酸钠与 9 克海洋细菌 MP-2 酯酶分别溶于 0.1mol/L pH10 的甘氨 酸NaOH的缓冲液， 溶解后在搅拌下充分混合均匀， 其中海藻酸纳浓度为3质量， 海藻酸钠 与海洋细菌 MP-2 酯酶在混合溶液中 1 8.。在固定化反应器中 ( 市售 ) 将上述混合溶液 在搅拌下逐滴注入浓度为 2 质量的 CaCl2溶液中， 成球后在室温下静置 60 分钟进行固定 化， 然后用蒸馏水洗涤直至除去多余离子， 然后冷风吹干后， 得粒子直径约为 1mm 的颗粒状 固定化海洋细菌 MP-2 酯酶。 0053 实施例 2 0054 本实施例步骤相同于实施例 1， 不同是海藻酸钠为 2 克， 浓度为 。
26、2 质量 ； 海洋细 菌 MP-2 酯酶 2 克， CaCl2浓度为 1.8 质量 ； 固定化时间为 70 分。 0055 固定化酯酶的应用 0056 以固定化酯酶为催化剂， 以正己烷为溶剂， 配制 1己酸的 20 ( 体积分数 ) 乙醇 溶液， 准确吸取 1mL 己酸于 100mL 容量瓶中， 用 20乙醇稀释至刻度。取 20ml 己酸乙醇溶 液于蒸馏烧瓶中， 加入1g固定化酯酶， 在50保温酯化2h。 用气相色谱分析己酸乙酯含量， 并计算酯合成转化率， 结果表明， 该固定化酶催化己酸乙酯合成的转化率达 65.8。且经 6 次重复使用后其催化活性未见明显减弱。由酯合成转化率折算成酶活力， 相当于经 6 次重 复使用后， 该固定化酶仍保持 85以上的催化活性。这进一步说明了该固定化酯酶具有良 好的操作稳定性。 说 明 书 CN 101575595 B1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101575595 B2/4 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101575595 B3/4 页 10 图 5 图 6图 7 说 明 书 附 图 CN 101575595 B4/4 页 11 图 8 说 明 书 附 图 。