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1、10申请公布号CN104311629A43申请公布日20150128CN104311629A21申请号201410496100822申请日20140924C07K7/06200601C12P21/02200601A21D13/08200601A23L1/305200601A23K1/16200601A61K8/64200601A61Q19/08200601A23L2/0220060171申请人四川大学地址610065四川省成都市武侯区一环路南一段24号72发明人冯红董阁杨斌清74专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司11246代理人裴娜54发明名称一种抗氧化肽及其制备方法和应用57摘要本。
2、发明涉及一种来源于羽毛角蛋白的抗氧化肽，含有八个氨基酸，其序列为SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY。本发明的抗氧化肽可以通过羽毛角蛋白的微生物水解及其后续的分离纯化等过程来制备，或者通过化学合成制备。该肽具有抗氧化、清除自由基和鳌合金属离子等活性功能，可以作为功能活性组分或抗氧化剂，用于保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品、日化用品等领域。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表1页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表1页附图4页10申请公布号CN104311629ACN104311629A1/1页21一种抗氧化肽，其特。
3、征在于其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2根据权利要求1所述的抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽来源于羽毛角蛋白。3根据权利要求1所述的抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽通过将羽毛或羽毛角蛋白经微生物水解、分离纯化而制得。4根据权利要求3所述的抗氧化肽，其特征在于，所述微生物为细菌枯草芽孢杆菌S14菌株。5根据权利要求1所述的抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽通过化学合成制备。6一种制备权利要求14任一项所述的抗氧化肽的方法，其特征在于所述的抗氧化肽是通过如下方法水解得到的步骤1利用羽毛或者羽毛角蛋白作为原料，加入培养液，灭菌，接种细菌枯草芽孢杆菌S14菌株，在3037震荡培养发酵4872H。
4、；步骤2离心收集上清液，加入盐酸调PH至20，再离心获得沉淀，冷冻干燥；步骤3用二甲基亚砜溶解沉淀，并将获得的溶液通过阳离子交换层析，收集合并具有抗氧化活性的组分，冷冻干燥；步骤4再用二甲基亚砜溶解步骤3中的冻干产物，用反向层析分离，合并抗氧化组分，冷冻干燥后，再次用反向层析分离，保留具有抗氧化性的组分，冷冻干燥。7根据权利要求6所述的制备抗氧化肽的方法，其特征在于制得的抗氧化肽通过飞行质谱分析鉴定获得抗氧化肽的氨基酸序列。8一种以权利要求14任一项所述的抗氧化肽为主要成分的抗氧化剂。9一种权利要求14任一项所述的抗氧化肽和权利要求8所述的抗氧化剂在保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品、。
5、日化用品中的应用。权利要求书CN104311629A1/6页3一种抗氧化肽及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及一种来源于羽毛角蛋白的抗氧化肽，以及作为抗氧化剂在食品、保健品、日化用品等产品中的应用。背景技术0002抗氧化剂广泛应用在食品、保健品、日化用品等领域。抗氧化剂一方面可以防止以上产品因为氧化变色或变质；另一方面某些氧化剂甚至在相关的产品中扮演活性功能作用，如在体内发挥抗氧化、清除自由基等功效。目前在食品工业中广泛采用丁基羟基茴香醚BHA、2,6二叔丁基对甲酚BHT等化学合成的抗氧化剂，但这些合成的抗氧化剂由于对人体健康的潜在危险，其应用日益受到限制。近年来，人们积极寻找天然的、。
6、安全的抗氧化剂，在许多天然动植物材料中发现各种不同的抗氧化化合物的存在，如维生素E、茶多酚等。此外，许多小肽也具有抗氧化活性，并存在于各种来源的蛋白质的水解产物中。其中，一些抗氧化肽已经分离鉴定出氨基酸序列。例如中国专利CN200510009432、CN201010141974分别利用不同的蛋白酶水解蜂王浆和胶原蛋白，制备、鉴定出具有抗氧化作用的小肽。在公开发表的科技文献中，已有报道从不同的动植物材料中分离、鉴定出抗氧化肽。例如，植物来源的抗氧化肽包括水稻胚乳蛋白的酶解产物PHEARGGLUHISLYSLYS，LYSHISASNARGGLYASPGLUPHE和棉籽蛋白的水解产物HISASPAS。
7、PALAPROARGPHE；动物来源的抗氧化肽包括黄花鱼ASNHISARGTYRASPARG、竹荚鱼GLYASNARGGLYPHEALACYSARGHISALA、沙丁鱼LEUHISTYR，LEUALAARGLEU，GLYGLYGLU，GLYALAHIS，GLYALATRPALA，PROHISTYRLEU，GLYALALEUALAALAHIS和金乌贼ALAPROPROGLUASNGLYMETALAGLNMET。大多数这些专利或公开文献报道鉴定获得的抗氧化肽大多来自于动植物来源的食品材料，抗氧化肽在这些原料中含量极少，因此回收得率低，并且需要复杂的分离纯化等制备技术和过程。发明内容0003本发明基。
8、于充分利用农业废弃资源的原则，利用微生物发酵水解废弃羽毛角蛋白，最终从羽毛角蛋白的水解产物中分离鉴定出一种具有抗氧化，能够清除自由基等活性的抗氧化肽。0004为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是0005本发明提供一种具备抗氧化、清除自由基、鳌合金属离子等功能活性的一种活性功能肽，该肽由八个氨基酸组成，其序列为0006SEQIDNO1SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY0007所述抗氧化肽来源于羽毛角蛋白，通过羽毛或者羽毛角蛋白通过微生物水解，分离纯化等步骤来制备。具体步骤为0008步骤1利用羽毛或者羽毛角蛋白作为原料，加入培养液，灭菌，接种细菌枯草芽说明书CN1043116。
9、29A2/6页4孢杆菌BACILLUSSUBTILISS14菌株，在3037震荡培养发酵4872H。0009步骤2离心收集上清液，加入6M盐酸调PH至20，再离心获得沉淀，冷冻干燥。0010步骤3用二甲基亚砜DMSO溶解沉淀，并将获得的溶液通过阳离子交换层析，收集合并具有抗氧化活性的组分，冷冻干燥。0011步骤4再用DMSO溶解步骤3中的冻干产物，用反向层析RFFPLC分离，合并抗氧化组分，冷冻干燥后，再次用反向层析分离，保留具有抗氧化性的组分，冷冻干燥。0012将冷冻干燥获得的抗氧化肽样品，通过飞行质谱进行分析。将分析获得的二级质谱数据搜索家鸡基因数据库，鉴定获得抗氧化活性的小肽，其氨基酸序。
10、列为SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY。0013本发明所述抗氧化肽也可以通过化学合成制备。0014本发明还包括以所述抗氧化肽为主要成分的抗氧化剂。0015本发明所述的抗氧化肽和含有抗氧化肽的抗氧化剂可以应用在保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品、日化用品等领域中。0016与现有的类似的抗氧化肽相比，本发明所述的小肽具有以下优点1制备该肽的原料羽毛角蛋白资源丰富、价格低廉；2根据羽毛角蛋白的组成，本发明所述功能活性肽在羽毛角蛋白中，含量相对丰富；3利用微生物直接发酵水解羽毛角蛋白，制备成本具备相对优势。附图说明0017下面结合附图对本发明作进一步说明0018图1是阳离子交换层。
11、析分离羽毛水解产物的洗脱曲线；0019图2是抗氧化肽的二级质谱图；0020图3抗氧化肽抗氧化活性；0021图4是抗氧化肽氧化二价铁离子的能力；0022图5是抗氧化肽清除ABTS自由基的作用；0023图6是抗氧化肽清除DPPH自由基的作用；0024图7是抗氧化肽鳌合铁离子的能力。具体实施方式0025下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。0026实施例10027微生物发酵水解羽。
12、毛角蛋白0028在500ML的玻璃三角瓶中装入100ML基本培养基和5G家鸡羽毛，在121下高压灭菌20MIN。所述基本培养基包括015K2HPO4，00025MGSO47H2O，00025CACL2，00015FESO47H20，00005ZNSO47H2O，其余为无菌水。冷却后，接入1ML过夜培养的细菌BACILLUSSUBTILIS菌株S14，然后在37OC震荡培养72H；将细菌发酵液用四层纱说明书CN104311629A3/6页5布过滤，过滤得到的滤液在8000RPM离心10MIN，取上清液，然后用6M盐酸滴定PH至20，4静止过夜；将上述样品用12000RPM离心，获得沉淀，并冷冻干。
13、燥，获得羽毛角蛋白的水解产物。0029羽毛角蛋白水解产物的分离纯化0030用TRISHCL缓冲液PH70充分洗涤冷冻干燥的沉淀，然后用二甲基亚砜DMSO溶解沉淀，8000RPM离心，获得样品。将此样品经强阳离子交换树脂层析柱2550CM，用80甲醇溶液进行NACL梯度洗脱，分部34ML收集，然后测定每管在230NM处的吸收值和抗氧化活性，获得洗脱曲线见图1。将具有抗氧化活性的样品合并，冷冻干燥，然后将样品溶解于DMSO中。然后，采用通用电气GE公司生产的层析系统PURIER进行反向层析，层析柱采用GE公司商品反向柱RESOURCE15RPC。取2ML样品上样，用含005三氟乙酸的乙腈进行梯度5。
14、100洗脱，洗脱5倍柱床体积，流速10ML/MIN，分部收集05ML。然后根据215NM和245NM的吸收峰，分析测定洗脱样品的抗氧化活性，最后将具有抗氧化活性的样品合并，冷冻干燥。然后将上述样品，再次用上述同样的方法进行一次RPFPLC。最后获得具有抗氧化活性的样品直接用于下一步质谱分析与鉴定。0031抗氧化肽的质谱鉴定0032将冷冻干燥的上述样品溶解于DMSO中，取5L样品上样，进行飞行质谱MALDITOFMS分析，其二级质谱图参见图2。最后，将二级质谱数据搜索、检索美国国立卫生院基因数据库GENBANK中的家鸡蛋白质数据，最终鉴定获得出抗氧化活性小肽，其氨基酸序列为0033SEQIDNO。
15、1SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY。0034抗氧化肽的化学合成和生物活性测定0035为了验证上述氨基酸序列组成的小肽的抗氧化等特性，根据鉴定的氨基酸序列，采用固相自动多肽合成仪化学合成了氨基酸序列完全相同的八肽SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY，并经C18反向HPLC脱盐、纯化，冷冻干燥。然后将样品用DMSO溶解分别测定了该小肽的相应性质或特性。00361抗氧化能力测定本实验使用碧云天公司所产的总抗氧化能力测定试剂盒FRAP法，即在96孔板上加入180L测试工作液，再加入5L浓度为2540MG/ML的样品，混匀，37反应5MIN，用酶标仪上测定593NM的光密度值。
16、。以FESO4制备标准曲线，将样品换算成相应浓度的FESO4。结果见图3。00372还原力测定取浓度为0510MG/ML的样品20L与20L磷酸缓冲液PH66和铁氰化钾溶液10MG/ML混合，50反应20MIN，再加入20L10三氯乙酸，1500G离心10MIN，然后取70L上清液在96孔板中与70L去离子水和14L01FECL2混合，室温静止10MIN后，用酶标仪在700NM处比色。结果见图4。00383清除ABTS自由基的分析分别取02ML的74MMOL/LABTS和02ML的26MMOL/LK2S2O8混合，黑暗处静置12H后，用无水乙醇稀释50倍加无水乙醇196ML，A73407002。
17、，此为ABTS自由基ABTS工作液。然后，取100LABTS自由基工作液，加入25L样品浓度分别为01100MG/ML，震荡摇晃10S，充分混匀后室温静置6MIN，于734NM处测定OD值。同时以95乙醇作空白对照。结果见图5。说明书CN104311629A4/6页600394清除DPPH自由基的测定取60L样品溶液浓度分别为0214MG/ML与60LDPPH试剂01MMOL/L的95乙醇溶液混合，避光静置20MIN，1000RPM离心10MIN，取上清液在517NM处，比色读取光密度值。同时以95的乙醇作为空白；以DMSO溶液替代样品作为对照。最终样品清除自由基的能力用以下公式计算0040自。
18、由基清除能力对照空白样品/对照1000041结果见图6。00425鳌合铁离子的测定取25L样品浓度分别为05160MG/ML与50L2MMOL/LFECL2混合，再加入50L显色剂FERROZINE，剧烈震荡，然后在室温静置10MIN，于562NM比色取光密度值。以去离子水替代样品作为对照，按下式计算金属离子鳌合能力0043金属离子鳌合能力1样品/对照1000044结果见图7。0045综上所述，本发明从家禽羽毛或羽毛角蛋白中提取的抗氧化肽具备抗氧化、清除自由基、鳌合金属离子等功能活性。本发明的抗氧化肽可以和其它物质混合作为抗氧化剂。抗氧化肽或以抗氧化肽为主要成分的抗氧化剂可以应用于食品、保健品。
19、、营养强化剂、动物饲料、化妆品和日化品等领域。0046实施例20047片剂的制造0048将实施例1中得到的20质量份的抗氧化肽SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY，46质量份的乳糖，30质量份的结晶纤维素，4质量份的水充分混合后，通过压片机进行压片，制造成具有抗氧化作用的片剂。0049实施例30050食用饼干的制造0051制作表1物质的生面团，进行发酵，烘焙后制得含有抗氧化肽SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY具有抗氧化作用的饼干。0052表100530054实施例4说明书CN104311629A5/6页70055动物饲料的制造0056将表2中各组分混合，制成含有本发明。
20、实施例1中所得抗氧化肽SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY的狗饲料。0057表200580059实施例50060化妆水的制造0061将表2中各组分混合，制成含有本发明实施例1中所得抗氧化肽SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY的具有抗氧化功能的化妆水。0062表300630064实施例60065果汁饮料的制造0066将表2中各组分充分混合，制成含有本发明实施例1中所得抗氧化肽SERASNLEUCYSARGPROCYSGLY的具有抗氧化功能的果汁饮料。0067表40068说明书CN104311629A6/6页80069上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。说明书CN104311629A1/1页90001序列表CN104311629A1/4页10图1图2说明书附图CN104311629A102/4页11图3图4说明书附图CN104311629A113/4页12图5图6说明书附图CN104311629A124/4页13图7说明书附图CN104311629A13。