维生素的生产方法 【发明领域】
本发明涉及维生素，尤其是维生素A和E和相关化合物的生产方法。
【发明背景】
维生素E(d-α-生育酚，1)是人和动物重要的营养补充剂。商业上，可从多种植物油中分离得到化合物1，或者通过环甲基化相关的天然d-γ-生育酚2而半合成得到化合物1。更重要的维生素E来源是可提供d，1-α-生育酚3的全合成。尽管3是异构体混合物，但它能提供1的很多生物活性，并且因其较低廉的价格和更强的效力而得以广泛应用。有关维生素E的一般性讨论，可参见L.Machlin编写的“维生素E：综合性论文集”，Marcel Dekker，纽约，1980。
通过在酸性催化剂(通常为路易斯酸，
如氯化锌)的存在下，使三甲基氢醌4与植醇5或异植醇6反应即可得到d，1-α-生育酚3。此技术可参见S.Kasparek，于L.Machlin编写的“维生素E：综合性论文集”，第2章，p8-65，Marcel Dekker，纽约，1965。此章的参考文献140-166提供了制备化合物3的详细方法的原始参考文献。
可通过多步合成得到制备3所需的异植醇6或植醇5。起始物一般包括丙酮(参见Kasparek，于Machlin，“维生素E：综合性论文集”，p44-45，Dekker，纽约，1980和其中提及的参考文献)和环异戊二烯三聚体(Pond等，US3917710和3862988(1975))。
此外，Jacob，Steiger，Todd和Wilcox(化学会志，1939，542)通过全合成首次制备出γ-生育酚。这些研究人员通过在氯化锌的存在下使2，3-二甲基氢醌的一苯甲酸酯与植基溴反应，然后除去苯甲酸酯得到低产率(22％)的γ-生育酚，从而生产出维生素。有关生育酚和生育三烯酚的已知合成方法可参见S.Kasparek，于L.Machlin，“维生素E：综合性论文集”，Dekker，纽约，1980；然而，制备γ-生育酚的其它方法尚未见报道。
尽管制备或分离维生素E家族化合物成员的多种方法是已知地，但仍需要改良的和更有效的生产方法。
维生素A(视黄醇)和前维生素A β-胡萝卜素被用于药物，食品和饮食添加剂。维生素A醋酸酯(醋酸视黄酯)，丙酸酯(丙酸视黄酯)和棕榈酸酯(棕榈酸视黄酯)是最常用的维生素A衍生物。目前，商业上生产的所有维生素A，维生素A的酯和β-胡萝卜素都是通过全化学合成生产的，只有一些维生素A是从食物来源分离得到的。例见Kirk-Othmer，化学技术百科全书，第24卷，p140-158(第3版，1984)。
仍需要经改良的和经济的方法来生产维生素A和维生素A的酯。
附图简述
图1A图示了依赖于甲羟戊酸的类异戊二烯生物合成途径。
图1B图示了不依赖于甲羟戊酸的类异戊二烯生物合成途径。
图2阐明了由香叶基香叶醇化学合成维生素E的途径的实施方案。
图3阐明了由法尼醇化学合成维生素E的途径的实施方案。
图4阐明了菌株MBNA1-13的衍生菌株的生长和法尼醇生产情况。
图5阐明了野生型erg9和经修复的ERG9菌株的生长情况。
图6阐明了HMG CoA还原酶产量增加的微生物中的法尼醇生产情况。
图7阐明了过量表达GGPP合酶的菌株中的法尼醇和GG生产情况。
图8阐明了FPP合酶的产量增加对法尼醇和GG生产的影响。
图9阐明了isoprenol和prenol代谢转变为法尼醇的途径。
图10阐明了由法尼醇生产维生素A醋酸酯的化学合成途径。
图11阐明了另一个由法尼醇生产维生素A醋酸酯的化学合成途径。
图12阐明了使用羰基偶合反应由视黄醛制备β-胡萝卜素的方法。
图13阐明了使用烷基化反应制备β-胡萝卜素的方法。
发明详述
1.0导言
本发明提供了生产α-生育酚和α-生育酯的方法，其中使用生物系统生产法尼醇或香叶基香叶醇(GG)。法尼醇可用作起始物质以化学合成终产物α-生育酯。或者，也可将法尼醇化学转变为GG。然后将生物体生产的GG或由法尼醇合成产生的GG用作起始物质以制备α-生育酚和α-生育酯。本发明还包括用于生物生产法尼醇或GG的生物材料和中间体的多个方面。本发明还包括将通过任何方法生产的法尼醇和/或GG用作起始物质以生产α-生育酚和α-生育酯的方法。
本发明也涉及由法尼醇生产维生素A的方法。在优选的实施方案中，法尼醇是由生物生产的。
2.0生物生产法尼醇和GG
类异戊二烯是最大的天然产物家族，已知的就有约22,000个不同的结构。所有类异戊二烯都衍生自C5化合物异戊基焦磷酸酯(IPP)。因此，所有类异戊二烯化合物的碳骨架都可通过在逐渐延长的多聚类戊二烯链上连续添加C5单位而产生。
尽管由IPP生产类异戊二烯的生物合成步骤是通用的，但却存在两种不同的IPP生产途径。真菌(例如酵母)和动物具有众所周知的依赖于-甲羟戊酸的途径(示于图1A)，该途径使用乙酰CoA为初始前体。另一方面，细菌和高等植物具有新近发现的不依赖于-甲羟戊酸的途径，本文也称之为非-甲羟戊酸途径(示于图1B)，该途径由丙酮酸和甘油醛3-磷酸起始[Lois等，美国国家科学院院报，95，2105-2110(1998)；Rohmer等，美国化学会志，118，2564-2566(1996)；Arigoni等，美国国家科学院院报，94，10600-10605(1997)；Lange等，美国国家科学院院报，95，2100-2104(1998)]。有证据表明，植物(包括微藻类)中既存在依赖于-甲羟戊酸的途径，也存在不依赖于-甲羟戊酸的途径，前者位于胞质中，而后者位于质体中[Arigoni等，美国国家科学院院报，94，10600-10605(1997)；Lange等，美国国家科学院院报，95，2100-2104(1998)]。已经确立了不依赖于-甲羟戊酸的途径的几个步骤。第一步，在D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶的催化下，由丙酮酸和甘油醛3-磷酸形成D-1-脱氧木酮糖5-磷酸。第二和第三步，在D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶的催化下，催化D-1-脱氧木酮糖5-磷酸转变为2-C-甲基D赤藓糖醇-4-P(MEP)。还需要几个反应才能将MEP转变为IPP，此时，这些酶是未知的[Lois等，美国国家科学院院报，95，2105-2110(1998)；Takahashi等，美国国家科学院院报，95，2100-2104(1998)；Duvold等，四面体通讯，38，4769-4772(1997)]。
法尼醇和GG分别是通过使法尼焦磷酸酯(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)去磷酸化而产生的异戊烯醇。FPP和GGPP是生物合成包括固醇，泛醌，血红素，多萜醇和类胡萝卜素的类异戊二烯化合物的中间体，并可用于蛋白质的翻译后异戊二烯化。FPP和GGPP都衍生自IPP。本发明的实施方案包括在原核或真核细胞培养物和无细胞系统中生物生产法尼醇或GG，而不论生物体利用的是依赖于甲羟戊酸的途径还是不依赖于甲羟戊酸的途径来生物合成所有类异戊二烯的前体IPP。除非特指一种特定的形式，本文中凡是提及法尼基磷酸酯或香叶基香叶基磷酸酯，都是指各自的一，二和三磷酸酯化合物。
2.1经修饰的微生物
适用于生产法尼醇和GG的生物系统包括原核和真核细胞培养物和无细胞系统。优选的生物系统包括真菌，细菌和显微藻类系统。更优选的生物系统是真菌细胞培养物，更优选为酵母细胞培养物，最优选为酿酒酵母细胞培养物。之所以优选真菌是因为长期以来它们一直被用于工业方法中，可使用经典的微生物学方法和基因工程技术对其进行操作。特别是，已在基因水平上较详尽地鉴定了酵母。实际上，酿酒酵母的整个基因组已被测序，并已克隆出编码类异戊二烯途径所需酶的基因。另外，酿酒酵母能生长至高细胞密度，据报道，在经基因工程改造的菌株中，角鲨烯和麦角固醇(见图1)的量高达细胞干重的16％。有关酵母类异戊二烯途径的最新评论，可参见Parks和Casey，微生物学年鉴，49：95-116(1995)。
优选的原核生物是大肠杆菌，作为生产代谢物(氨基酸，维生素)和多种重组蛋白质所用的工业微生物，大肠杆菌已被研究得较为透彻。整个大肠杆菌基因组也已被测序，其遗传系统的研究进展迅速。如上所述，大肠杆菌使用不依赖于-甲羟戊酸的途径合成IPP。大肠杆菌dxs，dxr，idi和ispA基因分别编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶，IPP异构酶和FPP合酶，这些基因已被克隆和测序[Fujisaki等，生物化学杂志，108，995-1000(1990)；Lois等，美国国家科学院院报，95，2105-2110(1998)；Hemmi等，生物化学杂志，123，1088-1096(1998)]。
用于本发明的优选显微藻类包括小球藻属(Chlorella)和Prototheca。
生产法尼醇和GG所用的适当生物体可得自多个来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，藻类培养物保藏中心(UTEX)，Austin，TX，北方地区研究实验室(NRRL)，Peoria，IL和大肠杆菌基因保藏中心(CGSC)，New Haven，CT。特别是，已使用酿酒酵母保藏培养物来研究类异戊二烯途径，所述培养物可得自例如加利弗里亚大学(Berkeley，CA)的JasperRine和北卡罗来纳州立大学(Raleigh，NC)的Leo Parks。
优选对细胞培养物中所用的细胞进行基因修饰以增加法尼醇或GG的产量。可通过基因工程技术(即重组技术)，经典的微生物学技术，或所述技术的组合对细胞进行基因修饰，细胞还包括天然的基因变体。一些这种技术一般性地公开于例如Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社(其全文列入本文作为参考)。经基因修饰的微生物中的核酸分子以一定的方式被插入，缺失或修饰(即突变；例如通过核苷酸的插入，缺失，取代和/或倒位而突变)，从而使所述修饰能提供所需的效果，该效果为使微生物内或培养物上清液中的法尼醇或GG的产量增加。在本文中，可将导致基因表达，基因功能或基因产物(即由基因编码的蛋白质)功能降低的基因修饰称为基因失活(完全或部分失活)，缺失，间断，阻断或下调。例如，在某一基因中，导致该基因编码的蛋白质功能降低的基因修饰可能是由于基因的完全缺失(即基因不存在，因此蛋白质也不存在)，导致蛋白质不完整或不翻译(例如蛋白质未表达)的基因突变，或者降低或废除蛋白质的天然功能(例如表达的蛋白质具有降低的酶活性或无酶活性)的基因突变。导致基因表达或功能增强的基因修饰被称为基因扩增，过量产生，过量表达，激活，增强，添加或上调。添加克隆基因以增加基因表达包括在复制质粒上维持克隆基因或将克隆基因整合至生产微生物的基因组中。此外，增加所需克隆基因的表达包括使克隆基因与天然或异源转录控制元件可操作相连。
2.1.1角鲨烯合酶修饰
本发明的实施方案包括通过培养微生物(优选为酵母)来生物生产法尼醇或GG，所述微生物已被基因修饰，籍此调节其类异戊二烯生物合成途径中的一个或多个酶的活性。在一个实施方案中，通过降低(包括消除)角鲨烯合酶活性的作用对微生物进行基因修饰(见图1)。例如，已制备出酵母erg9突变体，该突变体不能将甲羟戊酸转变为角鲨烯，但能积累法尼醇，Karst和Lacroute，Molec.Gen.Genet.，154,269-277(1977)；美国专利5,589,372。本文中凡是提及erg9突变体或突变，一般指的是降低角鲨烯合酶作用的基因修饰，例如通过阻断或降低角鲨烯合酶的产生，降低角鲨烯合酶的活性，或抑制角鲨烯合酶的活性而降低角鲨烯合酶的作用，从而导致法尼二磷酸(FPP)积累，除非FPP转变为另一种化合物，例如通过磷酸酶活性转变为法尼醇。阻断或降低角鲨烯合酶的产生包括将ERG9基因置于启动子的控制之下，所述启动子需要生长培养基中存在诱导化合物。通过建立使培养基中的诱导物耗尽的条件，ERG9基因的表达(因此，角鲨烯合酶的合成)可被关闭。此外，一些启动子会因为阻抑化合物的存在而关闭。例如，添加铜会阻抑酵母CTR3或CTR1基因的启动子。阻断或降低角鲨烯合酶的活性也包括使用类似于美国专利4,743,546(列入本文作为参考)所述切除技术。在此方法中，ERG9基因被克隆于特定的基因序列之间以从基因组中特异性地受控切除ERG9基因。可通过例如按美国专利4,743,546所述升高培养物的培养温度，或者通过一些其它的物理或营养信号来促进切除。这种基因修饰包括任何类型的修饰，并特别地包括通过重组技术和经典诱变进行的修饰。角鲨烯合酶的抑制剂是已知的(见美国专利4,871,721和引用在美国专利5,475,029中提及的参考文献)，可在细胞培养物中加入所述抑制剂。在另一个实施方案中，对具有类异戊二烯生物合成之不依赖于甲羟戊酸的途径的生物(如大肠杆菌)进行基因修饰，以使其积累FPP和/或法尼醇。例如，降低八异戊二烯基焦磷酸酯合酶(ispB基因的产物)的活性有望导致大肠杆菌中积累FPP(Asai等，Biochem.Biophys.Res.Comm.202,340-345(1994))。磷酸酶的作用可进一步导致大肠杆菌中积累法尼醇。
酵母菌株的细胞膜流动性需要麦角固醇，因此，麦角固醇途径被阻断的突变体，如erg9突变体需要在细胞培养基中添加外来的麦角固醇或其它固醇以维持细胞存活。除非在厌氧条件下生长，否则细胞一般不能利用添加的固醇。因此，本发明的另一个实施方案是酵母的应用，所述酵母中的角鲨烯合酶作用降低，如erg9突变体，并能在需氧条件下摄取外部补加的固醇。在下文的实施例章节(见实施例1)中将阐明使酵母在需氧条件下利用固醇的基因修饰是如何进行的，所述基因修饰也是现有技术中已知的。例如，所述基因修饰包括upc(使细胞在需氧条件下摄取固醇的摄取控制突变)和heml(HEM1基因编码氨基乙酰丙酸合酶，该酶是始于FPP的血红素生物合成途径的第一个受约束的步骤，只要在培养物中补加不饱和脂肪酸，heml突变体能在麦角固醇生物合成途径被破坏之后，在需氧条件下摄取麦角固醇)。使用已知技术可产生具有这些突变的酵母菌株，所述菌株也可得自例如北卡罗来纳州立大学(Raleigh，NC)的Leo Parks博士。可使用含有这些突变的单倍体细胞，通过与其它单倍体细胞进行遗传杂交以产生其它突变体。另外，也可使用SUT1(固醇摄取)基因的过量表达以在需氧条件下摄取固醇。SUT1基因已被克隆和测序，Bourot和Karst，基因，165：97-102(1995)。
在另一个实施方案中，通过在角鲨烯合酶抑制剂的存在下培养本发明的微生物来生产法尼醇和/或GG。在此方法中，角鲨烯合酶的作用降低。角鲨烯合酶抑制剂是本领域技术人员已知的(例见美国专利5,556,990)。
2.1.2 HMG-CoA还原酶修饰
本发明的另一个实施方案是经基因修饰后HMG-CoA还原酶作用有所增强的微生物的应用。应说明的是，增强HMG-CoA还原酶和本文所讨论的其它酶的作用指的是所述微生物中的任何基因修饰，该基因修饰可导致酶功能性的增强，包括酶活性的提高，酶抑制作用或降解作用的降低和酶的过量表达。例如，基因拷贝数增加，利用启动子使表达水平提高，所述启动子相对于天然启动子而言能使表达水平升高，或者通过基因工程或经典的诱变改变基因以增强酶活性。依赖于甲羟戊酸的类异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶是HMG-CoA还原酶，该酶催化还原3-羟基-3-甲基戊二酸单酰-辅酶A(HMG-CoA)。这是该途径中的初始限速步骤和第一个不可逆的步骤，HMG-CoA还原酶活性增强会导致野生型酿酒酵母菌株中的角鲨烯和麦角固醇产量增加，erg9菌株中的法尼醇产量增加。HMG-CoA还原酶作用增强的一个机理是通过降低对酶的抑制作用，通过对酶进行基因修饰或者通过改良系统以除去抑制剂。例如，类异戊二烯途径的固醇和非-固醇产物反馈抑制此酶(例见Parks和Casey，微生物学年鉴，49：95-116(1995))。或者或另外，可通过基因工程或经典的诱变技术改变编码HMG-CoA还原酶的基因以降低或防止抑制作用。此外，通过增加基因拷贝数，提高HMG-CoA还原酶基因的表达水平，或通过基因工程或经典的诱变技术改变HMG-CoA还原酶基因以提高酶活性即可增强HMG-CoA还原酶的作用。例见美国专利5,460,949(其全文列入本文作为参考)。例如，已产生了截短的HMG-CoA还原酶，其中的调控区被除去，高达约6的基因拷贝数的使用也使活性有所增强(文献同上)，也例见Downing等，Biochem.Biophys.Res.Comm.94，974-79(1980)，其中描述了HMG-CoA还原酶水平提高的两个酵母突变体。酿酒酵母中存在HMG-CoA还原酶的两个同工酶，分别由HMG1和HMG2基因编码。这两个同工酶的活性受几种机理调节，包括转录调节，翻译调节，对Hmg2p而言，还包括酶在内质网中的降解(Hampton和Rine，1994；Donald等，1997)。在Hmg1p和Hmg2p中，催化结构域位于酶的羧基末端部分，而调节结构域位于横跨膜的NH2末端区域。已证实，仅过量表达酿酒酵母Hmg1p催化结构域即可增加类异戊二烯途径的碳流量，导致角鲨烯的过量产生(Saunders等，1995；Donald等，1997)。本发明人在具有正常(即未被阻断的)类异戊二烯途径的菌株中表达了酿酒酵母Hmg2p的催化结构域，观察到角鲨烯产量的显著增加。另外，Hmg2p催化结构域的过量表达导致发酵罐中生长的erg9突变体的法尼醇产量增加，过量表达GGPP合酶的erg9突变体的法尼醇和GG产量增加。
2.1.3 GGPP合酶修饰
本发明的另一个实施方案是经基因修饰后GGPP合酶作用增强的微生物的应用。已鉴定出得自多个来源(包括细菌，真菌，植物，哺乳动物和古细菌)的编码该酶的基因。例见Brinkhaus等，Arch.Biochem.Biophys，266，607-612(1988)；Carattoli等，生物化学杂志，266，5854-59(1991)；Chen等，生物化学杂志，268，11002-11007(1993)；Dogbo等，Biochim.Biophys.Acta，920，140-148(1987)；Jiang等，生物化学杂志，270，21793-99(1995)；Kuntz等，植物杂志，2，25-34(1992)；Laferriere等，Biochim.Biophys.Acta，1077，167-72(1991)；Math等，美国国家科学院院报，89，6761-64(1992)；Ohnuma等，生物化学杂志，269，14792-97(1994)；Sagami等，Arch.Biochem.Biophys，297，314-20(1992)；Sagami等，生物化学杂志，269，20561-66(1994)；Sand-mann等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，18，245-51(1993)；Scolnik等，植物生理学，104，1469-70(1994)；Tachibana等，Biosci.Biotech.Biochem.，7，1129-33(1993)；Tachibana等，生物化学杂志，114，389-92(1993)；Wiedemann等，Arch.Biochem.Biophys.，306，152-57(1993)。一些生物具有双功能酶，该酶也可用作FPP合酶，因此参与IPP和DMAPP转变为FPP再转变为GGPP的整个过程(见图1)。一些酶(例如在植物中发现的那些酶)具有较低的特异性，能将IPP和DMAPP转变为GGPP(见图1)。本文所述GGPP合酶基因修饰包括对双功能的FPP/GGPP合酶进行基因改造以增强酶的GGPP合酶活性组分。优选的GGPP合酶基因是酿酒酵母的BTS1基因。BTS1基因及其分离描述于Jiang等，生物化学杂志，270，21793-99(1995)和1996年12月6日提交的共同悬而未决的申请流水号08/761，344(全文列入本文作为参考)。然而，也可使用其它宿主的GGPP合酶，使用双功能的GGPP合酶特别有利于引导碳从FPP流向GGPP，从而避免细胞在竞争反应中损失FPP。
在本发明的另一个实施方案中，除了修饰上述GGPP合酶外，还需从生产生物体中除去野生型GGPP合酶。这样可消除经修饰的GGPP合酶和野生型酶对底物FPP和IPP的竞争。编码GGPP合酶的野生型基因的缺失也可通过除去基因序列同源性高的区域，从而避免潜在有害的基因重组，来改良克隆的GGPP合酶基因的稳定性。
2.1.4 FPP合酶修饰
本发明的另一个实施方案是经基因修饰后FPP合酶作用增强的微生物的应用。
已鉴定出得自多个来源的编码此酶的基因，例见Anderson等，生物化学杂志，264，19176-19184(1989)；Attucci等，Arch.Biochem.Biophys.，321，493-500(1995)；Cane等，美国化学会志，105，122-124(1983)；Chambon等，当代遗传学，18，41-46(1990)；Chambon等，脂质，26，633-36(1991)；Chen等，蛋白质科学，3,600-607(1994)；Davisson等，美国化学会志，115，1235-45(1993)；Ding等，生物化学杂志，275，61-65(1991)；Hugueney等，FEBS Letters，273，235-38(1990)；Joly等，生物化学杂志，268，26983-89(1993)；Koyama等，生物化学杂志，113，355-63(1993)；Sheares等，生物化学，28，8129-35(1989)；Song等，美国国家科学院院报，91，3044-48(1994)；Spear等，生物化学杂志，267，14662-69(1992)；Spear等，生物化学杂志，269，25212-18(1994)。Anderson等，生物化学杂志，264，19176-19184(1989)报道了酿酒酵母FPP合酶基因在酵母穿梭载体中过量2-3倍的表达。
如实施例章节中所述，我们惊奇地发现FPP合酶的过量表达不会导致法尼醇产量的增加，但却在GGPP合酶未过量表达的情况下，出乎意料地导致了GG产量的增加。
在本发明的另一个实施方案中，除了修饰上述FPP合酶外，还需从生产生物体中除去野生型FPP合酶。这样可消除经修饰的FPP合酶和野生型酶之间对底物IPP，DMAPP和GPP的竞争。编码FPP合酶的野生型基因的缺失也可通过除去基因序列同源性高的区域，从而避免潜在有害的基因重组来改良克隆的FPP合酶基因的稳定性。
2.1.5磷酸酶修饰
本发明的另一个实施方案是经基因修饰后磷酸酶作用有所增强，从而增强了将FPP转变为法尼醇或将GGPP转变为GG之能力的微生物的应用。例如，酿酒酵母和大肠杆菌含有多种磷酸酶活性。通过检测几种磷酸酶是否能有效地使FPP或GGPP去磷酸化，可选择适当的磷酸酶，并在生产生物体中表达编码该酶的基因以提高法尼醇或GG的产量。除了增强所需磷酸酶的作用以提高法尼醇或GG的产量外，还可以通过基因工程方法除去不必要的磷酸酶活性，也可以单独使用后一种方法。例如，可以通过突变消除特异性地作用于FPP的磷酸酶活性，以使未被处理的FPP能转变为GGPP，继而转变为GG。
2.1.6其它的基因修饰
对其它类异戊二烯途径酶的修饰
上文描述的是为增强HMGCoA还原酶，GGPP合酶和磷酸酶的作用所作的修饰。对类异戊二烯途径酶作用的修饰不局限于这些特定的例子，也可使用类似的策略修饰其它类异戊二烯途径酶作用，所述酶如乙酰乙酰CoA硫解酶，HMGCoA合酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸脱羧酶，IPP异构酶，法尼焦磷酸酯合酶或D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶。
对主要代谢进行基因工程改造以增加类异戊二烯途径的前体供给
在具有依赖于甲羟戊酸的类异戊二烯途径的生物体中，法尼醇或GG的生物合成始于乙酰CoA(示于图1)。本发明的一个实施方案是对生产生物体进行基因修饰以使乙酰CoA的胞内水平提高，从而使更多的乙酰CoA可以导入类异戊二烯途径(由此产生法尼醇和/或GG)。例如，通过增强丙酮酸脱氢酶复合物的作用可增加乙酰CoA的供应量。通过增强丙酮酸激酶的作用来提高细胞中的丙酮酸水平可进一步增加乙酰CoA的供应量。在具有不依赖于甲羟戊酸的类异戊二烯途径的生物体中，类异戊二烯的生物合成始于丙酮酸和甘油醛3-磷酸。通过分别增强丙酮酸激酶和丙糖磷酸异构酶的作用可以增加类异戊二烯生物合成所需的丙酮酸和甘油醛3-磷酸的供应量。
提供上述实例仅为了阐明对主要代谢进行基因工程改造以提高类异戊二烯化合物产量的概念，而并未穷举可采用的方法。也可成功地使用多种其它策略来达到该目的。
阻断竞争FPP或GGPP的途径
在酵母中，FPP是分支点中间体，它可导致固醇，血红素，多萜醇，泛醌，GGPP和法尼基化的蛋白质的生物合成。在大肠杆菌中，FPP在导致泛醌生成的途径中可用作八异戊二烯基焦磷酸酯合酶的底物。在合成类胡萝卜素的细菌(如噬夏孢欧文氏菌)中，FPP在导致类胡萝卜素生成的第一步，通过GGPP合酶的作用转变为GGPP。为了提高法尼醇或GG的产量，需要灭活编码以FPP或GGPP为底物的酶的基因，或者通过突变或使用特定的酶抑制剂(这一点已在上文提及角鲨烯合酶时讨论过)来降低酶本身的活性。例如，在酿酒酵母中，除了灭活ERG9外，灭活FPP至血红素途径的第一步较为有利。如上所述，在大肠杆菌中，部分或完全灭活八异戊二烯基焦磷酸酯合酶可提高转变为法尼醇的FPP水平。最后，在生产类胡萝卜素的细菌(如噬夏孢欧文氏菌)中，消除GGPP合酶可使转变为法尼醇的FPP水平提高，而八氢番茄红素合酶(crtB基因产物)活性的灭活或降低可使转变为GG的GGPP水平提高。
阻断远离FPP或GGPP的途径可能对生产生物体的生长和生理有不利影响。我们还希望进行其它基因修饰以抵消这些并发的不利影响。如上所述分离酿酒酵母突变体，其类异戊二烯途径被阻断，并可在需氧的条件下摄取固醇，说明可得到补偿突变，该突变克服了初始基因修饰的影响。
分离抗法尼醇或GG的生产菌株
在实施例章节中，描述了通过酿酒酵母的经基因修饰菌株生产高水平的法尼醇和GG。据认为，由于法尼醇或GG的产量得到进一步提高，这些化合物的水平会达到对生产生物体有毒的程度。实际上，产物毒性是生物生产方法中常会遇到的问题。然而，通过经典方法或重组技术进行基因修饰以克服产物毒性也很常见。预期本发明会遇到产物毒性，因此，本发明的另一个实施方案是分离对法尼醇和/或GG的抗性有所增加的突变体。
分离具有改良的生长特性的生产生物体
阻断酿酒酵母的类异戊二烯途径的一个影响是：突变生物体(在本发明中为erg9突变体)的生长较其亲代(未阻断的)菌株更为缓慢，即使在培养基中加入麦角固醇也是如此。实施例1.G中阐明erg9突变体较缓慢的生长归因于erg9处的阻断，erg9突变的修复可使菌株的生长速率恢复至与野生型亲代大致相当的水平。erg9突变体较缓慢的生长可归因于在外源提供的麦角固醇和细胞内合成的麦角固醇上的生长具有差异，或者归因于其它生理学因素。本发明的一个实施方案是分离具有改良生长特性的法尼醇或GG生产菌株突变体。通过例如连续培养，选择生长较快的突变体即可达到这一目的。所述突变体可以自发产生，或者通过经典的诱变或分子遗传学方法得到。
2.2掺入prenol和isoprenol
在本发明的另一个实施方案中，通过在发酵培养基中导入isoprenol和/或prenol来生产法尼醇或GG。参照图9，这些化合物中的每一种被生物体摄取之后，即被焦磷酸基团磷酸化，分别形成3-异戊烯焦磷酸酯和3，3-二甲烯丙基焦磷酸酯，这两种化合物在异戊烯焦磷酸酯异构酶的作用下可以互相转变，然后，通过FPP合酶的作用，这些化合物转变为法尼焦磷酸酯。法尼焦磷酸酯去磷酸化之后即可形成法尼醇。法尼焦磷酸酯可进一步转变为香叶基香叶基焦磷酸酯。香叶基香叶基焦磷酸酯去磷酸化之后即可形成香叶基香叶醇。通过GGPP合酶和磷酸酶的联合作用，FPP可形成GG。isoprenol和prenol是可商购的化合物，也可通过本领域已知的方法生产。
在此实施方案中，发酵所用的微生物可以是本文所述任何微生物。另外，可对微生物进行基因修饰以增强二甲烯丙基转移酶的作用，从而促进香叶基焦磷酸酯和法尼焦磷酸酯的产生。已鉴定出得自多个来源的编码此酶的基因[Chen等，蛋白质科学，3,600-607(1994)]。另外，可对微生物进行基因修饰以增强isoprenol激酶或prenol激酶的作用。尽管这些酶尚未被发现，但使法尼醇和香叶基香叶醇磷酸化的类似酶已被描述[Bentinger等，Arch.Biochem.Biophys，353，191-198(1998)；Ohnuma等，生物化学杂志，119，541-547(1996)]。
2.3发酵培养基和条件
在生产法尼醇或GG的方法中，在发酵培养基中培养上文所述具有基因修饰的微生物以生产法尼醇或GG。适当的或有效的发酵培养基指的是任何培养基，其中本发明的经基因修饰的微生物经培养之后能产生法尼醇或GG。所述培养基一般是含水培养基，其中含有可同化的碳源，氮源和磷酸盐来源。所述培养基中也包括适当的盐，矿物质，金属和其它的营养物质。此外，当生物体的麦角固醇途径被阻断并且需要外源固醇时，发酵培养基中必需含有这种外源固醇。适当培养基的例子示于下文的讨论和实施例章节中。然而，应理解多种发酵条件都是适合的，本领域技术人员可以作出选择。
适当发酵培养基中所用的可同化碳源包括但不限于糖及其聚合物，包括糊精，蔗糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，果糖，甘露糖，山梨糖，阿拉伯糖和木糖；脂肪酸；有机酸，如乙酸；一元醇，如乙醇和正丙醇；和多元醇，如甘油。本发明的优选碳源包括单糖，二糖和三糖。最优选的碳源是葡萄糖。
发酵培养基中的碳源(如葡萄糖)浓度应该能促进细胞生长，但不应该高至抑制所用微生物的生长。发酵时加入的碳源(如葡萄糖)的水平一般应能达到获取必需的生长和生物量所需水平，但碳源水平不可测(检测限约＜0.1g/l)。在其它实施方案中，发酵培养基中的碳源(如葡萄糖)浓度大于约1g/l，优选大于约2g/l，更优选大于约5g/l。此外，发酵培养基中的碳源(如葡萄糖)浓度一般低于约100g/l，优选低于约50g/l，更优选低于约20g/l。应说明的是，发酵组分的浓度指的是原始的和/或发展中的组分浓度。在某些情况下，需要在发酵过程中使发酵培养基中的碳源耗尽。
适当的发酵培养基中所用的可同化氮源包括但不限于简单的氮源，有机氮源和复杂的氮源。所述氮源包括无水氨，铵盐和来源于动物，植物和/或微生物的物质。适当的氮源包括但不限于蛋白质水解物，微生物生物量水解物，蛋白胨，酵母膏，硫酸铵，尿素和氨基酸。发酵培养基中的氮源浓度一般大于约0.1g/l，优选大于约0.25g/l，更优选大于约1.0g/l。然而，如果发酵培养基中所添加的氮源浓度超出某一限度，将对微生物的生长不利。因此，发酵培养基中的氮源浓度应低于约20g/l，优选低于约10g/l，更优选低于约5g/l。另外，在某些情况下，需要在发酵过程中使发酵培养基中的氮源耗尽。
有效的发酵培养基可含有其它化合物，例如无机盐，维生素，痕量金属或生长促进剂。所述其它化合物也可存在于有效培养基中的碳源，氮源或矿物质来源中，或者被特异性地加入培养基中。
发酵培养基也可含有适当的磷酸盐来源。所述磷酸盐来源包括无机和有机磷酸盐来源。优选的磷酸盐来源包括但不限于磷酸盐，如磷酸氢二钠或磷酸二氢钠和磷酸钾，磷酸铵及其混合物。发酵培养基中的磷酸盐浓度一般大于约1.0g/l，优选大于约2.0g/l，更优选大于约5.0g/l。然而，如果发酵培养基中所添加的磷酸盐浓度超出某一限度，将对微生物的生长不利。因此，发酵培养基中的磷酸盐浓度应低于约20g/l，优选低于约15g/l，更优选低于约10g/l。
适当的发酵培养基中也可含有镁源，优选为生理上可接受的镁盐形式，如硫酸镁七水合物，但也可使用其它镁源，只要其浓度能提供相似量的镁即可。发酵培养基中的镁浓度一般大于约0.5g/l，优选大于约1.0g/l，更优选大于约2.0g/l。然而，如果发酵培养基中所添加的镁浓度超出某一限度，将对微生物的生长不利。因此，发酵培养基中的镁浓度一般低于约10g/l，优选低于约5g/l，更优选低于约3g/l。另外，在某些情况下，需要在发酵过程中使发酵培养基中的镁源耗尽。
发酵培养基中也可含有生物可接受的螯合剂，如柠檬酸三钠的二水合物。此时，发酵培养基中的螯合剂浓度大于约0.2g/l，优选大于约0.5g/l，更优选大于约1g/l。然而，如果发酵培养基中所添加的螯合剂浓度超出某一限度，将对微生物的生长不利。因此，发酵培养基中的螯合剂浓度一般低于约10g/l，优选低于约5g/l，更优选低于约2g/l。
发酵培养基中起初可含有生物可接受的酸或碱以维持发酵培养基所需的pH。生物可接受的酸包括但不限于盐酸，硫酸，硝酸，磷酸及其混合物。生物可接受的碱包括但不限于氢氧化铵，氢氧化钠，氢氧化钾及其混合物。在本发明优选的实施方案中，所用碱是氢氧化铵。
发酵培养基中也可含有生物可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。发酵培养基中的钙源(如氯化钙二水合物)浓度范围一般约为5mg/l至2000mg/l，优选约为20mg/l至1000mg/l，更优选约为50mg/l至500mg/l。
发酵培养基中也可含有氯化钠。发酵培养基中的氯化钠浓度范围一般约为0.1g/l至5g/l，优选约为1g/l至4g/l，更优选约为2g/l至4g/l。
如上所述，发酵培养基中也可含有痕量金属。可在发酵培养基中加入痕量金属的母液，为了方便起见，将母液的制备与发酵培养基其余组分的制备分开。发酵培养基中所用的适当痕量金属母液示于下表1。发酵培养基中所加入的痕量金属溶液的量一般大于约1ml/l，优选大于约5ml/l，更优选大于约10ml/l。然而，如果发酵培养基中所添加的痕量金属浓度超出某一限度，将对微生物的生长不利。因此，发酵培养基中加入的痕量金属溶液的量一般低于约100ml/l，优选低于约50ml/l，更优选低于约30ml/l。应说明的是，除了在母液中加入痕量金属外，可分开加入各个组分，其各自的浓度范围独立地相当于上述痕量金属溶液范围所示的组分量。
如下表1所示，本发明所用的适当痕量金属溶液包括但不限于硫酸铁七水合物；硫酸铜五水合物；硫酸锌七水合物；钼酸钠二水合物；氯化钴六水合物；和硫酸锰一水合物。在母液中加入盐酸以维持溶液中的痕量金属盐。
表1痕量金属母液 化合物 浓度(mg/l) 硫酸铁七水合物 280 硫酸铜五水合物 80 硫酸锌(II)七水合物 290 钼酸钠二水合物 240 氯化钴六水合物 240 硫酸锰一水合物 170 盐酸 0.1ml
发酵培养基中也可含有维生素，可在发酵培养基中加入维生素母液，为了方便起见，可将母液的制备与发酵培养基其余组分的制备分开。发酵培养基中所用的适当维生素母液示于下表2。发酵培养基中所加入的维生素溶液的量一般大于1ml/l，优选大于5ml/l，更优选大于10ml/l。然而，如果发酵培养基中所添加的维生素浓度超出某一限度，将对微生物的生长不利。因此，发酵培养基中加入的维生素溶液的量一般低于约50ml/l，优选低于约30ml/l，更优选低于约20ml/l。应说明的是，除了在母液中加入维生素外，可分开加入各个组分，其各自的浓度范围独立地相当于上述维生素溶液范围所示的组分量。
如表2所示，本发明所用的适当维生素溶液包括但不限于生物素，泛酸钙，肌醇，盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素。
表2 化合物 浓度(mg/l) 生物素 10 泛酸钙 120 肌醇 600 盐酸吡哆醇 120 盐酸硫胺素 120
如上所述，当生物体的固醇途径被阻断时，必须在发酵培养基中加入外源固醇。所述固醇包括但不限于麦角固醇和胆固醇。可在发酵培养基中加入所述固醇的母液，该母液是独立于发酵培养基的其余组分而制备的。使用有助于溶解固醇的去污剂可制备固醇母液。实施例1.D中描述了典型的麦角固醇母液。发酵培养基中所加入的固醇母液的量一般应使发酵培养基中固醇的终浓度范围约为1mg/l至3000mg/l，优选约为2mg/l至2000mg/l，更优选约为5mg/l至2000mg/l。
可用常规的发酵模式培养本发明的微生物，其包括但不限于分批，补料-分批，细胞再循环和连续培养。然而，优选以补料-分批模式进行发酵。在这种情况下，发酵过程中培养基的某些组分会被耗尽。发酵开始时，可使各组分的浓度相对较高以在需要补料之前将生长维持一段时间。当发酵耗尽了组分的浓度水平时，通过补料使这些组分在发酵过程中始终保持优选的浓度范围。通过例如定期取样发酵培养基并分析其浓度即可监测发酵培养基中的组分水平。或者，一旦展开标准的发酵程序，可以特定的时间间隔进行补料，所述时间间隔对应于发酵过程特定时间点的已知水平。本领域技术人员可以理解，发酵过程中营养物质消耗的速率随培养基中细胞密度的增加而增加。另外，为了避免在发酵培养基中导入外源微生物，可使用本领域已知的无菌添加法进行补料。另外，可在发酵过程中加入少量消泡剂。
发酵培养基的温度可以是适于生长和法尼醇或GG生产的任何温度。例如，在用接种物接种发酵培养基之前，发酵培养基的温度范围应达到并维持在约20℃至约45℃，优选温度范围约为25℃至40℃，更优选温度范围约为28℃至32℃。
通过在发酵培养基中加入酸或碱可控制发酵培养基的pH。在这种情况下，当使用氨控制pH时，它也可方便地用作发酵培养基的氮源。优选将pH维持在约为3.0至8.0，更优选约为3.5至7.0，最优选约为4.0至6.5。
在发酵过程中，也应维持发酵培养基中的溶解氧含量，从而维持细胞生长并维持细胞代谢以生产法尼醇或GG。使用已知方法，例如通过使用氧电极可监测发酵培养基中的氧浓度。也可使用本领域已知的方法，例如通过搅拌，振摇或喷气振荡培养基和往其中通气，从而在发酵培养基中加入氧。优选发酵培养基中的氧浓度范围约为培养基中氧饱和值的20％至100％，所述饱和值是基于大气压下，约20℃至40℃的温度范围内，发酵培养基中氧的溶解性而得出的值。在发酵过程中，氧浓度会周期性地下降至上述范围以下，然而，不会对发酵有不利的影响。
尽管本文描述了使用空气往培养基中通气，但也可使用其它氧源。通气用的气体中的含氧量大于空气中的含氧量较有利。另外，通气用的气体中可含有对发酵无不利影响的其它气体。
在本发明发酵方法的实施方案中，按上文和实施例1.H所述制备发酵培养基。用活跃生长的本发明微生物的培养物接种此发酵培养基，接种量应足以在合理的生长周期之后产生高细胞密度。根据细胞的干重，接种细胞密度的范围一般约为0.01g/l至10g/l，优选约为0.2g/l至5g/l，更优选约为0.05g/l至1.0g/l。然而，在生产规模的发酵罐中，优选较高的接种细胞密度。然后将细胞培养至细胞密度范围约为10g/l至100g/l，优选约为20g/l至80g/l，更优选约为50g/l至70g/l。在发酵过程中，微生物达到所需细胞密度的时间一般低于约200小时，优选低于约120小时，更优选低于约96小时。
在本发明的一个运作模式中，需要在发酵过程中监测发酵培养基的碳源浓度，如葡萄糖浓度。使用已知技术可监测发酵培养基的葡萄糖浓度，例如可使用葡萄糖氧化酶试验或高压液相层析，它们可用于监测上清液，如发酵培养基的无细胞成分中的葡萄糖浓度。如上所述，碳源浓度应该维持在使细胞生长受抑制的水平以下。尽管该浓度对各个生物体而言有所不同，但是如果碳源为葡萄糖的话，当葡萄糖浓度大于约60g/l时，细胞生长将会受抑制，通过试验可容易地测定此抑制作用。因此，当将葡萄糖用作碳源时，优选将葡萄糖补加至发酵罐中，并将其浓度维持在检测限以下。或者，将发酵培养基中的葡萄糖浓度范围维持在约为1g/l至100g/l，更优选约为2g/l至50g/l，更优选约为5g/l至20g/l。尽管通过加入例如基本上纯的葡萄糖溶液能使碳源浓度维持在所需的水平，但通过加入原始发酵培养基的等分试样维持发酵培养基中的碳源浓度是可以接受的，也是优选的。使用原始发酵培养基的等分试样是合乎需要的，因为同时也可维持培养基中其它营养成分(如氮源和磷酸盐来源)的浓度。类似地，通过加入痕量金属溶液的等分试样也可维持发酵培养基中痕量金属的浓度。
2.4法尼醇和GG的回收
一旦通过生物系统生产出法尼醇或GG，应进行回收或分离，随后化学转变为α-生育酚或α-生育酯。本发明人证实对法尼醇和GG而言，产物存在于培养物上清液中和/或与酵母细胞相关。关于细胞，法尼醇或GG的回收包括一些透化或裂解细胞的方法。使用包括但不限于下列的回收方法可回收培养物中的法尼醇或GG：层析，提取，溶剂提取，膜分离，电透析，反渗透，蒸馏，化学衍生化和结晶。当产物为磷酸酯形式时，即法尼基磷酸酯或香叶基香叶基磷酸酯时，它仅出现在细胞内部，因此，需要一些透化或裂解细胞的方法。
3.0 GG和法尼醇的化学合成
3.1 GG的化学合成
如上所述，在本发明的一个实施方案中，以生物学方法生产GG，而在另一实施方案中，可以由其它方法生产GG。例如，GG也可以通过化学合成由法尼醇生产。许多合适的方法在本领域是已知的。在上述的一个方法中，法尼醇被转变为法尼基溴(乙醚中的PBr3)并用乙酰乙酸乙酯置换。所产生的粗酮基酯被皂化，脱羧，并将产生的酮通过蒸馏纯化。按照Klinge和Demuth(Synlett 1993，783)的方法，该酮与膦酰基乙酸二异丙基乙基酯(NaH，甘醇二甲醚)进行Wittig-Horner反应，给出香叶基香叶酸t，t，t-和t，t，c-乙酯的大约80/20混合物。用氢化二异丁基铝还原香叶基香叶酸乙酯给出纯净的GG。t，t，t-和t，t，c-混合物可以在酯(例如，通过蒸馏)或醇(例如通过如EP711749中所述结晶化)氧化水平上分开。可以通过生物生产完成作为GG化学生产起始物质的法尼醇的生产，如通过使用具有某些上述经修饰特性的经修饰微生物而完成。
3.2法尼醇的化学合成
如上所述，在本发明的一个实施方案中，以生物学方法生产法尼醇，而在另一实施方案中，可以由其它方法生产法尼醇。例如，也可以通过化学合成生产法尼醇。许多合适的方法在本领域是已知的。
4.0通过化学合成由GG生产生育酚
在本发明的另一实施方案中，提供了由香叶基香叶醇生产维生素E的方法。香叶基香叶醇含有4个烯烃组成成分。如本发明中所用的，香叶基香叶醇的烯烃组成成分从羟基端顺序编号，即，第一个烯烃组成成分称为C2-C3双键，第二个烯烃组成成分称为C6-C7双键，第三个烯烃组成成分称为C10-C11双键，而第四个烯烃组成成分称为C14-C15双键。
本发明的方法包括还原香叶基香叶醇的至少一个烯烃组成成分以形成烯丙基醇。优选地，烯丙基醇是植醇或异植醇。烯丙基醇的形成可以通过烯烃的选择性还原实现，即还原第二，第三或第四烯烃组成成分的至少一个，但不还原第一烯烃组成成分。优选地，还原反应将还原除第一烯烃组成成分之外的所有烯烃组成成分。烯烃组成成分的还原可以通过任何已知的烯还原条件完成，包括偶氨还原；溶解金属还原；金属氢化物还原；和金属催化剂如钯，铑，镍，铂，铼，铜，铬或其组合存在下的氢化。优选地，通过氢化还原第二，第三或第四烯烃组成成分。
如果需要合成对映体富集或对映体纯的维生素E，可以用不对称催化剂如领域已知不对称氢化反应的催化剂进行烯烃组成成分的还原。或者，可以生产烯丙基醇的外消旋混合物并进行手性分离，以提供烯丙基醇的所需立体异构体。
在本发明的一个实施方案中，在还原第二，第三和/或第四烯烃组成成分之前将保护基加到香叶基香叶醇上。用于本发明中的保护基指的是在还原一个或多个烯烃组成成分之前能够被加到香叶基香叶醇上(或与之结合)，而在还原之后能够被脱除，从而由香叶基香叶醇提供烯丙基醇的任何化合物。优选地，保护基是羟基保护基。选择羟基保护基，使得第二，第三和第四烯烃组成成分的还原可以选择性地实现，而不还原第一烯烃组成成分。许多本领域已知的羟基保护基都可以使用。很多这些可能基团的例子可以在“有机合成中的保护基”(T.W.Green，John Wiley和Sons，1981，pp.10-86”)中找到，该文献全文列入本文作为参考。优选地，该羟基保护基是酯。更优选地，该酯是在将香叶基香叶醇还原为保护的烯丙基醇的条件下，为C2-C3烯烃组成成分提供足够保护，使其不被还原的立体位阻(即体积阻碍)的酯。例举的体积阻碍酯基包括异丁酸酯和新戊酸酯。
由烯丙基醇和氢醌形成维生素E。优选地，该氢醌是三甲基氢醌，更优选地，该氢醌是2，3，5-三甲基氢醌。应该理解，维生素E相关化合物(即α-生育酚)的形成可以用特定生育酚衍生物的相应氢醌实现。例如，β-，γ-和δ-生育酚可以分别由烯丙基醇和2，5-二甲基氢醌，2，3-二甲基氢醌和2-甲基氢醌合成。不受任何理论的束缚，据信烯丙基醇与酸接触产生碳正离子，该离子与氢醌反应形成维生素E。类似的碳正离子可以从植醇的卤素衍生物产生。例如，使卤代植烷如溴-，氯-或碘代植烷与路易斯酸如卤化锌，包括溴化锌，氯化锌和碘化锌；卤化铝包括溴化铝和氯化铝；卤化硼包括三氯化硼和三氟化硼；卤化银包括氯化银，溴化银和碘化银；卤化镍如氯化镍和溴化镍；和其它金属卤化物路易斯酸接触，可以产生能与氢醌反应形成维生素E的碳正离子。
图2举例说明了由香叶基香叶醇合成维生素E的特别优选的实施方案。用相应的酸或其衍生物如酸酐或酰氯将香叶基香叶醇2-1的羟基保护为异丁酸酯或其它体积位阻酯。然后用金属催化剂如载于碳上的钯(Pd/C)选择性氢化香叶基香叶基异丁酸酯2-2，产生植基异丁酸酯2-3。香叶基香叶基异丁酸酯2-2的氢化还原了第二，第三和第四烯烃组成成分，但不影响第一烯烃组成成分。据信异丁酸酯的立体体积位阻降低了被保护的香叶基香叶醇中第一烯烃组成成分的氢化速率，从而导致烯烃组成成分的选择性氢化。然后通过在碱性条件下水解除去羟基保护基，给出植醇2-4。植醇2-4与2，3，5-三甲基氢醌2-5在酸存在下反应，形成维生素E2-6。另外，植基异丁酸酯2-3可以被脱保护，并与2，3，5-三甲基氢醌2-5通过酸催化剂一步反应形成维生素E2-6。维生素E2-6还可以通过游离羟基组成成分的乙酰化而转化为保护的维生素E，如维生素E乙酸酯2-7。
另一将GG转化为α-生育酚或α-生育酯的化学合成法包括如下步骤：(a)选择性地氧化香叶基香叶醇7中的2，3-碳-碳双键，产生香叶基香叶醇-2，3-环氧化物8；(b)使环氧化物8中的其余三个碳-碳双键氢化，产生环氧基植醇9；(c)通过与氧受体反应，使环氧基植醇9脱氧，产生植醇5和异植醇6的混合物；和(d)植醇5和异植醇6的混合物与三甲基氢醌4反应，产生α-生育酚3。
选择性地氧化香叶基香叶醇中的2，3-碳-碳双键而产生香叶基香叶醇-2，3-环氧化物的步骤可以用任何已知能选择性地使烯丙基醇的烯烃官能团环氧化的试剂，如叔丁基氢过氧化物和钒或钼催化剂的联合，按Sharpless和Michaelson，美国化学会志，95，6136(1973)所教导的方法进行。过氧化氢或其它烷基氢过氧化物可以代替叔丁基氢过氧化物，可以使用惰性溶剂如芳香烃，脂肪烃，脂环烃或脂族酯。术语“脂肪烃”包括具有5至8个碳原子的直链或支链烷烃。庚烷是最优选的脂肪烃。术语“脂环烃”包括C5-C8环烷烃，并被一个或多个C1-C4烷基取代。术语“芳香烃”包括苯和被一至三个C1-C4烷基取代的苯。甲苯是最优选的芳香烃。术语“脂族酯”包括具有通式R1CO2R2且含有三至九个碳的脂族酯，其中R1和R2分别表示直链或支链C1-C4烷基，而乙酸乙酯是优选的脂族酯。
氢化环氧化物8中所剩三个碳-碳双键产生环氧基植醇9的步骤可以用任何非均相或均相催化剂在氢气氛中进行。因此，载体上的催化剂如Pd/C，Pt/C，氧化铂，Raney镍等等可以在相对于8约0.001至0.2份重量的水平，有或没有惰性溶剂如脂族酯，烷醇，芳香烃，脂肪烃或脂环烃或醚的情况下，在约1至约200大气压的氢气压，在约0℃至约150℃的温度下使用。术语“烷醇”表示式R3-OH的醇和式R3OCH2CH2OH的取代醇，其中R3表示直链或支链C1-C4烷基。术语“醚”表示具有式R1-邻R2，其中R1和R2如上定义的醚类，和四氢呋喃。通过与氧受体反应使环氧基植醇9脱氧产生植醇5和异植醇6的混合物的步骤可以是铼催化的氧转移反应，并可以在无溶剂的情况下进行，或者在惰性溶剂如芳香烃，脂肪烃，脂环烃，脂族酯，烷醇，醚或水存在下进行。该反应也可以在2-相水-有机溶剂体系中，加或不加相转移催化剂进行。该催化剂可以是取代的三氧化铼或这类三氧化铼化合物的聚合物-承载形式。该催化剂可以在基于9约0.01-5.0重量百分数的水平被使用。氧受体必须以每摩尔9 1.0-3.0摩尔的水平存在，并可以选自三芳基膦，三-C1-C6烷基膦，亚磷酸三芳基酯，亚磷酸三-C1-C18烷基酯，碱金属次磷酸盐或次磷酸。其它能够从9不可逆地接受氧的化合物也可以使用，例如二-C1-C6烷基硫化物和某些含氮碱如正C1-C6烷基吗啉。术语“芳基”包括苯基和萘基，及它们被一至三个C1-C6烷基取代的物质。术语“芳烷基”包括具有芳基(CH2)正结构的一价基团，其中n＝1至4。术语“取代的三氧化铼”包括式R-ReO3的化合物，其中R是选自C1-C10烷基，C6-C6芳基，芳烷基，环戊二烯基和被一至五个C1-C4烷基取代的环戊二烯基的烃基。
应该注意，在本发明中的环氧基植醇脱氧步骤，如通过与三苯膦或其它合适的氧受体在铼化合物如甲基三氧化铼催化下反应，是新颖和未预料到的反应。甲基三氧化铼在许多有机反应中用作催化剂已经有综述[Schmidt(J.Prakt.Chem./Chem.-Ztg.339，493-496(1997)]。Espenson和Zhu[(J.Molecular Catalysis A：Chemical 103，87-94(1995)]给出了用MTO催化氧从环氧化物转移到三苯膦并形成烯烃的六个实施例。已经注意到，从环氧化物产生烯烃的所有Espenson和Zhu的实施例都与简单的非功能性烃如环己烯，苯乙烯，环十二碳烯等等有关。这些作者都没有证明在含有其它官能团如一级羟基的分子内进行这类转移的可行性。事实上，Espenson和Zhu随后证实(有机化学杂志，61，324-328(1996)MTO催化一级醇的脱氢并形成醚和烯烃。因此，出人意料并令人惊奇地发现，当被用于环氧基植醇时，MTO/三苯膦给出高产率的烯丙基醇产品如异植醇和植醇。
在酸催化剂，通常是路易斯酸如氯化锌存在下以已知方法常规进行植醇5和异植醇6混合物与三甲基氢醌4的反应给出α-生育酚3。已经确定，植醇5和异植醇6的混合物可以被用于以与单个前体相同的产率制备α-生育酚。
适用于本发明术语的特例化合物如下。典型的芳香溶剂包括苯，甲苯，和o，m或对二甲苯或其混合物。甲苯是优选的芳香溶剂。典型的脂族溶剂包括正戊烷，正己烷，正庚烷和正辛烷和其异构体，正庚烷是优选的脂肪烃。典型的脂环烃包括环戊烷，环己烷，甲基环己烷和环庚烷。典型的脂族酯包括乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸正丙基酯，乙酸正丁基酯，乙酸异丙基酯，丙酸甲酯，丙酸乙酯，丁酸甲酯和丁酸乙酯。乙酸乙酯是优选的脂族酯。典型的烷醇和取代的烷醇包括甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，2-甲氧基乙醇，2-乙氧基乙醇和2-异丙氧基乙醇。典型的醚包括二乙醚，二异丙基醚，二丁基醚，正丁基甲基醚，叔丁基甲基醚和四氢呋喃。典型有用的路易斯酸包括氯化锌，氯化铝，三氟化硼，氯化铁和磷酸。氯化锌是优选的路易斯酸。
5.0法尼醇至维生素E
在本发明的另一实施方案中，提供了由法尼醇生产维生素E的方法。该方法一般性地包括将法尼醇转化为第一中间体化合物，其所含碳原子数量足以形成具有至少一个三甲基十三碳烷基取代基的维生素E，当该中间体随后与合适的氢醌反应时，形成维生素E。该方法进一步包括使中间体化合物与氢醌反应形成维生素E。优选地，中间体化合物含有的碳原子足以在维生素E的苯并二氢吡喃环组成成分的2-位形成甲基和三甲基十三碳烷基取代基。更优选地，中间体化合物选自植醇和异植醇。
该中间体化合物可以通过将法尼醇氧化为法尼醛而制备。醇氧化为醛的例子可以在“高等有机化学B分册：反应与合成，第二版”Carey和Sundburg，Plenum Press，1983，pp.481-490中找到，该文献全文列入本文作为参考。例如，法尼醇可以用二氧化锰；氧化铬如三氧化铬和重铬酸盐；氧化银；Swern氧化条件；和Oppenauer氧化条件氧化为法尼醛。另外，法尼醇可以用在Marko等，科学，1996，274，2044中公开的催化剂，经催化的空气氧化而被氧化。一般说来，法尼醇空气氧化为法尼醛包括在相对非极性溶剂如甲苯或苯中，在约80℃的温度下使用催化量的氯化铜，1，10-菲咯啉，亚肼基二羧酸二-叔丁基酯，和过量的碳酸钾。
由法尼醇生产维生素E的方法可以进一步包括由法尼醛形成甲基酮。该甲基酮可以通过包括与合适的酮如丙酮或其等价物醇醛缩合的许多方法形成。例如，法尼醛与乙酰乙酸酯进行醇醛缩合，接着进行脱羧基反应，提供与法尼醛和丙酮进行醇醛缩合相同的甲基酮产品。该甲基酮也可以用适当的Wittig或Homer-Emmons-Wadsworth试剂形成。这些试剂的应用在，例如“高等有机化学”，第三版，J.March，John Wiley & Sons，1985，pp.845-854中公开，该文献全文列入本文作为参考。
从法尼醇生产维生素E的方法可以进一步包括还原甲基酮中的烯烃组成成分形成烷基甲基酮。烯烃组成成分的还原在上面关于由GG生产维生素E的段落中讨论，并被引入本文作为参考。优选地，烷基甲基酮是6，10，14-三甲基十五烷-2-酮。该烷基甲基酮然后被转化为烯丙基醇。可以通过加入乙炔化物如乙炔锂，乙炔钠和乙炔基卤化镁，并部分地将所产生的乙炔基还原为乙烯基而生产该烯丙基醇。另外，可以通过本领域已知的其它方法直接形成烯丙基醇，例如通过烷基甲基酮与乙烯基阴离子如乙烯基卤化镁，乙烯基锂或乙烯基钠反应。
由烯丙基醇形成维生素在上面由香叶基香叶醇生产维生素的部分讨论。
图3举例说明了由法尼醇合成维生素E的特别优选的实施方案。在Oppenauer氧化条件下，用异丙基氧化铝和丙酮将法尼醇3-8氧化为法尼醛3-9。然后，法尼醛3-9通过与丙酮进行醇醛缩合反应而转化为脱氢法尼基丙酮3-10。通过氢化还原脱氢法尼基丙酮3-10的烯烃组成成分，则产生6，10，14-三甲基十五烷-2-酮3-11。将乙炔化物加入酮3-11则产生炔丙基醇3-12，将其用Lindlar氢化条件部分还原产生异植醇3-13。异植醇3-13与2，3，5-三甲基氢醌3-5在酸催化剂存在下反应则产生维生素E。
6.0 γ-生育酚的生产
根据图10，本发明的另一实施方案是经济地制备合成的γ-生育酚的方法。该方法包括使具有化合物10的分子式的4-苯并二氢吡喃酮生育三烯酚进行催化氢化，还原三个侧链双键和4-酮基，给出γ-生育酚11。起始化合物10是已知的，并可以如下生产。法尼基丙酮12和2，5-二羟基-3，4-二甲基乙酰苯酮13在碱性催化剂存在下反应，给出4-苯并二氢吡喃酮生育三烯酚化合物10。该反应是本领域已知的。其一般性方法由Kabbe和Heitzer(合成，1978，888)描述，其具体反应由Pearce等(J.Med.Chem.37，526(1994))公开。而且，可以从天然来源中分离4-苯并二氢吡喃酮10，Lane等在US-5591772(1997)中公开了4-苯并二氢吡喃酮10。
相反，将4-苯并二氢吡喃酮生育三烯酚氢化的步骤既是新的，也是出人意料的。据Kabbe和Heitzer(合成，1978，888)报道，在α-生育酚系列中，4-苯并二氢吡喃酮经三步程序被转化为α-生育酚。首先，用硼氢化钠将4-苯并二氢吡喃酮的酮基还原为醇，然后消除水给出四烯。然后催化氢化该化合物，产生α-生育酚。包括昂贵试剂硼氢化钠的这种多步程序的应用显然是不能令人满意的，但是是必需的。现已确定，用Kabbe和Heitzer的工艺制备的4-苯并二氢吡喃酮不能通过单独的催化氢化转化为α-生育酚。企图进行该转化，结果却形成了饱和的酮。因而不能通过催化氢化来还原4-苯并二氢吡喃酮的羰基。因此，出人意料并令人惊奇的是，酮10被同源γ系氢化为生育酚11的步骤可以通过简单而便宜的镍或铜铬铁矿催化剂的一步催化氢化以高产率进行。这种转化方法大大优越于如Kabbe和Heitzer教导的包括氢化物还原剂的多步法。
4-苯并二氢吡喃酮生育三烯酚10催化氢化为γ-生育酚11可以用非均相催化剂如Raney镍或铜铬铁矿在升高的温度和氢气压力下进行。可以在相对于4-苯并二氢吡喃酮生育三烯酚约0.001至0.3份重的水平，有或没有惰性溶剂如甲醇，乙醇，异丙醇，脂族酯，醚等的情况下使用催化剂。该反应可以在约50℃至约250℃的范围，更优选约135℃至约175℃的温度范围进行。该反应可以在约100psi至约3000psi氢气，更优选约400psi至约750psi氢气的压力下进行。反应时间可以在约0.5至48小时之间变化。
除Raney镍或铜铬铁矿之外的催化剂也可以被用于本发明的方法中。这类催化剂可以包括，但不限于，贵金属催化剂如载体上的或均相的铂，钯，铑，氧化铂及其衍生物，和Raney钴。
7.0以化学方法由法尼醇生产维生素A
如上所述，本方法包括由法尼醇制备α，β-不饱和多烯羰基化合物。本发明所用的α，β-不饱和多烯羰基化合物指具有两个或多个烯烃部分的化合物，其中烯烃部分的至少一个与羰基共轭。羰基指碳-氧双键部分的存在。羰基的例子包括醛，酮，酯，酸，酸酐和酰卤。优选地，α，β-不饱和多烯羰基化合物是下式的：
其中Z是O或CHCO2R，而R是氢或C1-C10烃基。
本发明的烃基包括具有1至约10个碳原子的脂族，环状或芳香烃。烃基可以是直链或支链的。而且，烃基非强制性地可以被一个或多个取代基，如卤原子，芳基，羟基，烷氧基，羧基，氧代基和环烷基。可以在烃基中插入一个或多个氧，硫或取代或未取代的氮原子。烃基的例子包括甲基，乙基，异丙基，正丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，庚基和辛基。
α，β-不饱和多烯羰基化合物可以由法尼醇以多种途径制备。在本发明特别优选的方案中，法尼醇被氧化为法尼醛，随后转化为α，β-不饱和多烯羰基化合物。醇(例如法尼醇)氧化为醛(例如法尼醛)的例子可以在“高等有机化学B分册：反应与合成，第二版”，Carey和Sundburg，Plenum出版社，1983，pp.481-490中找到，该文献全文列入本文作为参考。例如，法尼醇可以用二氧化锰；氧化铬如三氧化铬和重铬酸盐；氧化银；Swern氧化条件；和Oppenauer氧化条件氧化为法尼醛。另外，法尼醇可以用在Marko等人，科学，1996，274，2044中公开的催化剂，经催化的空气氧化而被氧化。一般说来，法尼醇空气氧化为法尼醛包括在约80℃，在相对非极性溶剂如甲苯或苯中使用催化量的氯化铜，1，10-菲咯啉，亚肼基二羧酸二-叔丁基酯和过量的碳酸钾。
由法尼醇生产维生素A的方法可以进一步包括使α，β-不饱和多烯羰基化合物环化形成环状α，β-不饱和多烯羰基化合物。优选地，环状α，β-不饱和多烯羰基化合物是下式化合物：
其中Z是O或CHCO2R，而R是氢或C1-C10烃基。当Z是O时，该方法可以包括将O转化为CHCO2R或CHCN。此转化可以通过用适当的试剂羟醛缩合而实现。例如，环状α，β-不饱和多烯羰基化合物与NCCH2CH2CO2R的羟醛缩合，其中R是氢或C1-C10烃基，接着除去CO2R部分，例如，通过脱羧反应，给出其中羰基氧已经被CHCN部分代替的化合物。另外，用其中R和R’独立地是氢或C1-C10烃基的R’O2CCH2CO2R代替NCCH2CH2CO2R，给出其中羰基氧已经被CO2R部分代替的化合物。
由法尼醇生产维生素A的方法还可以包括将酯基(CHCO2R)或氰基(CHCN)还原为醇的步骤。
附图10举例说明了由法尼醇1合成维生素A的特别优选的方案。丙酮和由法尼醇1氧化衍生的法尼醛2之间的羟醛缩合形成脱氢法尼基丙酮3。许多方法都可以由法尼醛2合成脱氢法尼基丙酮3。在本发明的另一方面，包含法尼醛2和丙酮的混合物在碱存在下被置于足以产生脱氢法尼基丙酮3的条件下。羟醛缩合反应的最初产物是β-羟基酮，该酮典型地在生产脱氢法尼基丙酮3的反应条件下进行消除反应。但是，在某些情况下，一些或所有的β-羟基酮中间体可以作为产物而得到。在这种情况下，简单地将β-羟基酮置于酸性或碱性条件下可以导致羟基的消除反应，产生所需的脱氢法尼基丙酮3。
脱氢法尼基丙酮3也可以通过将法尼醛2和式R1CH2C(＝O)CH2R2化合物的混合物置于足以产生脱氢法尼基丙酮3的条件下，从法尼醛2获得，其中R1是式-CO2R3部分，R2是氢或式-CO2R3部分，而R3是1至10个碳原子的烃基。为了从法尼醛2和式R1CH2C(＝O)CH2R2部分之间的反应获得脱氢法尼基丙酮3，必需将所得的产物置于脱羧条件下，除去R1和/或R2羧基。典型地，此脱羧反应需氧将酯基转化为羧酸或其盐，这可以通过酸性或碱性条件下将酯皂化而实现。
再提到附图10，包含脱氢法尼基丙酮3和式XCH2CO2R(其中R是氢或C1-C10烃基，而X是卤素)化合物的混合物置于足以生产C20-缩水甘油酸酯4的碱性条件下。优选地R选自甲基，乙基，和叔丁基。优选地X选自氯，溴和碘。然后将C20-缩水甘油酸酯4置于足以重排和脱水的条件下生产假视黄酸酯5。一般地，重排通过使C20-缩水甘油酸酯4与酸接触形成C20-羟基化合物(未显示)而实现。该C20-羟基化合物然后在反应条件下脱水，或置于分开的脱水条件下产生所需的假视黄酸酯5。C20-羟基化合物的脱水可以在酸性或碱性条件下实现。使假视黄酸酯5在足以环化的条件下生产视黄酸酯6。典型地环化条件包括使假视黄酸酯5与酸接触。该酸应该足以使烯烃部分质子化，从而产生碳正离子，即碳阳离子，该离子可以进行环化。而且，相对弱的亲核试剂，如卤离子或羧酸，可以被加入以捕集产生的环化碳正离子。当弱的亲核试剂存在时，所产生的环化产物可以含有亲核试剂，该亲核试剂可以在反应条件下进行消除，或者在分开的反应中通过消除反应而除去。优选地该酸选自盐酸；磷酸；氟磺酸；硫酸和羧酸如甲酸和乙酸和其混合物。用酸使1，5-二烯，如法尼基乙酸酯环化的反应条件在Muntyan等人，Izev.Akad. Nauk SSSR，Ser.Khim.，1997，633和Stork和Burgstahler，美国化学会志，1995，77，5068中公开，这些文献列入本文作为参考。
另外，假视黄酸酯5可以用酶环化。例如，番茄红素环化酶将适当的C40链环化为类胡萝卜素是公知的。类似地，环化酶可被用于使假视黄酸酯或其衍生物环化，生产视黄酸酯或其衍生物。
再提到附图10，在本发明的一个具体方案中，视黄酸酯6被还原为维生素A(视黄醇)。此还原可以通过任何已知的酯还原反应如使用包括，但不限于，LiAlH4，氢化二(2-甲氧基乙氧基)铝钠，和氢化二异丁基铝的化合物氢化物还原而实现。另外，视黄酸酯6可以在酸性或碱性条件下皂化或水解，产生视黄酸，然后可以用包括，但不限于硼烷(B2H6)的化合物在烯烃存在下将羧基选择性地还原，生产维生素A(视黄醇)8。
如附图10所示，在本发明另一方面，视黄酸酯6首先通过将视黄酸酯6与第一种还原剂接触而还原为视黄醛7。视黄醛7然后与第二种还原剂接触生产维生素A(8)。第一种还原剂将酯还原为醛。目前有许多方法和还原剂可被用于将酯还原为醛。这类还原剂包括，但不限于，氢化二异丁基铝。第二种还原剂典型地将醛还原为醇，但这些还原剂中的某些也可以直接将酯还原为醇。第二种还原剂的例子包括但不限于，LiAlH4，氢化二异丁基铝，氢化二(2-甲氧基乙氧基)铝钠和硼氢化钠。
乙酸酯9或其它维生素A酯衍生物可以通过使维生素A与乙酰化剂或其它酰基转移剂在足够的条件下接触，分别生产维生素A或其它维生素A酯衍生物。乙酰化剂和酰基转移剂的例子包括，但不限于，乙酸，丙酸，甲酸，丁酸的酸酐或酰氯，和混合酸酐。典型地，催化剂或碱也被用于酰基转移反应中。可用于酰基转移的碱的例子包括但不限于钠，锂和钾的氢氧化物，碳酸盐和碳酸氢盐；胺类如吡啶和三乙胺。酰基转移催化剂也可被用于促进反应和/或缩短反应时间。酰基转移催化剂的例子包括但不限于二甲基氨基吡啶(DMAP)。
从法尼醛生产维生素A的另一特别优选的方案在附图11中给出。脱氢法尼基丙酮3(如上所述生产)在足够脱氢的条件下，生产二(脱氢)-C18-酮10。脱氢法尼基丙酮3的脱氢反应可以通过使脱氢法尼基丙酮3与脱氢化剂接触而实现。脱氢化剂的例子包括，但不限于，醌类如2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯并醌(DDQ)；金属催化剂如钯，铂和镍；和其它合适的脱氢化剂。
然后使二(脱氢)-C18-酮10在足够的条件下进行环化，形成环状C18-酮11。典型的环化条件包括二(脱氢)-C18-酮10与酸接触。1，5-二烯，如法尼基乙酸酯环化的典型反应条件在上面讨论，并可用于此环化反应。环化反应也可以通过本专业技术人员已知的金属催化剂，包括镍和铑实现。二(脱氢)-C18-酮10也可以用酶环化。这类有用的酶在上面讨论。
再次提到附图11，包含环状C18-酮11和式NCCH2CO2R化合物的混合物在足够的反应条件下形成C20-腈12，其中R是氢或C1-C10烃基。当R是氢时，α-腈乙酸与碱接触，脱去羧酸质子以及羰基的α-质子。这两种质子可以用两种不同的碱除去，一种用于除去羧酸质子，而另一种用于除去α-质子，或者两种质子可以用其强度足以脱去两种质子的碱脱去。如果R是C1-C10烃基，则使用其强度足以使α-腈乙酸酯脱质子的碱。因为NCCH2CO2R含有两个拉电子基团，所以较弱的碱，如氢氧化物或胺，可以被用于脱去α-质子。脱质子的α-腈乙酸酯然后与环状C18-酮11进行缩合反应，接着脱水和脱羧，生产C20-腈12。脱水可以在缩合反应条件进行，或者可以在分开的反应条件进行。如果R是C1-C10烃基，则必需皂化，即水解烷基，形成羧酸或羧酸阴离子，然后将缩合的产物置于脱羧条件下。缩合产物的脱羧条件一般需氧缩合产物置于升高的温度下。
然后使C20-腈12首先与还原剂在足够的条件下接触，生产视黄醛7，或者将其用足够强的还原剂还原生产维生素A(8)。视黄醛7可以用第二种还原剂还原，给出维生素A。合适的还原条件和用于这些还原的试剂在上面描述。通过维生素A与如上所述合适的酯化剂反应，维生素A可以进一步转化为维生素A酯。
在本发明另一方案中，通过上述任一方法生产的视黄醛7在足够的条件下生产β-胡萝卜素13。例如，如附图12所示，当置于本专业公知的McMurry偶合反应条件下，两分子视黄醛7进行偶合反应。McMurry偶合反应是有机化学专业公知的，并由John McMurry在US-4225734中描述，将其全文列入本文作为参考。简要地说，McMurry偶合反应包括从羰基如酮和醛与反应活性的Ti(II)和/或Ti(0)类的还原性偶合生产烯烃。一般说来，该反应活性类型通过用选自LiAlH4，Na，K，Zn，Mg，NaBH4，CaH2和LiBH4的还原剂还原Ti(III)或Ti(IV)而就地产生。Ti(III)或Ti(IV)类型典型地是卤化钛如分别是TiCl3和TiCl4。
在本发明另一方案中，β-胡萝卜素13从由上述任一方法生产的维生素A来生产。如附图13所示，该方法一般包括视黄基卤15与视黄基苯基砜14反应。视黄基卤15可以通过如上所述生产的维生素A与选自包括HX，P(X)3和P(R4)3和X2混合物的反应混合物在足够的条件下接触，生产视黄基卤，其中X是卤离子，X2是卤素，而R4是C1-C10烃基。然后使视黄基卤15与视黄基苯基砜14的阴离子在足够的条件下接触，生产C40-砜16。在其中视黄基苯基砜14与视黄基卤15接触之前用碱脱质子的情况下，该碱的强度足以使几乎所有的视黄基苯基砜14脱质子。在与视黄基卤15接触之前脱去几乎所有视黄基苯基砜14质子的举例碱包括，但不限于，二异丙基氨化锂(LDA)，六甲基二硅烷基钠(NaHMDS)，甲基锂，丁基锂，叔丁基锂，仲丁基锂，氢化钾，氢化钠，叔丁醇盐。另外，视黄基卤15，视黄基苯基砜14和碱都在反应装置中混合，而碱可以使有些视黄基苯基砜分子脱质子化，后者与视黄基卤15反应形成C40-砜16，即视黄基苯基砜14的反应活性阴离子类型就地产生。
再次提到附图13，视黄基苯基砜14可以通过视黄基酯如视黄基乙酸酯9或视黄基卤15与包含苯基亚磺酸的反应混合物在足够的条件下反应而生产视黄基苯基砜14。碱可以被用于使苯基亚磺酸脱质子化，然后与视黄基乙酸酯或视黄基卤15进行亲核取代反应，生产视黄基苯基砜14。在与视黄基乙酸酯或视黄基卤15接触之前，苯基亚磺酸可以通过用诸如LDA，甲基锂，NaHMDS，叔丁基锂，仲丁基锂，NaH，KH，或叔丁醇盐基本上完全脱质子。另外，脱质子的苯基亚磺酸可以通过用碱，如锂，钠和钙的氢氧化物，碳酸氢盐和碳酸盐，胺如三乙胺，和二异丙基乙胺，和醇盐如甲醇盐，乙醇盐，和叔丁醇盐就地产生。
然后使通过视黄基卤15和视黄基苯基砜14之间的反应而产生的C40-砜16在足够的条件下消除苯基亚磺酸，生产β-胡萝卜素13。从C40-砜16消除苯基亚磺酸可以通过使C40-砜16与碱接触而实现。可用于消除反应的碱的例子包括但不限于LDA，甲基锂，二异丙基乙胺，氢氧化物，和醇盐如甲醇盐，乙醇盐和叔丁醇盐。
下列实施例用于举例说明本发明的方案，但不限制在权利要求中提出的本发明范围。
实施例
实施例1
本实施例描述了使用亚硝酸化学诱变酿酒酵母菌株ATCC28383从而产生erg9突变体。
如上所述，提高法尼醇或GG产量的一种方法是降低或消除角鲨烯合酶活性。在酿酒酵母中，角鲨烯合酶由ERG9基因编码。
A.诱变
菌株28383得自ATCC，它是下文一些比较实验中所用菌株64031(也得自ATCC)的亲代菌株。菌株64031是生产法尼醇的erg9-1突变体。
使用亚硝酸处理ATCC28383以绘制杀伤曲线。根据杀伤曲线所提供的信息，按下述用亚硝酸诱变ATCC28383。于30℃，在YPD培养基(1％细菌培养用酵母膏，2％细菌培养用蛋白胨和2％葡萄糖)中将28383细胞振荡培养过夜。洗涤并诱变细胞，诱变之后，通过于22℃在YPDC(YPD加4mg/l胆固醇)中培养过夜以回收细胞。然后洗涤培养物，并将其铺于含有多种水平制霉菌素(20，30，40，50mg/l)的YPDC琼脂(YPDC加2％细菌培养用琼脂)上。于22℃将这些培养物保温2周。
抗真菌的多烯抗生素制霉菌素通过特异性结合麦角固醇，继而导致选择性通透性的改变，最终抑制生长细胞的细胞壁合成。已证实，一些制霉菌素抗性菌株的麦角固醇产量降低。制霉菌素对胆固醇的亲和力很低(如果有的话)，当外源提供胆固醇时，固醇营养缺陷型可以象利用麦角固醇一样有效地利用胆固醇。
得到约3000个制霉菌素抗性菌落，筛选其中的温度敏感型(ts)和固醇营养缺陷型。为了测定温度敏感性，在允许的温度(22℃)下，在YPDC上培养经诱变的细胞，随后影印铺板至YPD琼脂上，在限制性温度(37℃)下保温。任何在高温下不能生长的细胞包括固醇途径具有条件致死和组成型致死缺陷的那些细胞。通过影印铺板于YPD琼脂(不含胆固醇)并于28℃保温过夜，筛选温度敏感型突变体中的固醇营养缺陷型。在3000个制霉菌素抗性菌落中，有170个被证实为ts和固醇营养缺陷型。
B.试管试验
按下述，首先在试管试验中评价这170个菌株生产法尼醇和类异戊二烯途径的其它中间体的情况。于28℃，在含10ml YPDC的螺口试管中将细胞振荡培养48小时。以2800rpm的转速离心细胞5至10分钟，将上清液转移至另一个试管中。用5ml蒸馏水将细胞洗涤1次，以2800rpm的转速再次离心5至10分钟。
通过加入2.5ml 0.2％的1，2，3-连苯三酚(溶于甲醇中)和1.25ml 60％KOH(溶于蒸馏水中)，涡旋混合，并于70至75℃的水浴中保温1.5小时以提取细胞沉淀物。如此皂化之后，加入5ml己烷，给试管重新加盖，涡旋15至30秒。以2800rpm的转速离心试管5分钟以分离相，回收己烷层。必要时，通过在氮气氛中蒸发溶剂以浓缩样品，并回加适量己烷供分析时用。
为了提取上清液，在上清液中加入5ml己烷，给试管重新加盖，涡旋15至30秒。以2800rpm的转速离心试管25分钟以分离相，回收己烷层，通过在氮气氛中蒸发溶剂以浓缩样品，并回加适量己烷供分析时用。
通过薄层层析(TLC)分析初步筛选得到的己烷提取物，并通过气相层析(GC)/质谱(MS)法证实法尼醇和类异戊二烯途径的其它中间体的存在。在反相C18硅胶板上进行TLC，使用6∶4(v/v)乙酸乙酯/乙腈(EtOAc/MeCN)为流动相，并使用溶于乙醇中的2％(w/v)磷钼酸(PMA)进行检测。使用HewlettPackard 5890 GC和5970系列质谱选择性检测仪进行GC/MS。所用柱是Restek Rtx-5MS(15m长，0.25mm ID，1μm薄膜系统)。将13个突变体鉴定为法尼醇或其它中间体的生产者。
C.摇瓶试验
然后在摇瓶中筛选这13个突变体以及亲代菌株28383和法尼醇生产菌株64031。将原始OD600nm为0.05的过夜培养物接种于含50ml YPDC培养基的250ml带挡板锥瓶中，于28℃振荡培养。对锥瓶进行取样，测定600nm下的OD值，细胞干重和固醇含量。为了测定干重，以8000rpm的转速离心5ml培养物。用蒸馏水将细胞洗涤2次，将细胞沉淀物重新悬浮于3至5ml蒸馏水中，并转移至预先称重的干重盘中。将盘置于100℃的烘箱中放置24小时，然后在干燥器中冷却，在分析天平上称重，按下式确定以g/l计的干重：
[总重量(盘＋细胞)－盘重]×200＝干重(g/l)
为了测定固醇含量，处理20ml培养物，提取细胞沉淀物和上清液，按上述测定法尼醇和其它固醇。
13个突变体中有7个似乎能产生麦角固醇途径的中间体，在另一烧瓶实验中进一步评价这些突变体(见下文)。通过对最高水平制霉菌素的抗性选择所有13个突变体。
使用7个突变菌株(MBNA1-1，MBNA1-5，MBNA1-9，MBNA1-10，MBNA1-11，MBNA1-13，MBNA1-14)，亲代菌株28383和突变菌株64031中的每一株的过夜培养物接种烧瓶中的50ml YPDC培养基，每个菌株重复3份摇瓶试验。如上所述，在24，48和72小时后将细胞和培养基分开提取至己烷中。在上述每个时间点进行干重分析(按上述进行)以测定细胞密度。通过GC/MS分析己烷提取物中的法尼醇，角鲨烯，胆固醇和麦角固醇的水平。法尼醇的结果示于下表3。
我们发现培养物上清液中的法尼醇水平较低，而细胞中积累的法尼醇水平要高得多。在第72小时时，菌株MBNA1-1产生出1％法尼醇和0.1％麦角固醇。菌株MBNA1-5未产生任何法尼醇，但产生了0.3％的角鲨烯。菌株MBNA1-9 48小时产生了0.64％法尼醇。MBNA1-10，MBNA1-11和MBNA1-14在细胞中产生很低水平的法尼醇，但似乎能制备麦角固醇。根据细胞干重(42，187ng/ml培养物)，MBNA1-13产生的法尼醇水平最高(2.5％)，但不能产生任何麦角固醇。因此，在生产法尼醇的菌株(MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13)中，麦角固醇途径被阻断的程度不等，因为MBNA1-1和MBNA1-9产生较低水平的法尼醇，它们的生长不需要麦角固醇，而MBNA1-13产生最高水平的法尼醇，该菌株的生长对固醇添加具有严格的需求。亲代菌株28383生产的麦角固醇高达0.4％(未生产出法尼醇)，erg9突变菌株64031的法尼醇积累约为0.4％。
表3在摇瓶实验中鉴定新的突变体 菌株名称 生长时间 干重 mg/ml 法尼醇(ng/ml培养物) 法尼醇 (％细胞干重)MBNA1-1 24 0.16 0 0.00 48 1.12 1793 0.16 72 1.26 13187 1.05MBNA1-5 24 2.46 0 0.00 48 1.6 0 0.00 72 1.06 0 0.00MBNA1-9 24 1.32 1122 0.09 48 2.96 19062 0.64 72 4.34 70625 0.00MBNA1-10 24 4.76 4636 0.10 48 9.44 444 0.00 72 7.9 166 0.00MBNA1-11 24 1.82 0 0.00 48 3.58 258 0.01 72 2.36 281 0.01 MBNA1-13 24 0.18 0 0.00 48 3.12 3657 0.12 72 1.66 42187 2.54 MBNA1-14 24 2.42 0 0.00 48 8.98 0 0.00 72 7.36 0 0.00 ATCC28383 24 7.36 0 0.00 48 8.52 0 0.00 72 8.84 0 0.00 ATCC64031 24 1.58 90 0.01 48 1.84 6845 0.37 72 1.28 4874 0.38
D.酶分析
所有酶分析所用的细胞都在YPDE培养基(含有5mg/l麦角固醇的YPD培养基)中培养。离心收集细胞，将1g(干重)细胞悬浮于4ml 0.1M Tris-HCl，pH7.0中，然后穿过弗氏压碎器(20,000psi)以破碎细胞悬浮液。离心所得(经裂解的)细胞悬浮液(15,000×g)，除非另有说明，否则可直接将上清液(无细胞提取物)用于酶分析。
分析突变体的角鲨烯合酶活性。角鲨烯合酶分析试验包括：在还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的存在下，将无细胞提取物与FPP保温，用乙酸乙酯抽提，并通过GC检测角鲨烯。具体地说，混合0.1M Tris/HClpH7(Xμl)，0.1M DTT(2μl)，0.1M MgCl2(10μl)，0.1M NADPH(4μl)，1mg/mlFPP(6μl)和无细胞提取物(7000×g上清液)(Yμl)，其中X＋Y＝178μl以使总体积为200ul。于37℃，在玻璃管中保温此混合物40分钟，然后用0.15ml乙酸乙酯进行抽提。将提取物转移至塑料管中，15,000×g下离心5分钟。使用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。
表4显示出突变体MBNA1-1，MBNA1-9，MBNA1-13和ATCC菌株64031和28383的角鲨烯合酶水平。野生型菌株28383的角鲨烯合酶活性为每mg蛋白质每分钟形成0.12μg角鲨烯。其它4个菌株的活性水平低于此分析试验的可测限。预期MBNA1-1，MBNA1-9和64031具有降低的角鲨烯合酶水平，因为它们已被鉴定为部分-受阻断的突变体，可产生法尼醇和少量麦角固醇。MBNA1-13是生产法尼醇的突变体，不添加固醇即无法生长，因此预期该阻断突变体不具有可测水平的角鲨烯合酶。用较高浓度的无细胞提取物和较长的保温时间重新分析这些菌株的提取物。在任何突变体中再次未检测到角鲨烯合酶。
表4 菌株 角鲨烯合酶分析(μg/min×mg蛋白质) MBNA1-1 未检测到 MBNA1-9 未检测到 MBNA1-13 未检测到 ATCC64031 未检测到 ATCC28383 0.12
对法尼醇-生产菌株(MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13)及其亲代菌株28283进行酶分析。比较乙酰乙酰CoA硫解酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA还原酶，FPP合酶和磷酸酶的酶水平。按上述制备无细胞提取物。
为了进行FPP合酶分析，混合0.1M DTT(2μl)，0.1M MgCl2(2μl)，1mg/mlIPP(6μl)，1mg/ml GPP(6μl)，无细胞提取物(Yμl)和0.1M Tris/HCl(pH7.0)(Xμl)，其中X＋Y＝84μl，于37℃保温15分钟。然后用0.3ml己烷抽提该混合物2次以除去预先存在的法尼醇。接着，加入0.1ml 2×甘油缓冲液(0.2M甘油，2mM MgCl2，2mM ZnCl2)，pH10.4和33单位碱性磷酸酶，于37℃保温混合物1小时。用0.1ml乙酸乙酯抽提混合物，用硫酸钠干燥。通过GC测定法尼醇。每次分析中需包括无-磷酸酶的对照。
HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA与NADPH反应形成甲羟戊酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和CoA(见图1)。为了进行这些分析，按上述制备无细胞提取物，不同的是用7,000×g而不是15,000×g离心破碎的细胞悬浮液。反应之后，通过高效液相层析(HPLC)监测HMG-CoA的消耗。为了进行此分析，于37℃将含有0.1M Na2H2P2O7，pH6.5，2mM DTT，1mM NADPH，0.4mM HMG-CoA和无细胞提取物(提取物的体积有所不同，通过补加0.1MNa2H2P2O7，pH6.5以达到0.1ml的反应平衡)的反应混合物(终体积为0.1ml)保温15分钟。使用0％溶剂B梯度1分钟，接着使用0-11％B梯度42分钟以上，通过HPLC(Luna C18，Phenomenex)反相柱监测反应。溶剂A是86∶14(v/v)40mM磷酸钾(pH6.0)/甲醇。溶剂B是甲醇。检测波长为260nm。
HMG-CoA合酶将乙酰乙酰CoA和乙酰CoA转变为HMG-CoA和CoA。通过HPLC分析监测HMG-CoA的产生。为了进行此分析，混合0.1MNa2H2P2O7，pH6.5(Xμl)，20mM乙酰乙酰CoA(4μl)，20mM乙酰CoA(2μl)和无细胞提取物(Yμl)，其中X＋Y＝94μl(总体积为100μl)，并于37℃保温5分钟。然后将反应混合物加热至60℃达5分钟以灭活酶，接着在小型离心机中全速离心5分钟。通过HPLC分析上清液。
乙酰乙酰CoA硫解酶催化可逆反应，在正向上，乙酰CoA的两个分子反应形成乙酰乙酰CoA和CoA。通过HPLC分析监测乙酰CoA的形成(反向反应)。为了进行此分析，混合0.1M Na2H2P2O7，pH6.5(Xμl)，20mM乙酰乙酰CoA(2μl)，20mM CoA(3μl)和无细胞提取物(Yμl)，其中X＋Y＝95μl(总体积为100μl)，并于37℃保温5分钟。然后在Microcon-10(Amicon)离心机中离心反应混合物以将酶和产物分开。通过HPLC分析上清液。
磷酸酶分析试验通过测定p-硝基苯酚的形成(400nm处增加的光吸收值)来定量磷酸酶活性。为了进行磷酸酶分析，混合0.1M Tris-HCl，pH7(Xμl)，1mM MgCl2(2μl)，50mM p-硝基苯基磷酸酯(10μl)和无细胞提取物(Yμl)，其中X＋Y＝1ml，并于37℃保温15分钟，然后测定400nm处的光吸收值。
表5显示出这4个菌株中5种酶的水平。在所有这些菌株中，乙酰乙酰CoA硫解酶的水平差不多。突变菌株中的HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶水平约高2至3倍。突变体中的FPP合酶水平等同于或低于28383中的FPP合酶水平。相对于亲代菌株而言，突变菌株中的磷酸酶水平提高3至4倍。由于所有这些菌株都是通过经典的诱变方法分离得到的，这些菌株中除了存在erg9突变之外，可能还存在其它突变。
表5 MBNA1-1 MBNA1-9 MBNA1-13 ATCC28383乙酰乙酰CoA硫解酶(nmolAcCoA/min×mg蛋白质) 2.4×102 2.7×102 1.6×102 2.0×102HMG-CoA合酶(nmolHMG-CoA/min×mg蛋白质) 5.7 7.2 7.1 2.7HMG-CoA还原酶(nmolCoA/min×mg蛋白质) 0.35 0.55 0.36 0.15FPP合酶(nmol法尼醇/min×mg蛋白质) 1.3 2.0 1.6 2.2普通的磷酸酶(nmol p-硝基 82 83 91 24苯酚/min×mg蛋白质)
E.ERG9基因分析
根据Sherman等所述方法(Sherman，F.，G.R.Fink和J.B.Hicks，1989，酵母遗传学方法，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，制备菌株ATCC 28383，MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13的染色体DNA。用限制性酶ApaI和NsiI消化基因组DNA，使用生物素化的ERG9 DNA片段为探针进行Southern印迹分析。ERG9探针由2044bp ERG9 DNA片段组成，该片段是用ApaI和NsiI消化质粒pTWM103之后从琼脂糖凝胶中分离得到的。pTWM103由ERG9基因和侧翼序列组成，所述侧翼序列从GenBank登记号为#U00030的序列的第#10916位延伸至#13868位。使用下列两个寡核苷酸，通过聚合酶链反应(PCR)扩增ERG9基因和侧翼区以构建该质粒：
5’-寡核苷酸＝VE107-5 CTC AGT ACG CTG GTA CCC GTC AC(本文称之为SEQ ID NO：1)
3’-寡核苷酸＝VE105-3 gat gga TCC CAA TAT GTG TAG CTC AGG(本文称之为SEQ ID NO：2)
大写字母表示得自ERG9侧翼区的DNA序列，而小写字母表示为了产生限制性位点而添加的碱基。VE107-5含有GenBank登记号为#U00030的序列的第#10905位至#10928位的序列。VE105-3含有第#13868位至#13847位序列的反向互补序列。
扩增条件如下：
模板DNA是分离自菌株S288C(酵母基因保藏中心，Berkeley，CA)的基因组DNA。
2分钟，94℃/1个循环
1分钟，94℃；1分钟，52℃；1.5分钟，74℃/30个循环
5分钟，74℃/1个循环
用KpnI和BamHI消化由此PCR反应产生的2969bp ERG9 DNA，然后连接至经KpnI和BamHI消化的YEp352中，产生质粒pTWM103。YEp352是酵母/大肠杆菌穿梭质粒(Hill，J.E.，Myers，A.M.，Koerner，T.J.，和Tzagaloff,A，1986，具有多个唯一限制性位点的酵母/大肠杆菌穿梭载体，酵母2：163-167)。
通过用ApaI和NsiI消化pTWM103，并纯化含有ERG9基因和侧翼序列的2044bp片段即可得到上述ERG9探针的DNA。然后使用随机引物延伸(NEBlot Phototope Kit，New England BioLabs，Beverly，MA)使ERG9 DNA生物素化。
使约1μg生物素化的ERG9探针与菌株ATCC 28383，MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13经ApaI和NsiI消化的基因组DNA进行Southern印迹杂交。印迹揭示出所有4个菌株均含有位于2044bp片段上的单个杂交序列。
为了从这4个菌株中克隆ERG9基因，再次用ApaI和NsiI消化各菌株的基因组DNA。用ApaI和PstI(NsiI和PstI具有相容的粘性末端)消化酵母/大肠杆菌穿梭载体pRS315(Sikorski，R.S和P.Hieter，1989，为了在酿酒酵母中进行有效的DNA操作而设计的穿梭载体系统和酵母宿主菌株，遗传学，122：19-27)。在琼脂糖凝胶上分离经消化的DNA，从凝胶上切下大小范围约为1.6kb至约3kb的染色体DNA片段以及对应于经消化的pRS316的3895bp带，使用GeneClean(BIO101公司，Visa，CA)进行纯化。将经纯化的得自4个菌株的基因组DNA片段各与pRS316连接，并转化至大肠杆菌。使用上述ERG9探针进行菌落杂交以鉴定出含有pRS316/ERG9克隆的转化子。按照此方法分离这4个菌株各自的ERG9克隆。使用Applied Biosystems公司生产的ABI 100型DNA自动测序仪，通过ACGT公司，Northbrook，IL对得自各菌株的克隆ERG9基因进行测序。
得自ATCC 28383的ERG9基因序列与GenBank中登录的序列(登记号为#U00030)相同。我们发现得自MBNA1-2和MBNA1-9的erg9基因具有相同的突变，即GenBank登记号为#U00030的序列的第#12386位的G变为A，使得TGG密码子变为TGA终止密码子。从而导致ERG9蛋白在第237位氨基酸处终止，而在野生型ERG9蛋白中，正常的终止位置为第444位氨基酸处。
我们还发现MBNA1-13的erg9基因在GenBank登记号为#U00030的序列的第#12017位缺失了一个C，导致移码，使ERG9蛋白早早地在第116位氨基酸处终止，且最后两个氨基酸不同于野生型ERG9蛋白(移码所致)。MBNA1-1和MBNA1-9的erg9等位基因保留了低水平的活性。通过用携有得自MBNA1-1和MBNA1-9的突变erg9基因的质粒转化需要麦角固醇的erg9缺失突变体可以测定该活性。erg9缺失菌株中克隆基因的存在使得这些转化子能在缺乏麦角固醇的培养基上生长，尽管生长较为缓慢。当通过此方法进行检测时，得自MBNA1-13的erg9等位基因未显示出任何残留的活性。当用得自ATCC 28383的ERG9等位基因转化时，erg9缺失菌株以野生型的水平生长。
F.第二突变的描述
在需氧条件下，酿酒酵母一般不会从其环境中摄入麦角固醇。然而，当添加麦角固醇或胆固醇时，分离的erg9突变体能在需氧条件下生长，因此，必须进行第二次突变以在需氧条件下摄取固醇。分离麦角固醇途径突变体，如erg9突变体MBNA1-13所用的方法不仅包括选择麦角固醇途径突变体，还包括选择在需氧条件下能摄入固醇的细胞，因为只有固醇途径基因和固醇摄取基因都具有突变的突变体才能存活。
在下文实施例3中，描述了尝试通过分子生物学方法得到erg9敲除突变时，即使在携有upc2突变的菌株中，所遇到的困难，据报道该菌株可以在需氧条件下摄取固醇(Lewis，T，L.，G.A.Keesler，G.P.Fenner和L.W.Parks，1988，酿酒酵母中影响固醇摄取和代谢的多效突变，酵母，4：93-106)。在erg9突变体中，upc2突变似乎不能赋予有效的需氧固醇摄取，实施例3中所述菌株(以低频率)获得了其它自发突变，这些突变可以使菌株在需氧条件下摄取固醇的能力得到改善。
在另一个野生型菌株中进行适当突变以增强麦角固醇和胆固醇的需氧摄取，可以使我们以相对于非-固醇摄取突变菌株而言高得多的频率分离到该菌株中的erg9突变。为了阐明erg9突变菌株MBNA 1-13(以及该菌株的衍生物)已获得能增强需氧条件下的固醇摄取的突变(称为固醇摄取增强或sue突变)，需比较在MBNA 1-13背景(含有固醇摄取突变)中产生erg9敲除的频率和在ATCC28383亲代背景(可能缺乏固醇摄取突变)中得到erg9敲除突变的频率。用下面两个各代表一个菌株背景的菌株进行所述比较。SWE23-ΔHE9(ura3，his3，sue)衍生自MBNA1-13，含有经修复的ERG9基因。SWY5-ΔH1(ura3，his3)是衍生自菌株ATCC28383的营养缺陷型突变体。SWE23-ΔHE9和SWY5-ΔH1的构建详细描述于下文中的G部分。由于SWE23-ΔHE9衍生自MBNA1-13，该菌株用作携带sue突变的宿主，而衍生自ATCC28383的SWY5-ΔH用作不具有sue突变的宿主。用BamHI和XmaI消化pKML19-41(实施例3中所述质粒构建体)并纯化所得的2.1kb片段，得到erg9Δ∷HIS3 DNA片段，用等量(约1μg)的该DNA片段转化上述两个菌株，使用LiAc转化法(Gietz，R.D.，R.H.Schiestl，A.R.Willems和R.A.Woods，1995，有关通过LiAc/SS-DNA/PEG法转化完整酵母细胞的研究，酵母11：355-360)，用上述2.1kb片段转化细胞，在SCE-ura培养基上选择转化子。SCE培养基含有0.67％细菌用酵母氮基(不含氨基酸)，2％葡萄糖，20mg/l腺嘌呤硫酸酯，20mg/l尿嘧啶，20mg/l L-色氨酸，20mg/l L-组氨酸，20mg/l L-精氨酸，20mg/l L-甲硫氨酸，30mg/l L-酪氨酸，30mg/l L-亮氨酸，30mg/l L-异亮氨酸，30mg/l L-赖氨酸，50mg/l L-苯丙氨酸，100mg/ L-谷氨酸，100mg/l L-天冬氨酸，150mg/l L-缬氨酸，200mg/l L-苏氨酸，400mg/l L-丝氨酸和5mg/l麦角固醇。对琼脂平板而言，需在SCE培养基中加入2％细菌用琼脂。SCE-ura培养基是缺乏尿嘧啶的SCE。
转化SWY5-ΔH1总共得到24个HIS+菌落，而转化SWE23-ΔHE9得到401个HIS+菌落。由于erg9Δ∷HIS3基因可以整合至除ERG9基因座以外的基因座(因此可以使细胞仍为麦角固醇原养型)，通过铺于YPD培养基(缺乏麦角固醇)上来检测每类各20个转化子对麦角固醇的需求。衍生自SWY5-ΔH的所有20个HIS+菌落能在YPD上生长，这表明它们仍含有功能性的ERG9基因，并暗示erg9Δ∷HIS3基因未整合至ERG9基因座。另一方面，衍生自SWE23-ΔHE9的20个HIS+菌落无一能在YPD上生长，这表明erg9Δ∷HIS3DNA已以相对较高的频率取代了该菌株背景中的野生型ERG9基因。为了证实这一点，通过PCR分析各个菌株的9个HIS+菌落，以测定其基因组中存在的ERG9等位基因的类型。按Sherman等(1989)所述制备基因组DNA。用于分析的寡核苷酸如下：
5’寡核苷酸＝250UpBam gcgcatCCACGGGCTATATAAA(SEQ ID NO：3)
3’寡核苷酸＝1764 LoBam gcggatCCTATTATGTAAGTACTTAG(SEQ IDNO：4)
PCR条件如下：
94℃，3分钟。
94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，3分钟；30个循环。
72℃，7分钟。
寡核苷酸250UpBam含有对应于GenBank登记号为#J05091的序列的第#11555位至#11570位的序列。寡核苷酸1764 LoBam含有相同GenBank序列中的第#13049位至#13068位序列的反向互补序列。在SWE23-ΔHE9的所有9个HIS+转化子中，PCR产物为2.1kbp，这表明ERG9基因已被erg9Δ∷HIS3基因取代。在SWY5-ΔH1的9个HIS+转化子中，8个PCR产物为2.1kbp和1.5kbp，这表明野生型ERG9基因保持完整，erg9Δ∷HIS3DNA已整合至基因组的其它位置。第9个HIS+转化子仅显示出1.4kbp PCR产物，这也表明此菌株中的ERG9基因是完整的。在这种情况下，据信HIS3基因已整合至基因组中，而未同时携带所有erg9序列。
这些结果表明在分离菌株MBNA1-13的过程中，菌株中产生了一个额外突变，本文称之为sue。根据下文实施例3所述结果，sue突变似乎不同于以前报道的upc2突变，它能使菌株更有效地摄取固醇。
G.由MBNA1-13衍生新菌株
为了使用erg9突变菌株MBNA1-13进行分子遗传学操作，可对菌株进行进一步的改造以使其携有适于此目的的营养缺陷标记。使用标准方法，用甲磺酸乙酯诱变MBNA1-13，通过将经诱变的细胞铺于含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上即可得到抗5-FOA的突变体。5-FOA选择的应用描述于Sikorski和Boeke，1991(Sikorski，R.S和Boeke，J.D.，1991，体外诱变和质粒改组：从克隆的基因到突变的酵母，酶学方法，194：302-318)。该筛选方法可以分离含有URA3基因突变的菌株，所述基因编码的是乳清苷-5’-磷酸脱羧酶。分离几个表现出5-FOA抗性(即ura-表型)的抗性菌株。为了测定这些菌株中的哪一个特别地在URA3基因中含有突变，使用LiOAc转化法(Gietz等，1995)，用含有完整URA3基因的pRS316(Sikorski和Hieter，1989)转化ura-菌株。鉴定出几个菌株，它们在缺乏尿嘧啶的培养基上原本无法生长，但pRS316恢复了它们的生长能力，这表明所述菌株携有ura3突变。选择这些菌株中的一个，即EMS9-23(ura3，erg9)作进一步的修饰。
使用Sikorski和Hieter(1989)所述基因置换型质粒和Rothstein(1991)所述pop-in/pop-out基因取代法(Rothstein，R.，1991，靶向，破坏，取代和等位基因获救：酵母中的整合DNA转化，酶学方法，194：281-301)，对菌株EMS9-23进行基因改造以使其leu2，trp1或his3基因含有缺失。衍生自MBNA1-13的leu2，trp1和his3突变体分别被称为SWE23-ΔL1，SWE23-ΔT1和SWE23-ΔH1。进一步对菌株SWE23-ΔH1进行改造以使原先的erg9移码突变(见E部分)与erg9Δ∷HIS3等位基因发生交换。通过用约5μg含有erg9Δ∷HIS3盒(erg9Δ∷HIS3盒的构建详细描述于实施例3)的线性DNA片段转化SWE23-ΔH1(使用LiOAc转化法)即可实现这一目的。通过用BamHI和XmaI消化pKML19-40并纯化含有erg9Δ∷HIS3片段的2.1kbp DNA片段即可得到erg9Δ∷HIS3盒。通过将转化子铺于缺乏组氨酸的SCE培养基上，选择出erg9移码等位基因已被erg9Δ∷HIS3等位基因取代的SWE23-ΔH1转化子。将所得的一个菌株称为SWE23-ΔE91。
进一步修饰菌株SWE23-ΔH1以便其leu2和trp1基因含有突变。使用基因置换型质粒(Sikorski和Hieter，1989)和上述pop-in/pop-out基因取代法(Rothstein，R.，1991)导入这些突变。将所得的一个菌株称为SW23-ΔH1#42，其含有erg9，ura3，his3，leu2，trp1和sue突变。进一步修饰菌株SW23-ΔH1#42以使原先的erg9移码突变与erg9D∷HIS3等位基因发生交换。通过用约5μg含有上述erg9D∷HIS3盒的线性DNA片段转化SW23-ΔH1#42(使用LiOAc转化法)即可实现这一目的。在SCE-his培养基上选择出erg9移码突变已被erg9D∷HIS3等位基因取代的HIS+转化子。将所得的一个菌株称为SW23B，该菌株的下列基因携有突变：ura3，leu2，trp1，his3，erg9∷HIS3，sue。
衍生自MBNA1-13的菌株及其各自在摇瓶培养中生产法尼醇的情况概述于表6。在YPDE培养基中将菌株培养过夜(30℃，以180rpm振荡)。使用这些培养物接种250ml烧瓶中的25ml YPDE培养基，使得起初的OD600为0.05，于30℃将细胞培养72小时(以180rpm振荡)。按上文C部分所述，分析全部肉汤(即细胞加上培养基)样品的细胞干重和法尼醇含量。
表6衍生自MBNA1-13的菌株的生长和法尼醇生产情况 菌株 基因型 法尼醇 (％细胞干重) MBNA1-13 erg9，sue 7.9 EMS9-23 erg9，ura3，sue 8.0 SWE23-ΔH1 erg9，ura3，his3-Δ200，sue 7.9 SWE23-ΔL1 erg9，ura3，leu2-Δ1，sue 9.3 SWE23-ΔT1 erg9，ura3，trp1-Δ63，sue 10.8 SWE23-ΔE91 erg9Δ∷His3，ura3，his3，sue 8.0
使用下文H部分所述方法，进一步评价菌株MBNA1-13，EMS9-23和SWE23-ΔE91在1升发酵罐中的生长和法尼醇生产状况。用含有克隆的URA3基因的质粒YEp352分别转化EMS9-23和SWE23-ΔE91。这样就无需在这两个菌株的发酵培养基中加入尿嘧啶。图4和表7概述了这些发酵的结果。类似地进行有关MBNA1-13和EMS9-23/YEp352的实验。尽管SWE23-ΔE91/YEp352的生长滞后于其它两个菌株，但它也能达到与其它两个菌株差不多的细胞密度和法尼醇生产水平。
表7在1升发酵罐中比较MBNA1-13及其衍生菌株 菌株/质粒 时间 (小时) 细胞干重 (g/l) 法尼醇 g/l (％细胞干重) MBNA1-13 191 40.8 2.25 5.5 EMS9-23/YEp352 191 42.6 2.46 5.8 SWE23-ΔE91/YEp352 239 37.2 2.23 6.0
将菌株EMS9-23和SWE23-ΔH1的erg9突变回复至野生型功能以对其进行进一步的操作。通过用约5μg含有完整ERG9基因的DNA片段转化这两个菌株(使用LiOAc转化法)即可实现此目的。通过用SacI和BamHI消化pTWM103(见上文E部分)并纯化含有ERG9基因的2.5kb DNA片段即可得到ERG9基因DNA片段。通过选择能在缺乏麦角固醇的YPD培养基上生长的细胞，从各菌株中得到EMS9-23和SWE23-ΔH1的转化子，其中erg9移码突变已被野生型ERG9基因取代。选择衍生自EMS9-23的一个erg9-修复菌株(被称为SWE23-E9)和衍生自SWE23-ΔH1的一个erg9-修复菌株(被称为SWE23-ΔHE9)进行进一步研究。在分开的实验中，将营养缺陷突变导入亲代菌株ATCC28383。按上述在含有5-FOA的培养基上平铺细胞之后，得到ATCC28383的ura3自发突变体。用pRS316(如上述)转化抗5-FOA的突变体，鉴定已特定地在其URA3基因上自发获得突变的菌株。一个菌株(SWY5)表现出稳定的ura-表型(低回复突变频率)，选择该菌株进行进一步研究。使用Sikorski和Hieter(Sikorski和Hieter(1989))所述基因置换型质粒YRp14/his3-Δ200和Rothstein(Rothstein(1991))所述pop-in/pop-out基因取代法进一步对SWY5进行改造以使其携有his3突变。衍生自SWY5的一个his3突变体被称为SWY5-ΔH，选择该菌株进行进一步研究。
表8列出了上述经修复的和营养缺陷型的菌株及其基因型。
表8与ATCC28383和MBNA1-13相关的修复型和营养缺陷型菌株 菌株 基因型 亲代SWE-E9 ura3，sue EMS9-23 SWE23-ΔHE9 ura3，his3，sue SWE23ΔH1 SWY5 ura3 ATCC 28383 SWY5-ΔH ura3，his SWY5
为了检测erg9突变的MBNA1-13是否在其分离过程中获得了任何其它的营养需求，在摇瓶中进行生长实验以比较亲代菌株ATCC28383，erg9突变菌株EMS9-23和erg9-修复菌株SWE23-E9。于30℃，以180rpm在YPD培养基中振荡培养培养物。还在EMS9-23培养物中添加5mg/l麦角固醇。通过OD600监测生长。
该实验的结果示于图5，显示出erg9突变体的生长降低，但野生型亲代菌株28383和erg9-修复菌株SWE23-E9的生长情况类似。SWE23-E9培养物中最终的OD600稍低可能是由于该菌株是尿嘧啶营养缺陷型，而YPD培养基中的尿嘧啶浓度不是最适浓度的缘故。这些结果表明erg9突变体生长缺陷的主要原因是erg9突变自身。 erg9突变体中的其它突变，如sue突变对生长没有显著影响。
H.1升发酵
按下文所述，在1升发酵罐中，在补料分批条件下培养菌株MBNA1-13，EMS9-23/YEp352和SWE23-ΔE91/YEp352。在这些条件下，在191至239小时内，这些菌株产生的法尼醇占细胞干重的5.5-6.0％(数据示于上文G部分)。
发酵条件和原料：
首先于121℃在发酵罐中将下列溶液高压灭菌45分钟以进行1升发酵：
(NH4)2SO4 10.0g/l
KH2PO4 10.0g/l
CaCl2-2H2O 0.5g/l
NaCl 0.5g/l
MgSO4-7H2O 3.0g/l
酵母提取物(Difco) 2.0g/l
盐溶液 20.0ml
消泡剂(Dow 1520) 4.0滴
去离子水 500ml
高压灭菌之后，加入下列无菌溶液：
葡萄糖溶液(50％，w/v) 5.0ml
维生素溶液 15.0ml
麦角固醇溶液 0.2ml
通过流经0.45微米的滤器对葡萄糖和维生素溶液进行灭菌。麦角固醇溶液被认为是无菌的(见下文)。
葡萄糖补料溶液(制备于去离子水中)：
葡萄糖溶液(60％，w/v) 360ml
酵母提取物溶液(12.5％，w/v) 80ml
麦角固醇溶液 5.8ml
对葡萄糖，酵母提取物进行高压灭菌；麦角固醇被认为是无菌的。
接种物
将1ml冷冻于10％甘油中的细胞悬浮液接种于1000ml带挡板烧瓶内的250ml YPDE培养基中，于29℃，以150rpm保温48小时；每个发酵罐使用30ml接种物。
发酵条件
28℃
pH4.5
振荡300-1000rpm，按需要通气50-200ml/min以使溶解氧维持为空气饱和度的10-60％。当最初的葡萄糖耗尽之后，加入葡萄糖补料溶液。考虑到利用葡萄糖的细胞产量为0.25，添加速率应使生长速率为0.04hr-1。最大补料速率＝3.5ml/hr。
盐溶液(每升去离子水中的量)
FeSO4-7H2O 0.28g
ZnSO4-7H2O 0.29g
CuSO4-5H2O 0.08g
Na2MoO4-2H2O 0.24g
CoCl2-6H2O 0.24g
MnSO4-H2O 0.17g
HCl 0.10ml
维生素溶液(每升去离子水中的量)
生物素 10mg
泛酸钙 120mg
肌醇 600mg
盐酸吡哆醇 120mg
盐酸硫胺素 120mg
麦角固醇溶液
乙醇 20ml
IGEPAL 20ml
麦角固醇 0.4g
于50℃混合加热直至溶解，储存于-20℃。IGEPAL是1，3，3四甲基丁基苯氧基(乙氧基)8乙醇(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO，ProductIGEPAL CA-630，目录号为#I3021)。
实施例2
本实施例描述了使用甲磺酸乙酯(EMS)化学诱变酿酒酵母菌株64031从而产生erg9突变体。菌株64031(得自ATCC)是erg9-1突变体，它可产生低水平的法尼醇(见实施例1)，进一步诱变产生了表现出改良法尼醇产量的突变体。
使用EMS绘制杀伤曲线，按实施例1所述诱变64031，也按实施例1所述进行选择。
我们发现总共有163个菌株为制霉菌素抗性，ts，固醇营养缺陷型。在试管和摇瓶中培养这些菌株，按实施例1所述测定法尼醇的产量。摇瓶培养所生产的法尼醇的量示于表9。
表9 菌株 法尼醇(mg/ml) 法尼醇(％干重) 细胞 培养基 细胞提取物 培养基提取物 MBEMS8-1 0.038 0.019 1.7 0.8 MBEMS8-2 0.048 0.008 3.6 0.6 MBEMS8-5 0.013 0.022 0.5 1.0 MBEMS8-6 0.045 0.016 5.6 2.0 MBEMS8-11 0.024 0.003 2.0 0.2 MBEMS8-12 0.043 0.006 6.9 1.0 MBEMS8-16 0.026 0.001 3.5 0.2 MBEMS8-18 0.040 0.009 1.4 0.3 MBEMS8-19 0.023 0.003 2.8 0.4 MBEMS8-21 0.021 0.009 1.5 0.7 MBEMS8-23 0.025 0.008 2.9 0.9 MBEMS8-25 0.018 0.007 1.3 0.5 MBEMS8-26 0.028 0.011 3.7 1.5 MBEMS8-27 0.035 0.010 5.5 1.5 MBEMS8-31 0.020 0.011 1.1 0.6 MBEMS8-32 0.016 0.009 0.5 0.3 MBEMS8-33 0.000 0.000 0 0 MBEMS8-34 0.000 0.000 0 0 MBEMS8-35 0.000 0.000 0 0 ATCC64031 0.018 0.005 0.9 0.3 ATCC28383 0.000 0.000 0 0
实施例3
在上文实施例1.G.中，描述了MBNA1-13的erg9Δ∷HIS3突变体的产生。在此实施例中，描述了其它单倍体酿酒酵母菌株(不是衍生自MBNA1-13)的构建，所述菌株含有erg9缺失∷HIS3插入等位基因。
使用(根据Sherman等的方法)分离自菌株S288C的基因组DNA为模板和下列两个引物PCR扩增ERG9基因：
5’寡核苷酸＝gag cat CCA CGG GCT ATA TAAA(SEQ ID NO：5)；250BamUp
3’寡核苷酸＝tcc ccc cg GGC GCA GAC TTC ACG CTC(SEQ ID NO：6)；1712XmaLo
用BamHI和XmaI消化经PCR扩增的ERG9 DNA，然后连接于经BamHI和XmaI消化pRS316(酵母/大肠杆菌穿梭载体，Sikorski和Hieter，1989)。
PCR条件如下：
94℃，1分钟；1个循环
94℃，30秒；58℃，1分钟；72℃，1分钟；30个循环
72℃，2分钟；1个循环
按此方法克隆的ERG9基因从GenBank登记号为#U00030的序列的第#11555位延伸至第#13047位，所得克隆被称为pJMB98-12。按下述构建ERG9中的缺失和HIS3 DNA中的插入：
通过用Eco47III和SspI消化含有HIS3的质粒pRS403(Stratagene，LaJolla，CA)并纯化含有HIS3基因的1226bp片段即可得到HIS3基因。
用Van91I消化质粒pJMB98-12，然后用T4 DNA聚合酶处理以使其成为平端。进一步用HpaI消化质粒以使ERG9内的一个内部589bp片段缺失。在此位点连接含有HIS3基因的1226bp Eeo47III，SspI片段。所得质粒pKML19-41在缺失的ERG9基因内克隆了HIS3基因，HIS3编码序列的方向与ERG9编码序列的方向相同。
为了用此erg9Δ∷HIS3 DNA转化酵母，用SmaI和XbaI消化质粒pKML19-41，分离含有erg9Δ∷HIS3基因的2141bp片段。使用GeneClean从琼脂糖凝胶切片中纯化DNA。
使用Gietz等(1995)所述醋酸锂转化法，用约5μg纯化的erg9Δ∷HIS3DNA转化二倍体菌株CJ3A×CJ3B(a/α，ura3/ura3，his3/his3，leu2/leu2，trp1/trp1，upc2/upc2，得自N.C.州立大学，Raleigh，NC的L.Parks博士)。CJ3A×CJ3B中的upc2突变是纯合的。该突变使菌株能在需氧条件下摄取固醇(Lewis等，1988)。据信upc2突变会使携有erg9基因突变的单倍体菌株易于产生。选择携有含功能性HIS3基因之质粒的菌株必须选择菌株的组氨酸营养缺陷型。
将经转化的细胞铺于缺乏组氨酸的SCE培养基(实施例1.F.所述)(SC-His)以选择HIS+转化子。
得到几百个转化子。然后将这些HIS+细胞铺于SC-His，培养两天以上。然后将转化子铺于孢子形成培养基(Sherman等，1986)上。孢子形成培养基含有(每升蒸馏水中的量)：1％醋酸钾，0.1％细菌用酵母提取物，0.05％葡萄糖和2％细菌用琼脂。然后将菌块培养3至5天使其形成孢子。取出部分细胞，置于溶细胞酶溶液中以消化子囊细胞壁。然后将细胞划细线铺于YPD+2mg/l麦角固醇(YPDE)平板上。形成孢子的二倍体细胞形成含有4个孢子的四联体，使用显微操作器分离各个孢子。各个单倍体孢子将会萌发，各含有单拷贝的染色体。
在此菌株中，对erg9Δ∷HIS3敲除而言，预期的分离比为2∶2。两个孢子应该在YPD上存活，因为它们含有未被破坏的染色体拷贝(这意味着它们无需麦角固醇，因为它们具有起作用的ERG9基因，它们也能在YPD上生长，因为培养基中存在组氨酸)。其它两个孢子应该能在SC-His+2mg/l麦角固醇(SCE-His)上生长，因为如果erg9Δ∷ HIS3 DNA整合至ERG9位点，细胞将需要麦角固醇，但能在缺乏组氨酸时生长。
分析一些pKML19-41转化子的四联体以测定erg9敲除的表型。结果表明：需氧生长时，4个孢子中仅有2个可以存活。将这些孢子影印铺板于YPD时，这两个孢子存活，但它们不能在SC-His或SCE-His上存活。这表明分离比为2∶2，这两个存活孢子为亲代型或组氨酸营养缺陷型。不能在需氧条件下存活的两个孢子可能含有erg9Δ∷HIS3敲除。
PCR分析证实了几个菌株中的erg9Δ∷HIS3敲除结果。使用快速DNA分离法从几个显示出2∶2分离比的二倍体转化子中分离总DNA。然后将总DNA用作PCR扩增的模板，PCR所用引物与染色体ERG9基因的5’和3’序列互补。
此分析所用寡核苷酸如下：
5’-寡核苷酸＝250 Bam Up(如上述)
3’-寡核苷酸＝3ERG9-1＝gat ccg cg GCT CAA GCT AGC GGT ATT ATGCC(SEQ ID NO：7)
3ERG9-1含有的序列反向互补于GenBank登记号为#U00030的序列中第#14812位至第#14790位的序列。
寡核苷酸250 Bam UP位于构建erg9Δ∷HIS3等位基因所用ERG9克隆的序列内，而寡核苷酸3ERG9-1位于克隆的ERG9 DNA边界序列的下游。由这两个引物从基因组DNA中扩增的ERG9序列必须代表位于实际的染色体ERG9基因座的ERG9基因，而不扩增整合至其它染色体位置的erg9Δ∷HIS3序列。
结果显示出3.271和3.908kb处的两条带，表明双倍体菌株中存在ERG9基因的一个功能性拷贝和一个间断拷贝，后者由于HIS3基因插入而比前者大637bp。
进行Southern印迹分析以进一步证实二倍体中的erg9Δ∷HIS3间断。将得自携有两个正常的ERG9基因拷贝的亲代二倍体菌株的基因组DNA与3个不同的转化子进行比较，据信所述转化子携有一个正常的ERG9基因和一个被破坏的ERG9基因。用AccI或XbaI消化DNA，通过凝胶电泳分离，转移至Immobilon S膜上，用特异性探针与之杂交以检查是否存在ERG9基因。此时的探针是含有部分ERG9基因的1.4kb片段。
基因组DNA的Southern印迹分析所用的探针制备自使用寡核苷酸250Bam Up和1712Xma Lo(见上文)PCR扩增的ERG9基因。将质粒pJMB98-12用作模板。PCR条件如下：
94℃，1分钟；1个循环
94℃，30秒；58℃，1分钟；72℃，1分钟；30个循环
72℃，2分钟；1个循环
如上所述纯化扩增的ERG9 DNA，并使其生物素化。使用约1μg生物素化的探针与印迹杂交。
在严紧条件下使探针与特定的DNA带杂交鉴定出互补序列的存在。对亲代二倍体CJ3AxCJ3B而言，用AccI消化后在2.1kb处有一条带出现，用XbaI消化后在2.8kb处有一条带出现。推定的erg9Δ∷HIS3敲除各含有两条带：用AccI消化，在2.1kb和1.3kb处出现带；用XbaI消化，在2.8kb和3.4kb处出现带。这些结果表明经转化的二倍体中存在1拷贝野生型ERG9基因以及一个erg9Δ∷HIS3破坏。
然后尝试在YPDE琼脂上厌氧培养单倍体细胞。麦角固醇途径被阻断的菌株可在厌氧条件下摄取固醇。两个孢子在厌氧条件下快速生长(ERG9，his-)，两个孢子生长很缓慢(erg9Δ∷HIS3)。在厌氧条件下，在液体培养基中厌氧培养能在平板上厌氧生长的3个菌株erg9Δ∷ HIS3(KML505，KML510和KML521)的孢子，它们显示出法尼醇生产。接着，需氧保温最初的YPDE平板，厌氧生长时被检测为法尼醇生产阳性的几个单倍体菌株能够生长。延长需氧保温时间之后，产生3个这种存活孢子(得自KML505)。这些需氧生长的菌株被称为BKY1-2D，BKY1-7C和BKY1-8D，它们都能在需氧条件下生产法尼醇。
亲代菌株KML510(a/α，ura3/ura3，his3/his3，trp1/trp1，leu2/leu2，upc2/upc2，ERG9/erg9Δ∷HIS3)含有pJMB98-12或pRS316，使其形成孢子，将四联体分割于YPDE平板上。在需氧条件下保温平板，观察到下列孢子生长模式。
用20个四联体进行KML510/pJMB98-12的四联体分析。16个四联体产生2个存活的，快速生长的孢子和2个不能存活的孢子。所有存活的孢子是his-，erg+。3个四联体产生2个存活的，快速生长的孢子，1个存活的，生长缓慢的孢子和1个不能存活的孢子。存活的，快速生长的孢子都是his-，erg+。存活的，缓慢生长的孢子都是his+，erg-。1个四联体不产生任何存活的孢子。所有his+，erg-孢子也是ura-，这表明pJMB98-12在减数分裂的过程中未分离成这些孢子。将1个his+，erg-孢子用于进一步研究，并将其称为BTY19-9C。
用20个四联体进行KML510/pRS316的四联体分析。18个四联体产生2个存活的，快速生长的孢子和2个不能存活的孢子。2个四联体产生2个存活的，快速生长的孢子，1个存活的，生长缓慢的孢子和1个不能存活的孢子。所有快速生长的孢子都是his-，erg+。所有缓慢生长的孢子都是his+，erg-。所有his+，erg-孢子也是ura-，这表明pRS316在减数分裂的过程中未分离成这些孢子。将1个his+，erg-孢子用于进一步研究，并将其称为BTY20-2A。
为了证实BTY19-9C和BTY20-2A不携带野生型ERG9基因，使用分离自这两个菌株的基因组DNA，和寡核苷酸VE104-5和VE105-3进行PCR实验。
5’寡核苷酸＝VE104-5＝gac tct AGA AGC GGA AAA CGT ATA CAC
3’寡核苷酸＝VE105-3＝上文所述
VE104-5含有对应于GenBank登记号为#U00030的序列的第#11631位至116541位的序列。
功能性ERG9基因的推测PCR产物大小为2.23kb，对erg9Δ∷HIS3破坏而言为2.87kb。菌株BTY19-9C和BTY20-2A的PCR产物约为2.87kb，这表明存在erg9Δ∷HIS3破坏。
在摇瓶中评价5个菌株(BKY1-2D，BKY1-7C，BKY1-8D，BTY19-9C和BTY20-2A)的法尼醇生产情况。在5个菌株中，菌株BKY1-7C和BTY20-2A的法尼醇生产情况最好，但BKY1-7C生长很缓慢。
将转化子KML505，KML510和KML521转移至孢子形成培养基中。将四联体分割至YPDE上，在需氧条件下培养延长的一段时间以寻找超出预期的2∶2分离比(存活∶不存活)的其它孢子的生长。在需氧条件下进一步保温之后，另外2个孢子存活。这两个菌株BJY7-5D和BJY8-1A在试管筛选中产生法尼醇。
在摇瓶中评价菌株BJY7-5D和BJY8-1A。保温72小时之后，BJY8-1A生产法尼醇的情况最好(0.29mg/ml，占细胞干重的4.7％)。BJY7-5D给出0.18mg法尼醇/ml(占细胞干重的3.5％)。
实施例4
本实施例显示了含有和不含功能性ERG9基因的菌株中HMG CoA还原酶的过量表达。
据认为，HMG CoA还原酶是调节类异戊二烯途径的碳流动的关键酶。在酿酒酵母中，两个基因HMG1和HMG2编码HMG CoA还原酶的两个同工酶(被称为HMG1p和HMG2p)。通过联合使用转录和翻译调节以及蛋白质降解即可调节HMG CoA还原酶。编码HMG1p和HMG2p同工酶催化结构域的HMG1和HMG2基因区段已被克隆于强启动子的转录控制之下，所述启动子得自GPD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因。含有这些构建体的质粒(pRH127-3和pRH124-31，分别含有HMG1p和HMG2p的催化结构域)得自R.Hampton，U.C.San Diego。据报道，过量表达HMG1p催化结构域的酿酒酵母菌株的类异戊二烯途径碳流量提高。经证实，增加的碳流量为角鲨烯和麦角固醇过量产生(Donald，K.A.G.，Hampton，R. Y和Fritz，I.B，1997，在酿酒酵母中过量产生3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的催化结构域对角鲨烯合成的影响，应用和环境微生物学，63：3341-3344)。
A.在含有功能性ERG9基因的菌株中过量表达HMG CoA还原酶
为了证实与酿酒酵母的其它菌株类似(Donald等，1997)，在衍生自ATCC28383的菌株中过量表达HMG CoA还原酶也会导致类异戊二烯途径的碳流量增加，用质粒pRH127-3和pRH124-31转化菌株SWY5(亲代菌株ATCC28383的ura3突变体)和SWE23-E9(EMS9-23的erg9修复菌株，描述于上文实施例1.G.)。使用LiOAc法(Gietz等，1995)进行转化。同时构建携有空载体YEp352的对照菌株。在摇瓶实验中检测代表性转化子的角鲨烯和麦角固醇生产情况。于30℃，在50ml SCE-ura培养基中，以180rpm的转速振荡培养细胞48小时。在第24小时时，取出10ml培养物，按实施例1.D.所述收集细胞，进行HMG CoA还原酶分析试验。在48小时的生长期结束时，使用培养物等分试样接种含有50ml YPD培养基的烧瓶，以使培养物的起始OD600为0.1。于30℃，在YPD培养基中，以180rpm的转速将培养物振荡培养72小时，然后分析细胞干重，角鲨烯和麦角固醇的积累。此分析所用的提取方法如下。以1,500×g离心10分钟以沉淀10ml培养物。将细胞沉淀物重新悬浮于1ml去离子水中，重新沉淀细胞。将细胞沉淀物重新悬浮于1ml去离子水中，用硅酸锆珠(直径为0.5mm)振荡破碎细胞。于75℃用2.5ml 0.2％的连苯三酚的甲醇溶液和1.25ml 60％氢氧化钾溶液将破碎的细胞悬浮液皂化1.5小时。然后用5ml己烷抽提样品，涡旋3分钟，以1,000×g离心20分钟以分离相。然后按实施例1.B.所述通过GC-MS分析己烷层。
该实验的数据示于表10。相对于仅携有Yep352载体的对照菌株而言，过量表达HMG1p或HMG2p催化结构域的菌株含有高水平的HMG CoA还原酶活性和升高水平的角鲨烯。然而，过量表达HMG1p或HMG2p的菌株都不含水平显著增加的麦角固醇。然而，这些数据表明MBNA1-13菌株谱系中HMG CoA还原酶活性的增加增加了类异戊二烯途径的碳流量。
表10.在具有正常类异戊二烯途径的菌株中，HMG CoA
还原酶活性的增加对角鲨烯和麦角固醇生产的影响 菌株/质粒 细胞干 重(g/l) 角鲨烯 麦角固醇 还原酶活性 (nmol/min/mg) μg/ml ％干重 μg/ml ％干重 SWY5/YEp352 7.68 0.18 0.003 2.9 0.038 2.4 SWY5/pRH127-3 6.82 3.50 0.051 5.2 0.076 52 SWY5/pRH124-31 7.49 4.15 0.055 2.9 0.039 27 SWE23-E9/YEp352 6.96 0.33 0.005 5.5 0.079 2.7 SWE23-E9/pRH127-3 6.89 6.78 0.099 6.3 0.121 55 SWE23-E9/pRH124-31 6.90 4.90 0.071 6.1 0.088 29
B.erg9突变体中HMG CoA还原酶的过量表达
已证明HMG1p或HMG2p的增加可使流向角鲨烯的碳增加，检测携有erg9突变的菌株中HMG1或HMG2的过量表达是否能增加法尼醇产量。用质粒pRH127-3或pRH124-31转化菌株SWE23-ΔE91(描述于实施例1.G.)。使用LiOAc转化法(Gietz等，1995)进行SWE23-ΔE91的转化。在每次转化中使用约2.5μgpRH127-3或pRH124-31 DNA。在SCE-ura平板上选择转化子，选出几个转化子，在SCE-ura平板上重新划线以进行纯化。为了检测HMGCoA还原酶的增加对法尼醇生产的影响，在液体SCE-ura培养基中将代表性的转化子培养48小时。实验中也包括对照菌株SWE23-ΔE91/YEp352。在48小时的生长期结束时，使用培养物等分试样接种含有50ml YPDE培养基的烧瓶，以使培养物的起始OD600为0.5。于30℃，以180rpm的转速将培养物振荡培养72小时。在保温期结束时，分析样品的细胞干重和法尼醇浓度。为了证实转化子过量表达了HMG CoA还原酶基因，以1,500×g离心10分钟以收集20ml在SCE-ura中生长的培养物，使用实施例1.D.所述透化细胞法测定HMG CoA还原酶活性。此实验的数据示于表11。
表11.在摇瓶培养中生长的erg9∷HIS3突变体中
HMG CoA还原酶活性的增加对法尼醇生产的影响 菌株/质粒 细胞干重 (g/l) 法尼醇 还原酶活性 (nmol/min/mg) SWE23-ΔE91/YEp352 3.31 222 6.7 7.5 SWE23-ΔE91/pRH127-3 3.87 104 2.7 47.0 SWE23-ΔE91/pRH124-31 3.48 104 3.0 36.0
在SWE23-ΔE91/pRH127-3和SWE23-ΔE91/pRH124-31中，HMG CoA还原酶活性水平都有所提高。然而，这些菌株中的法尼醇产量低于对照菌株SWE23-ΔE91/Yep352。在独立的实验中几次观察到这一出人意料的结果。
尽管在摇瓶培养中生长的erg9∷HIS3菌株的HMG CoA还原酶活性的增加不能提高法尼醇产量，使用实施例1.H.所述方法，在1升发酵罐中检测表12所列菌株的法尼醇生产情况。在这些情况下，观察到预期的结果；相对于对照菌株而言，过量表达HMG CoA还原酶的菌株产生显著更多的法尼醇。数据概述于图6和表12。使用透化细胞法进行直接酶分析，进一步证实菌株SWE23-ΔE91/pRH127-3和SWE23-ΔE91/pRH124-31中HMG CoA还原酶活性的提高。通过发酵过程中特定时间点的还原酶活性可阐明这一点(如表12所示)。
表12.在1升发酵罐中生长的erg9∷HIS3突变体中
HMG CoA还原酶活性的增加对法尼醇生产的影响 菌株/质粒 时间 小时) 细胞干重 (g/l) 法尼醇 还原酶活性 (nmol/min/mg) g/l ％细胞干重 SWE23-ΔE91/YEp352 239 37.2 2.23 6.0 4.1 SWE23-ΔE91/pRH127-3 310 35.0 3.05 8.7 20 SWE23-ΔE91/pRH124-31 261 31.7 3.05 9.6 14
实施例5
本实施例描述了erg9突变体中多种GGPP合酶的过量表达。
为了将erg9突变菌株产生的FPP转变为GGPP(所需产物GG的前体)，需过量表达编码erg9突变体中多种GGPP合酶的基因。为此目的而克隆的基因是酿酒酵母的BTS1基因，如噬夏孢欧文氏菌的crtE基因，粗糙链孢霉的a1-3基因和稻恶苗赤霉的ggs基因。按下述构建携有这些基因的质粒。
为了克隆BTSI1基因，根据Sherman等(1986)所述方法，制备酿酒酵母菌株S288C的基因组DNA。使用下列两个寡核苷酸，经PCR扩增基因。
5’寡核苷酸＝VE100-5 gactctAGAGTTTACGAGTCTGGAAAATC(SEQID NO：8)
3’寡核苷酸＝VE101-3 gtaggATCCATGGAATTGAGCAATAGAG(SEQID NO：9)
PCR条件是：94℃，3分钟；94℃，1分钟；52℃，1分钟；74℃，1.5分钟；30个循环；然后74℃，7分钟(1个循环)。用XbaI和BamHI消化PCR产物，连接至经XbaI和BamHI消化的pPGK315得到pTWM101。质粒pPGK315含有被多个克隆位点分开的酿酒酵母PGK启动子和终止子。按上述将BTS1基因克隆至pPGK315，使BTS1基因置于强的PGK启动子的控制之下。用SacII和SmaI消化质粒pPGK315，然后用T4 DNA聚合酶处理以产生平端，籍此构建质粒pPGK315。重新连接质粒，产生pRS315-DSS。然后用XhoI消化质粒pRS315-DSS，并与994bp SalI，XhoI片段连接，所述片段得自质粒pPGKMCS，其含有被多个克隆位点分开的PGK启动子和终止子。用EcoRI和BamHI消化pPGK(Kang等，1990，分子细胞生物学，10：2582)，然后与下列两个退火的寡核苷酸连接即可构建质粒pPGKMCS。
5’寡核苷酸＝AATTCCAAGCTTGCGGCCGCTCTAGAACGCGTG(SEQID NO：10)
3’寡核苷酸＝GATCCACGCGTTCTAGAGCGGCCGCAAGCTTG(SEQID NO：11)
通过将含有PGK启动子/BTS1/PGK终止子的2397bp KpnI-SalI片段(通过用KpnI和SalI消化pTWM110得到的片段)连接至经KpnI-SalI消化的YEp352，构建出质粒pTWM110-11。
为了克隆crtE基因，使用PureGene基因组DNA分离试剂盒(GentraSystems公司，Minneapolis，MN)，从如噬夏孢欧文氏菌菌株2OD3中分离基因组DNA。使用基因组DNA和下列两个寡核苷酸扩增crtE基因。
5’寡核苷酸＝20D3Up gaattcGTTTATAAGGACAGCCCGA(SEQ IDNO：12)
3’寡核苷酸＝20D3Lo ctgcagTCCTTAACTGACGGCAGCGA(SEQ IDNO：13)
寡核苷酸20D3Up含有对应于Genbank登记号为#D90087的序列的第#206位至第#224位的序列。寡核苷酸20D3Lo含有相同Genbank序列的第#1117位至第#1136位序列的反向互补序列。将扩增的DNA连接至pCR-Script SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)的SrfI位点，产生质粒pSW1-B。然后用EcoRI和SacI消化该质粒，纯化含有crtE基因的973bp片段，连接至经EcoRI和SacI消化的pAD314-956，产生质粒pSW2B。用BamHI消化质粒pSW2B，产生含有ADH1启动子，crtE编码序列和ADH1终止子的2199bp片段，将此片段连接至经BamHI消化的YEp352，产生pSW4A(将crtE基因置于与该质粒中的URA3基因相反的方向)和pSW4B(将crtE基因置于与URA3基因相同的方向)。
按下列方法产生质粒pADH313-956。用SacI和XbaI消化质粒pRS313(Sikorski和Hieter，1989)，用T4 DNA聚合酶处理以产生平端，然后重新连接产生质粒pDSX313。用SmaI和ApaI消化该质粒，用T4 DNA聚合酶处理产生平端，然后重新连接产生pDSXSA313。用HindIII消化质粒pAAH5(Ammerer，G.，1983，酶学方法，101：192-201)，该质粒携有被HindIII位点分开的ADH1启动子和终止子，然后与下列两个退火的寡核苷酸连接以导入多克隆位点并产生pAAH5-MCS。
5’寡核苷酸＝MCS1 AGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA(SEQ ID NO：14)
3’寡核苷酸＝MCS2 AGCTTGCATGCCTCCAGGTCGACTCTAGAGCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC(SEQ ID NO：15)
以pADH313-MCS为模板，并使用下列两个寡核苷酸进行PCR反应，得到1232bp PCR产物，其含有ADH1启动子，多克隆位点和ADH1终止子。
5’寡核苷酸＝ADH1A gacggatCCGTGGAATATTTCGGATATCC(SEQID NO：16)
3’寡核苷酸＝ADH1B ctcggatccGGACGGATTACAACAGGTATTGTCC(SEQ ID NO：17)
寡核苷酸ADH1A含有对应于Genbank登记号为#V01292的序列的第#16位至第#37位的序列。寡核苷酸ADH1B含有相同Genbank序列的第#2092位至第#2116位序列的反向互补序列。用BamHI消化1232bp PCR产物，连接至经BamHI消化的pDSXSA313，产生质粒pADH313-956。
为了克隆N.crassa a1-3基因，使用Borges等在真菌基因保藏中心网站(WWW.kumc.edu/research/fgsc/fgn37/borges.html)的方法部分所述方法，从粗糙链孢霉菌株ATCC 14692中分离基因组DNA。使用下列两个寡核苷酸通过PCR扩增基因。
5’寡核苷酸＝VE118-5 cagaatTCACCATGGCCGTGACTTCCTCCTC(SEQ ID NO：18)
3’寡核苷酸＝VE119-3 caagatctCATACATTCAATCCTCATGGACAC(SEQ ID NO：19)
寡核苷酸VE118-5含有对应于Genbank登记号为#U20940的序列的第#1216位至第#1240位的序列。寡核苷酸VE119-3含有相同Genbank序列的第#2576位至第#2599位序列的反向互补序列。将扩增的DNA连接至pCR-Script SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)的SrfI位点，产生pSW7-1和pSW7-2(a1-3基因的两个独立的PCR克隆)。然后用EcoRI和BglII消化这两个质粒，纯化含有a1-3基因的1393bp片段，并连接至经EcoRI，BamHI消化的pPGK(Kang等，1990)，产生pSW9-1和pSW9-2，它们中的a1-3序列分别衍生自pSW7-1和pSW7-2。
为了克隆ggs基因，使用与上述链孢霉相同的方法，从稻恶苗赤霉菌株ATCC 12617中制备基因组DNA。使用下列两个寡核苷酸经PCR扩增ggs基因。
5’寡核苷酸＝VE120-5 gagaattCTTAACACGCATGATCCCCACGGC(SEQ ID NO：20)
3’寡核苷酸＝VE121-3 ctggatcCGTCAAATCCGTGAATCGTAACGAG(SEQ ID NO：21)
寡核苷酸VE120-5含有对应于Genbank登记号为#X96943的序列的第#607位至第#630位的序列。寡核苷酸VE121-3含有相同Genbank序列的第#1908位至第#1932位序列的反向互补序列。将扩增的DNA连接至pCR-Script SK(+)的SrfI位点，产生pSW8-1和pSW8-2(ggs基因的两个独立的PCR克隆)。然后用EcoRI和BamHI消化这两个质粒，纯化含有ggs基因的1335bp片段，并连接至经EcoRI，BamHI消化的pPGK，产生pSW10-1和pSW10-2，它们中的ggs序列分别衍生自pSW8-1和pSW8-2。
使用LiOAc法，用上述质粒转化菌株EMS9-23(ura3，erg9，描述于实施例1.G.)，在SCE-ura平板上选择转化子。挑选转化子并在SCE-ura平板上重新划线以进行纯化。检测代表性转化子的GG生产。于30℃在液体SCE-ura培养基中培养菌株48小时，然后用于接种含有YPDE培养基的烧瓶以使最初的OD600为0.5。于30℃振荡培养这些培养物达72小时，分析细胞干重，法尼醇和GG水平。第二套烧瓶含有20ml SCE-ura培养基，用相同的起始培养物接种并培养48小时。收集这些烧瓶中的细胞，用10ml 50mM双Tris丙烷缓冲液，pH7.0洗涤并重新沉淀。然后使用细胞沉淀物制备透化细胞悬浮液以分析GGPP合酶。通过将细胞重新悬浮于1ml含有0.1％Triton X100的50mM双Tris丙烷缓冲液，pH7.0而使细胞透化，于80℃冷东细胞待用。融化之后，使用透化细胞进行GGPP合酶分析。GGPP合酶分析混合物含有50mM双Tris丙烷缓冲液，pH7.0(Xμl)，0.1M二硫苏糖醇(1μl)，1mg/mlFPP(5μl)，1mg/ml IPP(5μl)和透化细胞(Yμl)，其中X＋Y＝87μl。分析中还包括对照反应，其中不含FPP和IPP。于37℃保温分析混合物20分钟。加入0.1ml 2×甘氨酸缓冲液(0.2M甘氨酸，2mM MgCl2，2mM ZnCl2，pH10.4)和63个单位的碱性磷酸酶(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)，于37℃保温混合物60分钟。然后用0.2ml 1∶1已烷∶乙酸乙酯抽提混合物，并通过GC/MS分析GG。GGPP合酶活性被表示为所形成GGPP的nmol数/min/mg蛋白质。
菌株的细胞干重，法尼醇产量，GG产量和GGPP合酶活性概述于表13。缺乏克隆的GGPP合酶的对照菌株EMS923/YEp352产生8.7％法尼醇(根据细胞干重)，并且基本上不产生GG。过量表达不同的克隆GGPP合酶的4个其它菌株产生与对照大致相同量的法尼醇(8.0-9.74％)，并产生水平为0.62-1.73％的GG。
表13.过量表达4个不同的克隆化GGPP合酶基因
的菌株在摇瓶培养中的GG产量 菌株 克隆的 GGPP 合酶基因 细胞干 重(g/l) FOH(％细 胞干重) GC(％细 胞干重) GGPP 合酶活性 (nmol/min/mg) EMS9-23/YEp352 - 3.38 8.7 0.01 ND EMS9-23/pTWM110-11 BST1 3.12 8.98 1.73 0.065 EMS9-23/pSW4B CrtE 2.02 9.74 1.68 0.094 EMS9-23/pSW9-1 Al3 3.38 8.0 0.62 0.032 EMS9-23/pSW10-2 ggs 3.16 9.3 1.0 0.03
在1升发酵罐中进一步评价GGPP合酶活性的增加对GG生产的影响。用携有克隆的酿酒酵母BTS1基因的质粒pTWM110-11转化菌株EMS9-23。用YEp352(对照载体)或pSW4A-3(质粒pSW4A的一个分离物，携有克隆的crtE基因)转化菌株SWE23-ΔE91(描述于上文实施例1.G.)。使用实施例1H.所述方法，在1升发酵罐中培养菌株SWE23-ΔE91/YEp352，EMS9-23/pTWM110-11和SWE23-ΔE91/pSW4A-3，比较生长，法尼醇生产和GG生产。
结果示于图7和表14。3个菌株的生长类似。菌株SWE23-ΔE91/YEp352在236小时内产生2.32g/l法尼醇，但未产生任何可测的GG。EMS9-23/pTWM110-11在239小时内产生2.1g/l法尼醇，在相同的时间内也产生0.42g/lGG。菌株SWE23-ΔE91/pSW4A-3在236小时内产生2.47g/l法尼醇，在相同的时间内也产生0.59g/l GG。对照菌株中的GGPP合酶活性低于可测限。菌株EMS9-23/pTWM110-11和SWE23-ΔE91/pSW4A-3的GG生产与增加的GGPP合酶活性相关。
表14.在1升发酵罐中培养的过量表达GGPP合酶
之菌株的生长，及其法尼醇和GG生产 菌株/质粒 时间 (小时) 细胞干 重(g/l) 法尼醇 GG GGPP合酶活性 (nmol/min/mg) g/l ％细胞 干重 g/l ％细胞 干重SWE23ΔE91/YEp352 236 43.9 2.32 5.3 0 0 未检测到EMS9-23/pTWM110-11 239 41.9 2.10 5.0 0.42 1.0 0.2SWE23-ΔE91/ 236 43.5 2.47 5.7 0.59 1.4 1.1 pSW4A-3
实施例6
本实施例阐明了编码FPP合酶的ERG20基因的过量表达的影响。
为了测定erg9突变体中FPP合酶水平提高的影响，克隆编码酿酒酵母FPP合酶的ERG20基因以进行过量表达。使用酿酒酵母菌株S288C的基因组DNA(根据Sherman等，1986所述方法制备)和下列两个寡核苷酸，经PCR扩增ERG20基因。
5’寡核苷酸＝BamFPPUp ggccggatccATATTACGTAGAAATGGCTTCAG(SEQ ID NO：22)
3’寡核苷酸＝XhoFPPLo gccgctcgagGGTCCTTATCTAGTTTG(SEQ IDNO：23)
寡核苷酸BamFPPUp含有对应于Genbank登记号为#J05091的序列的第#790位至第#810位的序列。寡核苷酸XhoFPPLo含有相同Genbank序列的第#1891位至第#1907位序列的反向互补序列。用BamHI和XhoI消化PCR产物，连接至含有酿酒酵母GPD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子和PGK终止子的载体中。通过用BamHI和Sa1I消化含有酿酒酵母HMG2基因之催化结构域(克隆于GPD启动子和PGK终止子之间)的质粒，即pRH124-31(描述于实施例4)以除去HMG2 DNA即可得到启动子/终止子载体。纯化对应于启动子/终止子载体的6.3kb带，连接至含有ERG20的1129bp片段，产生pJMB19-31和pJMB19-32。使用LiOAc法，用质粒pJMB19-31和pJMB19-32转化菌株SWE23-ΔE91(ura3，his3，erg9Δ∷HIS3)，在SCE-ura平板上选择转化子。挑选转化子，在SCE-ura平板上重新划线以进行纯化。
为了测定erg9突变菌株中FPP合酶过量表达的影响，摇瓶培养按上述构建的代表性转化子，并比较生长，法尼醇生产，GG生产和FPP合酶和GGPP合酶活性。于30℃在液体SCE-ura培养基中振荡培养菌株48小时，然后用于接种含有YPDE培养基的烧瓶以使最初的OD600为0.5。于30℃振荡培养这些培养物达72小时，分析细胞干重，法尼醇和GG水平。第二套烧瓶含有20ml SCE-ura培养基，用相同的起始培养物接种并培养48小时。收集这些烧瓶中的细胞，用10ml 50mM双Tris丙烷缓冲液，pH7.0洗涤并重新沉淀。然后使用细胞沉淀物制备透化细胞悬浮液以分析FPP和GGPP合酶。通过将细胞重新悬浮于1ml含有0.1％Triton X100的50mM双Tris丙烷缓冲液，pH7.0而使细胞透化，于80℃冷冻细胞待用。融化之后，使用透化细胞进行分析。GGPP合酶分析混合物与实施例5所述相同。FPP合酶分析混合物含有50mM双Tris丙烷缓冲液，pH7.0(Xμl)，0.1M二硫苏糖醇(1μl)，0.5M MgCl2(2μl)，1mg/ml IPP(6μl)，1mg/ml香叶基二磷酸酯(GPP)(6μl)和透化细胞(Yμl)，其中X＋Y＝85μl。分析中还包括对照反应，其中不含IPP和GPP。于37℃保温分析混合物15分钟。加入0.1ml 2×甘氨酸缓冲液(0.2M甘氨酸，2mM MgCl2，2mM ZnCl2，pH10.4)和63个单位的碱性磷酸酶(SigmaChemical公司，St.Louis，MO)，于37℃保温混合物60分钟。然后用0.2ml1∶1己烷∶乙酸乙酯抽提混合物，并通过GC/MS分析法尼醇。FPP合酶活性被表示为所形成FPP的nmol数/min/mg蛋白质。
表15所示的数据表明这些摇瓶培养物中FPP合酶的过量表达不会增加法尼醇的产量，但却出人意料地增加了GG产量。SWE23-ΔE91/pJMB19-31或SWE23-ΔE91/pJMB19-32产生的GG水平甚至高于过量表达酿酒酵母BTS1(GGPP合酶)基因的菌株(EMS923/pTWM110-11)所产生的GG水平。
表15.过量表达FPP合酶和GGPP合酶的erg9突变体中的GG生产 菌株/质粒 克隆的基因 (所编码的 酶) 细胞干 重(g/l) FOH (％细胞 干重) GG (％细胞 干重) FPP和酶活性(nmol/min /mg) GGPP和酶 活性(nmol/ min/mg)EMS9-23/YEp352 3.32 9.24 0.17 2.3未检测到EMS9-23/pTWM110-11 BTS1(GGPP 合酶) 3.12 8.98 1.73 未检测到0.19SWE23-ΔE-91/pJMB19-31 ERG20(FPP 合酶) 3.11 7.85 2.28 53.0未检测到SWE23-ΔE-91/pJMB19-32 ERG20(FPP 合酶) 3.28 8.08 2.29 51.0未检测到
在1升发酵罐中进一步评价FPP合酶活性的增加对GG生产的影响。使用实施例1.H.所述方法，在1升发酵罐中培养菌株SWE23-ΔE91/YEp352(对照)，EMS9-23/pSW4A3(crtE，GGPP合酶)和SWE23-ΔE91/pJMB19-32(ERG20，FPP合酶)，比较生长，法尼醇生产，GG生产和GGPP合酶活性(图8和表16)。这3个菌株的生长类似，但SWE23-ΔE91/pJMB19-32在以类似于其它菌株的速率生长之前有些滞后。菌株SWE23-ΔE91/YEp352在258小时内产生2.31g/l法尼醇，但未产生任何可测的GG。EMS9-23/pSW4A3在258小时内产生2.52g/l法尼醇和0.57g/lGG。菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32在258小时内产生1.95g/l法尼醇，也在相同时间内产生0.59g/lGG。SWE23-ΔE91/pJMB19-32中出人意料的GG产量与该菌株中增加的GGPP合酶活性相关(见下文)。
在对照菌株SWE23-ΔE91/YEp352中未检测到GGPP合酶活性。表达噬夏孢欧文氏菌crtE(GGPP合酶)基因的菌株EMS9-23/pSW4A3显示出相对较高的GGPP合酶活性(在从258-小时时间点起的细胞中为1.7hmol/min/mg)。如所预期的，过量表达酿酒酵母FPP合酶的菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32含有的FPP合酶活性在发酵过程中的所有时间点都比仅具有正常FPP合酶水平的对照菌株高10倍以上(数据未显示)。然而，奇怪的是，菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32也具有升高的GGPP合酶活性(表16)。毫无疑问，该活性是该菌株之所以能出人意料地产生GG的原因所在。
菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32中检测到的升高的GGPP合酶活性是过量表达能诱导GGPP合酶活性的FPP合酶(BTS1基因产物)的结果。然而，该菌株显示出FPP合酶也可能有一些低水平的GGPP合酶活性，这是FPP合酶高水平过量表达的结果。
表16.FPP合酶增加对1-L发酵罐中
生长菌株的生长，及其法尼醇和GG生产的影响 菌株/质粒 时间 (小时) 细胞干 重(g/L) 法尼醇 GG GGPP合酶活性 (nmol/min/mg) g/L ％细胞 干重 g/L ％细胞 干重SWE23-ΔE91/YEp352 258 42.2 2.31 5.5 0 0 未检测到EMS9-23/pSW4A3 258 44.3 2.52 5.3 0.57 1.28 1.7SWE23-ΔE91/pJMB19-32 258 41.1 1.95 4.7 0.55 1.34 1.0
实施例7
本实施例评价几种法尼醇提取工艺。
在第一个实验中，将MBNA1-13(法尼醇生产菌株)和ATCC 28383(麦角固醇生产菌株)的全肉汤(细胞加培养基)提取以及细胞沉淀物和培养基在各种条件下分开提取(见实施例1)进行对比。基本如实施例1所述提取10ml培养物样品，但如下表17中所标明的进行一些改变。表17中的方法1与实施例1中所述提取方法相同。已经发现，对于法尼醇提取，在方法1，2，3，5和7中全肉汤提取与细胞和培养基分开提取一样有效。通过方法5提取的法尼醇最多，该方法在提取全肉汤之前，将2ml 0.2％连苯三酚的甲醇溶液加入己烷中。第二高的提取是方法1。
表17 提取方法 0.2％连苯三酚 的甲醇溶液60％的KOH dH2O溶液 保温75°，1.5 小时 己烷 1 2ml 1ml 是 5ml 2 2ml 1ml 不是 5ml 3 2ml 0 是 5ml 4 0 1ml 是 5ml 5 2ml 0 不是 5ml 6 0 1ml 不是 5ml 7 0 0 不是 5ml
随后，进行实验以测定各类提取溶剂的效果(方法1，全肉汤)，提取所用的时间(方法1，己烷提取，全肉汤)，和提取前所加甲醇的量(方法1，己烷提取，全肉汤)。结果在下面表17-19中给出。
表17 溶剂 法尼醇(ng) 己烷 3273 氯仿 2262 乙酸乙酯 3549 正庚烷 3560 十六碳烷 未测定* 十二碳烷 3529 甲苯 1055 四氯化碳 2023 异丁醇 2892 1-辛醇 1814*溶剂峰与法尼醇一起洗脱，使法尼醇不能用此法定量测定。
表18 涡旋时间(min) 法尼醇(ng) 0 204 0.25 2794 0.5 2691 1.0 2894 1.5 3302 2.0 3348 2.5 3357 3.0 3545 3.5 3535
表19 甲醇体积(ml) 法尼醇(ng) 0 3440 0.2 2820 0.4 3000 0.6 3440 0.8 3690 1.0 3730 1.2 4580 1.4 4350 1.6 4020 1.8 3880
作进一步的工作使法尼醇的提取工艺最优化并简化，且与从发酵肉汤提取GG的工艺相适应。该工作产生下述最终提取方案。
1.以未稀释或用水适当地稀释至2.0ml的最终体积，在15ml带特氟龙帽的玻璃试管中使用整个发酵肉汤。
2.加入2.0ml己烷。
3.加入2.0ml甲醇。
4.将试管以高速涡旋3.5分钟。
5.将样品在台式离心机中以2800rpm离心25-30分钟以分离相。
6.分出上清液(有机相)并放入2.0ml带特氟龙帽的玻璃GC/MS管用于通过GC/MS测定法尼醇和GG。
实施例8
下列实施例阐明了HMG CoA还原酶的增加对过量表达GGPP合酶之菌株的GG生产的影响。
在此实验中，构建含有单拷贝质粒的菌株，所述质粒整合至该菌株的基因组中，使细胞过量表达GGPP合酶。已知整合质粒为pSW35-42，该质粒是按下述方法构建的。用BamHI消化质粒pSW4A(见实施例5)，产生含有ADH1启动子，crtE编码序列和ADH1终止子融合物的2199bp片段。然后将该片段连接至经BamHI消化的YIp351(Hill等，1986，具有多个唯一限制性位点的酵母/大肠杆菌穿梭载体，酵母2：163-167)产生pSW35-42。
为了构建含有pSW35-42的菌株，用限制性内切核酸酶BstEII消化该质粒以在LEU2基因内导入单个切割位点。纯化线性化的质粒，使用LiOAc法用该质粒转化菌株SWE23-ΔL1。在缺乏亮氨酸的培养基上选择pSW35-42已整合至LEU2基因座的转化子。所得的一个转化菌株被称为SWE23-ΔL1∷pSW35-42。然后用YEp352(空载体对照，Hill等，1986，酵母2：163-167)或pRH124-31(含有HMG2基因的催化结构域，见实施例4)转化该菌株，分别产生菌株SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352和SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124。菌株SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352过量表达GGPP合酶，而SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124过量表达GGPP合酶和HMG CoA还原酶。
进行菌株SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124和SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352的发酵实验以比较这两个菌株的GG生产情况。使用实施例1.H.中所述方法，在1升发酵罐中检测菌株的GG生产。发酵数据示于表20。该实验表明SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124的发酵比SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352的发酵积累更多的GG，该实验还阐明：相对于HMG CoA还原酶未增加的类似菌株而言，经设计用于生产GG的菌株中HMG CoA还原酶活性的提高导致GG水平进一步的提高。
表20 菌株 细胞干重 ＠192小时 法尼醇 ＠192小时 GG ＠192小时 g/l g/l ％干重 g/l ％干重SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352 41.4 2.04 4.9 0.30 0.72 SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124 44.0 3.27 7.4 0.60 1.36
在相同菌株中过量表达HMG CoA还原酶和GGPP合酶的第二种方法是：将两个基因都克隆至高拷贝数的酵母载体中，将此质粒转化至erg9突变菌株。用于此目的的质粒被称为pSW46-1，其构建方法如下。用EcoRI和SacI消化质粒pSW4A(见实施例5)，纯化含有crtE基因的0.9kb片段并连接至经EcoRI和SacI消化的pADH313-956，产生pSW38-10。通过用限制性酶消化缺失该质粒的两个区域，使用Pfu聚合酶补平DNA末端，连接以重新形成环形质粒。按此方法缺失的区域位于NdeI和SpeI位点之间，和HindIII和PstI位点之间。所得质粒被称为pSW43-5。用BamHI消化质粒pSW43-5，纯化所得的含有ADH1启动子，crtE基因和ADH1终止子的2199bp片段(称为ADHp/crtE/ADHt片段)，连接至YEp352的BamHI位点。所得质粒被称为pSW44-17，它与pSW4A的不同之处是它含有一个而不是两个PstI位点。
用XbaI和PstI消化质粒pRH124-31，将含有GPD启动子，HMG2催化结构域基因和PGK终止子的3.2kb片段(称为GPDp/HMG2cat/PGKt片段)克隆至经XbaI，PstI消化的pSW44-17，产生pSW46-1。该质粒在酵母中复制高拷贝数，并含有HMG2和crtE基因，籍此提供HMG CoA还原酶和GGPP合酶的过量表达。将质粒pSW46-1转化至erg9突变菌株SWE-ΔE91，分离URA+转化子。在摇瓶实验中检测几个所得转化子，并与仅过量表达GGPP合酶的菌株(EMS9-23/pSW4A)相比较。实验结果示于表21，显示出当与仅过量表达GGPP合酶的菌株相比时，过量表达HMGCoA还原酶和GGPP合酶的菌株中积累了较高水平的GG。
表21 菌株 过量表达的基因 细胞干重 GG mg/ml mg/ml ％干重SWE23-ΔE91/YEp352 对照 4.35 0.0007 0.02EMS9-23/pSW4A GGPP合酶 2.82 0.0469 1.66SWE23-ΔE91/pSW46-1GGPP还原酶HMG CoA还原酶 3.45 0.0866 2.45
这些数据支持下列观点，即在能产生提高水平的GG的菌株中过量表达HMG CoA还原酶导致所产生的GG量进一步提高。
实施例9
下列实施例描述了过量表达HMG CoA还原酶的更稳定菌株的产生。
如实施例4所述构建菌株，该菌株中因存在高拷贝数的复制质粒而能过量表达HMG CoA还原酶，其中所述质粒含有HMG1cat或HMG2cat基因。由于复制质粒在细胞分裂过程中频繁丢失，复制质粒的有丝分裂不稳定性最终导致绝大部分培养物细胞中仅含正常水平的HMG CoA还原酶。为了得到更稳定的，过量表达HMG CoA还原酶的菌株，将编码HMG2p催化结构域的多拷贝基因整合至菌株SW23B的基因组中。首先构建能使多拷贝HMG2基因整合至rRNA基因间隔区的质粒即可实现此目的。根据Lopes等，1989所述rRNA整合法(Lopes，T.S.，Klootwijk，J.，Veenstra，A.E.，van der Aar，P.C.，van Heerikhuizen，H.，Raue，H.A.，和Planta，R. J.1989，高拷贝数整合至酿酒酵母的核糖体RNA：用于高水平表达的新载体，基因79：199-206)建立此方法的模型。
使用PCR扩增rRNA基因座的两个区域，它们位于编码35S rRNA之基因和编码5S rRNA之基因之间的基因间隔区，本文称之为rRNA间隔区。用于扩增两个rRNA间隔区片段中的第一个的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#Z73326之序列的碱基#11161至#11130的序列和反向互补于#10311至#10330的序列。寡核苷酸序列如下。小写字母用于表示已改变或被添加以产生限制性内切核酸酶识别位点的碱基，寡核苷酸序列之后的括号中标明了所述位点。
SEQ ID NO：24：
R6XbaI Lo 5’-tctagaGGCACCTGTCACTTTGGAAAAAAAATATACGC-3’(XbaI)
SEQ ID NO：25：
R7SacII Up 5’-ccgcggGCCGGAAATGCTCTCTGTTC-3’(SacII)
使用这两个寡核苷酸经PCR扩增产生的DNA片段在本文被称为R6/R7片段。先将PCR产生的R6/R7片段克隆至质粒pCR-Script以产生pSW48-1，然后通过用XbaI和SacII消化从此质粒中切除该片段，再将所得的759bp片段克隆至经XbaI，SacII消化的pBluescript SK-(Stratagene)，产生pSW49-1。
用于扩增第二个rRNA间隔区片段的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#Z73326之序列的碱基#11247至#11272的序列和反向互补于#12054至#12072的序列。这些寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO：26：
R5Sal UpB 5’-CACgtCgACCATTCAAACTTTACTAC-3’(SalI)
SEQ ID NO：27：
R4ApaI LoB 5’-GAGGGCccGGTCCAGACAT-3’(ApaI)
使用上述两个寡核苷酸经PCR扩增产生的DNA片段在本文被称为R4/R5片段。用ApaI和SalI消化PCR产生的R4/R5片段，连接至经ApaI和SalI消化的pSW49-1，产生pSW52-11。
使用PCR扩增TRP1基因以使基因携有不完整的启动子。不完整的启动子会使TRP1基因的表达降低，籍此提供选择最终表达盒高拷贝数整合的方法。用于扩增TRP1基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#J01374之序列的碱基#53至#73的序列和反向互补#804至#823的序列。所述寡核苷酸序列如下。
SEQ ID NO：28：
TRP1 SmaUp 5’-cccgggTATTGAGCACGTGAGTATACG-3’(SmaI)
SEQ ID NO：29：
TRP1 BamLo 5’-ggatccGGCAAGTGCACAAACAATAC-3’(BamHI)
接着，用BamHI和SmaI消化pSW50-1，纯化所得的779bp TRP1片段。用PstI和SmaI消化质粒pRH124-31，产生3261bp含有GPD启动子，HMG2cat基因和PGK终止子的片段(被称为GPDp/HMG2cat/PGKt片段)，纯化此片段。以三片段连接法将TRP1片段和GPDp/HMG2cat/PGKt片段连接至经PstI，BamHI消化的pSW52-11，产生pSW58-77和pSW58-45。
通过用限制性内切核酸酶KpnI和SacI消化，从pSW58-77上切下含有R6/R7-TRP1-GPDp/HMG2cat/PGKt-R4/R5基因融合物的DNA片段。纯化对应于整合构建体的5671bp片段，并用于转化菌株SW23B。在SCE-trp培养基上选择转化子。筛选按此方法分离的菌株以评价HMG CoA还原酶活性，并通过Southern印迹分析评价HMG2基因拷贝数。鉴定出携有1拷贝整合构建体，2拷贝整合构建体，3拷贝整合构建体和8拷贝整合构建体的菌株，分别称之为SW23B#19，SW23B#31，SW23B#40和SW23B#74。表22给出了通过体外酶分析测定的HMG CoA还原酶比活，和通过Southern印迹测定的HMG cat基因的拷贝数。HMG CoA还原酶分析如前人所述(Quain，D.E和Haslam，J.M.1979，分解代谢产物的脱阻抑对酿酒酵母中的steryl酯的积累和β-羟基甲基戊二酸单酰-CoA还原酶活性的影响，普通微生物学杂志，111：343-351)。
表22 菌株 HMG CoA还原酶 GPDp/HMG2cat/PGKt nmol/min mg 拷贝数/细胞 SW23B 5.26 0 SW23B#19 14.53 1 SW23B#31 37.47 2 SW23B#40 50.33 3 SW23B#76 59.04 8
由于这些菌株具有leu2和ura3突变，它们的生长需要外源添加亮氨酸和尿嘧啶。为了避免在发酵实验的过程中添加这些营养物质，用含有功能性URA3，LEU2和TRP1拷贝的质粒pTWM138转化这些菌株。这些菌株中存在此质粒可使菌株生长无需添加亮氨酸和尿嘧啶。
进行发酵实验以比较这些菌株的法尼醇生产。此实验中也包括菌株SWE23-ΔE91/pRH124-31，它在高拷贝数质粒上含有GPDp/HMG2cat/PGKt融合基因(见实施例4.B.)。使用实施例1.H.所述方法，在1升发酵罐中检测菌株的法尼醇生产，此实验的数据示于表23。
表23 菌株 扩增的基因 发酵时间 细胞干重 法尼醇 拷贝数 小时 g/l g/l ％细胞干重SW23B/pTWM138 对照 216 53.3 3.25 6.10SW23B#19/pTWM138 HMG2 cat 1拷贝 192 52.4 4.58 8.74SW23B#74/pTWM138 HMG2 cat 8拷贝 216 43.5 4.70 10.80SW23B/pRH124-31 HMG2 cat 192 43.8 4.89 11.16＞20拷贝
这些数据支持下列观点，即相对于具有正常水平的HMG CoA还原酶的菌株而言，具有升高水平的HMG CoA还原酶的菌株能生产更多的法尼醇。数据也表明：含有8个HMG2cat基因整合拷贝的菌株产生的法尼醇实质上与携有HMG2cat基因的20个以上染色体外拷贝的菌株(SW23B/pRH124-31)相同。含有单个HMG2cat基因整合拷贝的菌株产生的法尼醇多于对照菌株，但比具有更多HMG2cat基因拷贝的菌株稍低。另外，含有提高的HMG CoA还原酶水平的菌株在培养物中积累了甲羟戊酸，而具有正常水平的HMGCoA还原酶的菌株不能积累甲羟戊酸。这表明一旦HMG CoA还原酶的酶活性提高，HMG CoA还原酶下游的步骤限制了途径中的碳流动(见实施例10)。贯穿该途径的碳流动受限于HMG CoA还原酶下游，导致培养基中甲羟戊酸的积累的一个酶活性。
实施例10
本实施例显示了具有erg9突变和升高水平的HMG CoA还原酶的菌株中多个类异戊二烯途径基因的过量表达的影响。
如实施例4和9所述，HMG CoA还原酶水平的提高导致类异戊二烯/固醇途径碳流量的增加。在含有增加的HMGCoA还原酶的菌株中过量表达其它类异戊二烯途径基因可进一步增加该途径中的碳流量。在具有提高水平的HMG CoA还原酶以及缺损的erg9基因的菌株中，类异戊二烯途径基因的扩增可导致法尼醇水平进一步提高。另外，在具有缺损的erg9基因和提高水平的HMG CoA还原酶和GGPP合酶的菌株中，类异戊二烯途径基因的扩增可导致GG水平进一步提高。
为了验证这些观点，构建质粒以使其过量表达多个类异戊二烯途径基因。一个质粒提供了分别由ERG12，ERG8和ERG19基因编码的甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的过量表达。该质粒被称为pSW77-69，是由得自大量含有单个类异戊二烯途径基因的质粒的DNA片段构建的。以下首先描述那些质粒的构建。
使用PCR扩增ERG12基因以进行克隆。用于扩增ERG12基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#Z49809之序列的碱基#2827至#2846的序列和#5247至#5229的反向互补序列。这两个寡核苷酸的序列如下。小写字母用于表示已改变或被添加以产生限制性内切核酸酶识别位点的碱基，寡核苷酸序列之后的括号中标明了所述位点。
SEQ ID NO：30：
E12.4SN 5’-CCAAATATAACtCGAGCTTTG-3’(XhoI)
SEQ ID NO：31：
E12.SALI3 5’-GCAAAGTcCaCCACCGCAG-3’(SalI)
使用两个寡核苷酸E12.4SN和E12.SALI3和菌株ATCC28383的基因组DNA扩增ERG12基因。将所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位点，产生pSW68。
用于扩增ERG19基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#Z71656之序列的碱基#911至#937的序列和GeneBank登记号为#Z71658之序列的碱基#1930至#1962的反向互补序列。这两个寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO：32：
E19 SMAI 5’-GCCACGTGCCCcCGGGTTTCTCTAGCC-3’(SmaI)
SEQ ID NO：33：
E19 SACI3 5’-GGAAAAGagCtCGATAATTATTGATGATAGATC-3’(SacI)
使用两个寡核苷酸E19 SMAI和E19 SACI3和菌株ATCC28383的基因组DNA扩增ERG19基因。将所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位点，产生pSW69。
用于扩增ERG8基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#Z49939之序列的碱基#2729至#2749的序列和反向互补#5177至#5196的序列。这两个寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO：34：
E8.2135N 5’-CCGTTTTGGATccTAGATCAG-3’(BamHI)
SEQ ID NO：35：
E8SMAI3 5’-gttcccGGGTTATTGTCCTGCATTTG-3’(SmaI)
使用两个寡核苷酸E8.2135N和E8SMAI3和菌株ATCC28383的基因组DNA扩增ERG8基因。将所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位点，产生pSW71。
用BamHI和SmaI消化质粒pSW71，纯化所得的含有ERG8基因的2459bp片段。用SmaI和SacI消化质粒pSW69-3，纯化含有ERG19基因的2239bp片段。用BamHI和SacI消化高拷贝数酵母载体YEp352(含有URA3选择标记)并纯化之。将3个纯化的DNA片段连接在一起，产生pSW76-11。
接着，用SalI和XhoI消化pSW68，纯化所得的含有ERG12基因的2400bp带，并连接至经SalI消化的pSW76-11，产生pSW77-69。该质粒含有ERG12，ERG8和ERG19，提供了甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的过量表达。
另一个质粒提供了甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶和IPP异构酶的过量表达，它们分别由ERG12，ERG8，ERG19和IDI1基因编码。该质粒被称为pSW78-68，其构建方法如下。通过PCR扩增IDI1基因以用于克隆。用于扩增IDI1基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#U43503之序列的碱基#19577至#19604的序列和反向互补#17477至#17502的序列。这两个寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO：36：
ISO SACI5 5’-AAGAGctcATCTGATAATAGATCAAGCG-3’(SacI)
SEQ ID NO：37：
ISO SACI3 5’-AGGAGCTCAACGACAATAAATGGCTG-3’(SacI)
使用两个寡核苷酸ISO SACI5和ISO SACI3和菌株ATCC28383的基因组DNA扩增IDI1基因。将所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位点，产生pSW73。用SacI消化质粒pSW73，将所得的含有IDI1基因的2117bp片段与经SacI消化的pSW77-69连接，产生pSW78-68。该质粒含有ERG12，ERG8，ERG19和IDI1，提供了甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶和IPP异构酶的过量表达。
另一个质粒提供了分别由ERG10和ERG13基因编码的乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG CoA合酶的过量表达。该质粒被称为pSW79-29，其构建方法如下。
使用PCR扩增ERG13和ERG10基因以用于克隆。用于扩增ERG13基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#Z50178之序列的碱基#21104至#21127的反向互补序列和碱基#18270至#18292的序列。这两个寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO：38：
E13 XBAI5 5’-GTCCTctAGATCTTGAATGAAATC-3’(XbaI)
SEQ ID NO：39：
E13 SACI3 5’-CTTTGAGCtcGTACAAGAAGCAG-3’(SacI)
使用两个寡核苷酸E13 XBAI5和E13 SACI3和菌株ATCC 28383的基因组DNA扩增ERG13基因。将所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位点，产生pSW72。
用于扩增ERG10基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#U36624之序列的碱基#4073至#4093的序列和反向互补#6542至#6565的序列。这两个寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO：40：
E10 HIND5 5’-CTAAGCttTGCGCCCGTGAAG-3’(HindIII)
SEQ ID NO：41：
E10 XBAI3-2 5’-GTTCTAGAAGTTTTCAAAGCAGAG-3’(XbaI)
使用两个寡核苷酸E10 HIND5和E10 XBAI3-2和菌株ATCC28383的基因组DNA扩增ERG10基因。将所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位点，产生pSW70。
用XbaI和HindIII消化质粒pSW70，纯化所得的含有ERG10基因的2482bp片段。用XbaI和SacI消化质粒pSW72-4，纯化含有ERG13基因的2850bp片段。然后将两个纯化的DNA片段与经SacI和HindIII消化的YEp351(含有LEU2选择标记)连接在一起，产生pSW79-30。该质粒含有ERG13和ERG10基因，可以过量表达乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG CoA合酶。
用pSW77-69和pSW78-68转化菌株SW23B#74(含有8个HMG2 cat基因整合拷贝，见实施例9)，在SCE-ura培养基上选择转化子。所得菌株分别被称为SW23B#74/pSW77-69和SW23B#74/pSW78-68。因为存在leu2突变，这些菌株的生长需要添加亮氨酸。为了避免在发酵实验的过程中往这些菌株中添加亮氨酸，用含有功能性LEU2基因的线性DNA片段转化这些菌株，分离LEU+转化子。这些菌株分别被称为SW23B#74L/pSW77-69和SW23B#74L/pSW78-68。
用pSW79-30转化菌株SW23B#74，在SCE-leu培养基上选择转化子。因为SW23B#74/pSW79-30存在ura3基因突变，其生长需要添加尿嘧啶。为了避免在发酵实验的过程中往这些菌株中添加尿嘧啶，用含有功能性URA3基因的线性DNA片段转化此菌株，分离URA+转化子。此菌株被称为SW23B#74U/pSW79-30。
用pSW78-68和pSW79-30转化SW23B#74，分离在SCE-ura，-leu培养基上都能生长的转化子，这表明转化子含有这两种质粒。所得菌株被称为SW23B#74/pSW78-68/pSW79-30。
用上述菌株进行发酵实验以检查这些基因的扩增对法尼醇生产的影响。使用实施例1.H.所述方法，在1升发酵罐中检测菌株，这些实验的数据示于表24。
表24 菌株扩增的基因 发酵时间 (小时) 细胞 干重 法尼醇 甲羟戊酸 小时 g/l g/l ％干重 g/l ％干重SW23B#74/pTWM138 215 45.5 4.95 10.88 0.2 0.4SW23B#74L/pSW77-69HMG2cat，ERG8，ERG12，ERG19， 287 41.6 4.67 11.23 0 0SW23B#74L/pSW78-68HMG2cat，ERG8.ERG12，ERG19，IDI1 215 46.4 4.87 10.50 0 0SW23B#74U/pSW79-30HMG2cat，ERG10，ERG13 215 46.1 4.63 10.04 5.4 11.7
这些数据表明过量表达HMG CoA还原酶的菌株在培养基中积累了类异戊二烯途径中间体甲羟戊酸。由于在具有正常水平HMG CoA还原酶的菌株中未观察到甲羟戊酸积累，这说明HMG CoA还原酶的增加使类异戊二烯途径的碳流动增加到一定限度，此时HMG CoA还原酶之后的另一个步骤限制了该途径中间体的转变。另外，类异戊二烯途径前3个酶，即乙酰乙酰CoA硫解酶，HMG CoA合酶和HMG CoA还原酶(分别由ERG13，ERG10和HMG2cat编码)的过量表达甚至导致培养基中积累更多的甲羟戊酸。这表明前3个步骤酶的增加进一步增加了进入类异戊二烯途径的碳流量，更重要的是，HMG CoA还原酶下游的一个酶限制了类异戊二烯途径中间体的转变。由于甲羟戊酸用作法尼醇和GG的前体，可使用上述修饰增加进入类异戊二烯途径的碳流量，如果甲羟戊酸能被更有效地代谢，即可导致增加的法尼醇和GG积累。
关于最后一点，可在过量表达HMGCoA还原酶的菌株中倍增HMGCoA还原酶下游的酶。增加的酶是HMGCoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶和IPP异构酶(分别由HMG2cat，ERG12，ERG8，ERG19和IDI1编码)。与仅过量表达HMG CoA还原酶的菌株相比，这些菌株积累了较少的甲羟戊酸，这说明因HMG CoA还原酶过量表达引起的类异戊二烯途径的碳流量增加是由提高水平的下游酶提供的。尽管在上述实验中未观察到提高的法尼醇水平，这可能是用于转变的甲羟戊酸水平低的缘故。然而，这些数据表明在具有增加水平的前3个途径酶的菌株中，HMG CoA还原酶下游的一个或多个酶的增加可导致法尼醇和GG的积累增加，因为这些菌株中流向甲羟戊酸的碳流量大大增加。在过量表达乙酰乙酰CoA硫解酶，HMG CoA合酶和HMG CoA还原酶的菌株中过量表达HMGCoA还原酶下游的一个或多个基因可能会导致法尼醇和GG积累的显著增加。
实施例11
本实施例描述了一个实验，其中具有完整的和功能性的固醇途径，包括功能性的ERG9基因的菌株中，角鲨烯合酶被zaragozic acid阻断，并且观察到该角鲨烯合酶抑制剂对法尼醇和GG积累的影响。
Zaragozic acid是用作角鲨烯合酶有效抑制剂的化合物家族(Bergstrom，J.D.，Dufresne，C.，Bills，G.F.，Nallin-Omstead，M和Byme，K，1995，角鲨烯合酶有效抑制剂Zaragozic acid的发现，生物合成和作用机制，微生物学年鉴，49：607-639)。它们能抑制哺乳动物中的胆固醇生物合成和真菌中的麦角固醇生物合成。由于麦角固醇是真菌细胞生长所必需的，故Zaragozic acid是有效的杀真菌化合物。
在此实验中使用菌株SWE23-E9(ura3，sue；见实施例1.G)，因为它含有sue突变，可在需氧条件下摄取固醇。这使得当角鲨烯合酶被Zaragozic acid阻断时，酵母能在添加麦角固醇的培养基中生长。不具有sue突变的菌株将不能从培养基中摄取固醇，包括麦角固醇，因此不能在存在Zaragozic acid时生长。
通过首先在SCE-ura培养基中培养菌株48小时以选择质粒，从而在摇瓶中检测SWE23-E9，其中SWE23-E9含有空载体(Yep352)或能过量表达HMG CoA还原酶(pRH124-31)，GGPP合酶(pSW4A)或HMG CoA还原酶和GGPP合酶的质粒(pSW46-1)。然后用这些培养物样品接种YPDE培养基或含有100μg/ml Zaragozic acid的YPDE培养基。于30℃将YPDE(+/-Zaragozicacid)培养物保温48小时，然后分析细胞干重和法尼醇积累。此实验的数据示于表25。相对于未经处理的培养物而言，所有用Zaragozic acid处理的培养物表现出法尼醇的积累增加。此实验未测定GG积累。
表25 菌株Zaragozic Acid 细胞干重 法尼醇 ＠100μg/m mg/ml μg/ml ％干重SWE23-E9/Yep 352 + 7.65 43 0.56SWE23-E9/Yep 352 - 9.72 0 0SWE23-E9/pRH1 24-31 + 7.88 11 0.14SWE23-E9/pRH124-31 - 9.89 0 0SWE23-E9/pSW4A + 7.03 45 0.64SWE23-E9/pSW4A - 9.05 1 0SWE23-E9/pSW46-1 + 7.09 51 0.72SWE23-E9/pSW46-1 - 8.54 0 0
在另一实验中，通过首先在SCE-ura培养基中培养菌株48小时以选择质粒，从而在摇瓶中检测SWE23-E9，其中SWE23-E9含有空载体(Yep352)或能过量表达HMG CoA还原酶和GGPP合酶的质粒(pSW46-1)。然后用这些培养物样品接种YPDE培养基或含有100mg/ml Zaragozic acid的YPDE培养基。于30℃将YPDE(+/-Zaragozic acid)培养物保温72小时，然后分析细胞干重和GG。数据示于表26。相对于在缺乏Zaragozic acid时生长的相同菌株而言，用Zaragozic acid处理的SWE23-E9/pSW46-1培养物表现出较高水平的GG。这些实验表明：通过使用角鲨烯合酶抑制剂阻断固醇生物合成途径，该途径中不具有突变的菌株可被诱导积累法尼醇。经Zaragozic acid处理的培养物所积累的法尼醇或GG的量比完全缺损erg9基因的菌株所积累的量少得多，这表明角鲨烯合酶的基因阻断比角鲨烯合酶抑制剂所诱导的阻断更有效。
表26 菌株 Zaragozic Acid 细胞干重 GG ＠100μg/m mg/ml μg/ml ％干重 SWE23-E9/Yep 352 + 7.17 0 0 SWE23-E9/Yep 352 - 9.25 0 0 SWE23-E9/pSW46-1 + 6.68 17.8 0.27 SWE23-E9/pSW46-1 - 8.41 6.7 0.08
实施例12
已描述了多种细菌和植物中导致生成FPP的另一个途径，称之为非-甲羟戊酸或Rohmer途径(Eisenreich，W.，Schwarz，M.，Cartayrade，A.，Arigoni，D.，Zenk，M.H和Bacher，A.，1998，植物和微生物中类萜生物合成的脱氧木酮糖磷酸酯途径，Chem.Biol，5：R221-233，Paseshnichenko，V.A.，1998，真细菌和植物中类异戊二烯生物合成的新的另一种非-甲羟戊酸途径，生物化学(Mosc)63：139-148)。已鉴定和研究了大肠杆菌中的一些非-甲羟戊酸途径酶及其基因，所述酶包括脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶，IPP异构酶和FPP合酶，它们分别由dxr，dxs，idi和ispA基因编码。
为了构建能积累提高水平的法尼醇的大肠杆菌菌株，构建质粒以在大肠杆菌中过量表达上述基因。在某些情况下，克隆的DNA中包括与已知类异戊二烯途径基因邻接的其它基因。
使用下列两个寡核苷酸和分离自大肠杆菌菌株W3110的基因组DNAPCR扩增编码IPP异构酶的idi基因。用于扩增idi基因的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#U28375之序列的碱基#42309至#42335的序列和反向互补#43699至#43726的序列。小写字母用于表示已改变以产生限制性内切核酸酶识别位点的碱基，寡核苷酸序列之后的括号中标明了所述位点。VE145-5中使用了天然EcoRI位点。
SEQ ID NO：42：
VE145-5 5’-GGGATTCGAATTCTGTCGCGCTGTAAC-3’(EcoRI)
SEQ ID NO：43：
VE146-3 5’-TGggATCcGTAACGGCTTTAGCGAGCTG-3’(BamHI)
用EcoRI和BamHI消化idi PCR产物，连接至经EcoRI，BamHI消化的pUC19。所得克隆被称为pHS-O182。
使用下列两个寡核苷酸和分离自大肠杆菌菌株W3110的基因组DNAPCR扩增dxr基因。用于扩增包括frr，dxr和yaeS基因的DNA区域的寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#D83536之序列的碱基#2131至#2150的序列和反向互补#5297至#5315的序列。
SEQ ID NO：44：
DXR17.SN 5’-GATTCCGCGTAAGgATCcCG-3’(BamHI)
SEQ ID NO：45：
DXR3179.ASN 5’-CCAGCATctAGACCACCAG-3’(XbaI)
用BamHI和XbaI消化所得PCR产物，连接至经BamHI和XbaI消化的pHS-O182，产生pHS-O182R。
ispA和dxs基因似乎是操纵子的一部分，所述操纵子可能还包括两个其它基因xseB和yajO。使用下列寡核苷酸和分离自大肠杆菌菌株W3110的基因组DNA PCR扩增包括xseB，ispA，dxs和yajO的DNA区域。寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#AE000148之序列的碱基#4157至#4183的序列和反向互补#8938至#48956的序列。
SEQ ID NO：46：
DXS.5619P 5’-gactgcagCTGGCCGCTGGGTATTCTGTCGTAGTT-3’(PstI)
SEQ ID NO：47：
DXS.820X 5’-gatctagaTCACGCGTACGCAGAAGGTTTTGC-3’(XbaI)
用XbaI和PstI消化所得PCR产物，连接至经XbaI和PstI消化的pUC19，产生pHS-dxs。
使用XbaI和PstI从pHS-dxs上切下含有dxs基因的DNA片段，连接至用XbaI和PstI消化的pHS-O182R，产生含有dxs，dxr，ispA和idi的质粒。用所得质粒转化大肠杆菌，在摇瓶和发酵实验中检测含有质粒的转化菌株的法尼醇生产。
为了构建积累提高水平的GG的大肠杆菌菌株，构建质粒以在大肠杆菌中过量表达草生欧文氏菌的GGPP合酶。使用分离自草生欧文氏菌菌株Eho10的基因组DNA和下列两个寡核苷酸，经PCR扩增编码GGPP合酶的crtE基因。寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#M87280之序列的碱基#3513至#3531的序列和反向互补#4459至#4481的序列。
SEQ ID NO：48：
Eho10E Up 5’-gaattcCAATTCAGCGGGTAACCTT-3’(EcoRI)
SEQ ID NO：49：
Eho10E Lo 5’-aagcttTGCTTGAACCCAAAAGGGCGGTA-3’(HindIII)
用EcoRI和HindIII消化所得PCR产物，连接至pET24d(+)(Novagen)以使crtE基因的表达受控于T7启动子。所得质粒被称为pKL19-63。用该质粒转化大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)(可得自Novagen)，该菌株含有编码T7聚合酶的IPTG诱导型基因。可以用IPTG诱导该菌株中的crtE基因。使用BglII和HindIII从pKL19-63上切下T7启动子/crtE基因融合物，连接至经BamHI，HindIII消化的pACYC184(登记号为#X06403)以构建依靠氯霉素抗性进行选择的质粒。该质粒含有p15A复制起点，能与含有ColE1复制起点的质粒(例如携有上述大肠杆菌类异戊二烯途径基因的克隆)相容。后一种质粒赋予氨苄青霉素抗性，因此通过用两种质粒转化大肠杆菌并选择氯霉素和氨苄青霉素抗性可得到大肠杆菌转化子，其携有crtE质粒和含有dxs，dxr，idi和ispA基因的质粒。因此，可得到大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其含有过量表达脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶，IPP异构酶，FPP合酶和GGPP合酶的质粒。在摇瓶和发酵实验中检测这些菌株的GG生产。
实施例13
下列实施例描述了酿酒酵母菌株的构建，该菌株经改造后能通过表达对应于非-甲羟戊酸途径酶的酶来产生提高水平的法尼醇和GG。
IPP的生物合成出现在很多细菌和植物中，从丙酮酸和甘油醛-3-末端开始，经过一系列酶促步骤(已知为非-甲羟戊酸途径)，并包括下列酶：脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶。由这两个酶促步骤产生的化合物是2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸酯(也称为MEP)，它被未知酶进一步代谢，产生IPP。构建在酵母中表达大肠杆菌dxs和dxr基因的质粒，构建方法包括将所述基因的编码区与允许在酵母中进行表达的启动子元件融合。用寡核苷酸经PCR扩增dxs和dxr基因，所述寡核苷酸中包括允许克隆至酵母表达载体的限制性位点，所述载体含有启动子，如ADH1启动子，PGK启动子或GPD启动子。然后通过将一个基因融合物亚克隆至另一质粒而将两个基因融合物连接至单个质粒中。再将所得的含有这两个基因的质粒转化至酵母的erg9突变体。所得菌株能合成MEP，通过能进行生成IPP的所需反应的内源性酶能将MEP进一步代谢为IPP。这种能力导致IPP的积累增加，从而使细胞通过内源性IPP异构酶和FPP合酶的作用，积累提高水平的法尼醇。如果这一切发生在也过量表达GGPP合酶的菌株中，这些菌株中也会积累提高水平的GG。
实施例14
本实施例描述了酿酒酵母菌株的构建，该菌株过量表达突变的ERG20基因，该基因编码的FPP合酶表现出有所改变的产物特异性。与过量表达野生型FPP合酶的菌株不同的是，表达突变的FPP合酶的菌株积累的GG比法尼醇多。比较多种生物体的FPP合酶氨基酸序列，结果显示出几个高度保守的结构域，包括两个富含天冬氨酸的结构域，它们是催化活性所必需的。据研究人员报道，影响位于第一个富含天冬氨酸结构域前第5位的氨基酸的突变可改变酶的产物特异性，从而使酶易于催化GGPP以及FPP的形成。这一点已在禽类和嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶中有所显示(Tarshis，L.C.，Proteau，P.J.，Kellogg，B.A.，Sacchettini，J.C.，Poulter，C.D.1996，通过异戊二烯二磷酸酯合酶调节产物链长度，美国国家科学院院报93：15018-15023；Ohnuma，S.，Narita，K.，Nakazawa，T.，Ishida，C.，Takeuchi，Y.，Ohto，C和Nichino，T，1996，位于法尼基二磷酸酯合酶第一个富含天冬氨酸基元前第5位的氨基酸残基对确定终产物的作用，生物化学杂志，271：30748-30754；美国专利5,766,911)。对芽孢杆菌酶而言，第一个富含天冬氨酸结构域前第5位的氨基酸由酪氨酸改变为丝氨酸。禽类酶的此位置含有苯丙氨酸。据认为该位置的芳香族氨基酸阻止异戊二烯链延伸至15个碳以上，用体积较小的氨基酸，如丝氨酸取代苯丙氨酸即可缓解这种限制。
至于上述芽孢杆菌FPP合酶，酿酒酵母FPP合酶第一个富含天冬氨酸基元前第5位为酪氨酸。使用定点诱变改变ERG20基因的序列以在此位置编码丝氨酸而不是酪氨酸。用于导入突变的方法依靠使用能导入所需突变的诱变寡核苷酸PCR扩增整个pJMB19-31质粒，所述方法描述于QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)的使用说明书。寡核苷酸含有对应于GeneBank登记号为#J05091之序列的碱基#1063至#1097的序列和反向互补#1063至#1097的序列。寡核苷酸序列如下文所示，所作改变由小写字母表示。第#1084位的A变为T以使编码的氨基酸由酪氨酸转变为丝氨酸。第#1074位的T变为C以产生新的PstI位点，从而快速鉴定突变基因。后一突变是沉默突变，不会改变所编码的氨基酸。
SEQ ID NO：50：
Y95S-SN 5’-GCATTGAGTTGcTGCAGGCTTcCTTCTTGGTCGCC-3’
SEQ ID NO：51：
Y95S-ASN 5’-GGCGACCAAGAAGgAAGCCTGCAgCAACTCAATGC-3’
使用这两个寡核苷酸扩增pJMB19-31，将所得PCR产物自身连接以重新形成环形质粒，不同的是此时的ERG20基因含有所需的突变。所得质粒被称为pHS31.Y95S，将该质粒转化至erg9突变菌株SWE23-ΔE91，形成SWE23-ΔE91/pHS31.Y95S。进行摇瓶实验以比较过量表达野生型ERG20基因和突变ERG20因之菌株的法尼醇和GG生产情况。在SCE-ura中将菌株培养过夜，然后接种含有YPDE培养基的烧瓶。于30℃将这些培养物培养72小时，然后收集细胞，分析细胞干重和类异戊二烯。此实验的结果示于表27。
表27 菌株 FPP合酶 细胞干重 法尼醇 GG mg/ml mg/ml ％干重 mg/ml ％干重SWE23-DE91/JMB19-31野生型 4.7 0.22 4.76 0.05 1.1SWE23-DE91/pHS31.Y95STyr→Ser突变体 4.6 0.01 0.2 0.13 2.7
这些数据表明通过在erg9突变菌株中过量表达ERG20基因的tyr→ser突变体即可显著改变法尼醇：GG的比例。相对于过量表达野生型ERG20基因的菌株而言，过量表达突变ERG2O基因的菌株产生比例更高的GG。另外，相对于过量表达野生型ERG20基因的菌株而言，过量表达突变ERG20基因的菌株产生的GG总量较高，而法尼醇总量较低。GG收集物中未完全反映出法尼醇水平的降低，这表明一些FPP可被转变为除GG外的其它化合物。或者，反馈抑制在调节这些菌株中积累的GG量方面起作用。
本发明上述描述的目的是为了举例说明和描述。另外，上述描述不愿将本发明限制为本文公开的形式。因此，参照上述教导和相关领域的经验或知识对本发明所作的改动和修饰也属于本发明的范围。上文所述实施方案想进一步解释已知能实施本发明的最佳模式，以使本领域的其它技术人员能在这个或其它实施方案中利用本发明，并进行本发明特殊应用或使用所需的多种修饰。所附权利要求书欲包括现有技术所能允许的所有其它实施方案。
序列表<110>Millis，James R.
Saucy，Gabriel G.
Maurina-Brunker，Julie
McMullin，Thomas W.
Hyatt，John A.<120>维生素的生产方法<130>3161-17-PCT<140>PCT/US99/15262<141>1999-07-06<150>60/091,868<151>1998-07-06<160>51<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(23)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>1ctcagtacgc tggtacccgt cac 23<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(27)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>2gatggatccc aatatgtgta gctcagg 27<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(22)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>3gcgcatccac gggctatata aa 22<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>4gcggatccta ttatgtaagt acttag 26<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(22)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>5gagcatccac gggctatata aa 22<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>6tccccccggg cgcagacttc acgctc 26<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(31)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>7gatccgcggc tcaagctagc ggtattatgc c 31<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(29)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>8gactctagag tttacgagtc tggaaaatc 29<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(28)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>9gtaggatcca tggaattgag caatagag 28<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(33)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>10aattccaagc ttgcggccgc tctagaacgc gtg 33<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(32)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>11gatccacgcg ttctagagcg gccgcaagct tg 32<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(25)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>12gaattcgttt ataaggacag cccga 25<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>13ctgcagtcct taactgacgg cagcga 26<210>14<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(52)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>14agctgaattc gagctcggta cccgggctct agagtcgacc tgcaggcatg ca 52<210>15<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(52)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>15agcttgcatg cctccaggtc gactctagag cccgggtacc gagctcgaat tc 52<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(29)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>16gacggatccg tggaatattt cggatatcc 29<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(34)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>17ctcggatccg gacggattac aacaggtatt gtcc 34<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(31)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>18cagaattcac catggccgtg acttcctcct c 31<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(32)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>19caagatctca tacattcaat cctcatggac ac 32<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(31)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>20gagaattctt aacacgcatg atccccacgg c 31<210>21<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(32)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>21ctggatccgt caaatccgtg aatcgtaacg ag 32<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(33)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>22ggccggatcc atattacgta gaaatggctt cag 33<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(27)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>23gccgctcgag ggtccttatc tagtttg 27<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(38)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>24tctagaggca cctgtcactt tggaaaaaaa atatacgc 38<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>25ccgcgggccg gaaatgctct ctgttc 26<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>26cacgtcgacc attcaaactt tactac 26<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(19)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>27gagggcccgg tccagacat 19<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(27)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>28cccgggtatt gagcacgtga gtatacg 27<210>29<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>29ggatccggca agtgcacaaa caatac 26<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(21)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>30ccaaatataa ctcgagcttt g 21<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(19)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>31gcaaagtcca ccaccgcag 19<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(27)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>32gccacgtgcc cccgggtttc tctagcc 27<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(33)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>33ggaaaagagc tcgataatta ttgatgatag atc 33<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(21)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>34ccgttttgga tcctagatca g 21<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>35gttcccgggt tattgtcctg catttg 26<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(28)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>36aagagctcat ctgataatag atcaagcg 28<210>37<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(26)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>37aggagctcaa cgacaataaa tggctg 26<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(24)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>38gtcctctaga tcttgaatga aatc 24<210>39<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(23)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>39ctttgagctc gtacaagaag cag 23<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(21)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>40ctaagctttg cgcccgtgaa g 21<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(24)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>41gttctagaag ttttcaaagc agag 24<210>42<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(27)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>42gggattcgaa ttctgtcgcg ctgtaac 27<210>43<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(28)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>43tgggatccgt aacggcttta gcgagctg 28<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(20)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>44gattccgcgt aaggatcccg 20<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(19)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>45ccagcatcta gaccaccag 19<210>46<211>35<212>DNA <213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(35)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>46gactgcagct ggccgctggg tattctgtcg tagtt 35<210>47<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(32)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>47gatctagatc acgcgtacgc agaaggtttt gc 32<210>48<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(25)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>48gaattccaat tcagcgggta acctt 25<210>49<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(29)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>49aagctttgct tgaacccaaa agggcggta 29<210>50<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_特征<222>(1)..(35)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>50gcattgagtt gctgcaggct tccttcttgg tcgcc 35<210>51<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_difference<222>(1)..(35)<223>引物<220><223>人工序列的描述：引物<400>51ggcgaccaag aaggaagcct gcagcaactc aatgc 35