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1、(10)授权公告号 CN 101724623 B (45)授权公告日 2012.02.01 CN 101724623 B *CN101724623B* (21)申请号 200910250670.8 (22)申请日 2009.12.14 C12N 11/10(2006.01) (73)专利权人 内蒙古农业大学 地址 010018 内蒙古自治区呼和浩特市昭乌 达路 306 号 (72)发明人 张和平 陈霞 (74)专利代理机构 北京君智知识产权代理事务 所 11305 代理人 向华 (54) 发明名称 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊及其制备方法与它 们的用途 (57) 摘要 本发明涉及一种干酪乳杆。
2、菌(Lactobacillus casei Zhang)CGMCC 1697 的微胶囊包埋制备方 法， 该方法的步骤是干酪乳杆菌菌种活化、 培养基 的配制、 菌种发酵液的制备、 微胶囊壁材溶液的制 备、 微胶囊包埋液的制备与微胶囊的制备等。 与未 包埋的干酪乳杆菌相比， 采用本发明方法制备的 干酪乳杆菌微胶囊在人工消化液中处理后存活的 活菌数可提高 1 个数量级以上。在温度 37下贮 存 30 天后， 其存活的活菌数也可提高 1 个数量级 以上。 因此， 本发明干酪乳杆菌微胶囊可以大大提 高益生菌在加工、 贮藏、 运输过程中的功效。 (51)Int.Cl. 审查员 许欣嘉 (19)中华人民共和。
3、国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 2 页 CN 101724623 B1/2 页 2 1. 一种干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊的制备方法， 其特征在于该方法步骤如下 ： a、 菌种活化 ： 将冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang CGMCC 1697接种于MRS液体 培养基中， 在温度 37下培养 18-24 小时， 如此传代培养 1-2 次得到活化干酪乳杆菌 Zhang 菌种 ； b、 培养基的配制 ： 首先， 分别称取下述原料 ： 60-90 重量份一水合葡萄糖、 8-12 重量份酵母粉、 8-12 重量 份大。
4、豆蛋白胨、 3.0-3.5 重量份磷酸氢二钾、 13-15 重量份乙酸钠、 2.0-2.5 重量份柠檬酸 钠、 0.8-1.0 重量份 MgSO4 7H2O、 0.04-0.08 重量份 MnSO4 5H2O 与 0.8-1.0 重量份吐温 -80 ； 然后， 将上述原料溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 使用中和剂将其 pH 值调节到 6.4-6.6， 再在温度 120-122下灭菌 15 分钟， 这样得到所述的培养基 ； c、 菌种发酵液的制备 ： 以使用所述的培养基重量计， 按照 1-3 重量将步骤 a) 得到的活化干酪乳杆菌 Zhang 菌种接种于在步骤 b) 得到的所述培养基中。
5、， 在温度 37下培养 8-10 小时得到干酪乳杆菌 Zhang 菌种发酵液 ； d、 微胶囊壁材溶液的制备 ： 称取 8-12 重量份乳清蛋白粉， 并将所述粉溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用中 和剂将其 pH 值调节到 6.9-7.1， 这样得到以重量百分比计 8-12的乳清蛋白溶液 ； e、 微胶囊包埋液的制备 ： 步骤 d) 得到的所述乳清蛋白溶液， 或者在温度 80-90的条件下保持搅拌 15-45min， 然后使用冰水冷却到室温 ； 或者直接使用冰水冷却到室温 ； 这样得到的微胶囊包埋液于温 度 4条件下贮存过夜 ； f、 微胶囊的制备 将步骤 c) 得到的菌种发酵液。
6、以 4500-5500rpm 进行离心 4-6min， 分离培养液， 收集菌 体， 再用 PBS 缓冲液清洗 2-3 次， 洗去残留培养液 ； 以该菌体体积计， 往收集的菌体中加入 2-4 倍体积的 PBS 缓冲液， 用振荡器振匀， 使之再悬浮 ； 而后往菌株重悬液中加入在步骤 e) 得到的微胶囊包埋液， 同时还加入浓度为5-25mM的选自CaCl2、 NaCl或GDL的微胶囊形成诱 导物溶液， 以重量计， 所述微胶囊壁材与菌体的重量比为 7 3 ； 所述微胶囊形成诱导物与 菌体的重量比为 1.66 1000 ； 然后将上述混合液放入 37摇床中于 180rpm 培养 4 小时， 再将该混合液。
7、冷却到 4， 并用液氮进行冷冻， 使用真空冷冻干燥机进行冻干处理 48-72h， 得到所述的干酪乳杆菌 Zhang 的微胶囊。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述的中和剂选自氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳 酸钠或碳酸钾， 所述中和剂的浓度是 30-40 重量。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于在步骤 e 中， 所述的乳清蛋白溶液在温度 85的条件下保持搅拌 15min。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述微胶囊形成诱导物选自 CaCl2或 GDL。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述微胶囊形成诱导物的浓度是 10mM-20mM。。
8、 6. 根据权利要求 1-5 中任一权利要求所述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特 权 利 要 求 书 CN 101724623 B2/2 页 3 征在于所述微胶囊的包埋率为 88-90， 所述微胶囊的平均直径为 12-14m。 权 利 要 求 书 CN 101724623 B1/8 页 4 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊及其制备方法与它们的用途 【技术领域】 0001 本发明涉及微生物保护与应用技术领域。 更具体地， 本发明涉及干酪乳杆菌Zhang 微胶囊制备方法， 本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的微胶囊以及它们在乳品工业 中的应用。 【背景技术】 0002 众所周知， 。
9、乳酸菌是一类发酵乳糖产生乳酸的革兰氏阳性菌的总称， 是对人体具 有重要生理和保健功能的益生菌。作为一种益生菌， 乳酸菌由于其良好的发酵能力已经被 用于食品工业生产。乳酸菌不仅可以赋予发酵乳制品风味， 同时由于其高酸度可以抑制许 多腐败微生物存活的机会， 从而避免一些胃肠道疾病。 而对于乳酸菌， 如果其要发挥益生菌 功效， 他们必须面对许多不利环境， 如消化道中的酶及胆盐， 以活的生理状态到达胃肠道并 粘附在黏膜表面。此外， 益生菌制品在运输过程的存活率也是一个重要的指标。许多研究 表明益生菌生物体， 尤其嗜酸乳杆菌， 在乳制品如酸乳中仅少量存活。 0003 微胶囊技术 (Microencaps。
10、ulation)， 是运用一定的方法和仪器， 使用天然的或合 成的高分子材料(统称囊材)将固体、 液体甚至是气体的微小颗粒(统称囊心物)包埋成一 种具有半透性或密封囊膜的微小粒子的技术。微胶囊内的物质由于与外界环境相隔离， 可 以免受环境的影响， 从而保持稳定， 而在适当条件下， 被包封物质又可以释放出来。采用微 胶囊技术将乳酸菌菌体进行包埋， 能增强菌体对外界环境因素的抵抗能力， 提高菌体在低 温保存期和到达肠道后的存活率， 使乳酸菌更好的起到有益于健康的作用。 目前， 大量的材 料用于微胶囊壁材的制备， 如海藻酸盐， 明胶， 角叉胶， 纤维素及可溶性淀粉。 但是仅有少数 研究致力于乳清蛋白。
11、的使用。作为干酪生产副产品的乳清蛋白属于优质的完全蛋白质， 它 含有人体必须的八种氨基酸， 且配比合理， 接近人体的需求比例， 是人体生长、 发育、 抗衰老 等生命活动不可缺少的精华物质。 另外， 乳清蛋白较易消化吸收， 是一种非常好的增强免疫 力的蛋白。乳清蛋白中脂肪、 乳糖含量低， 但其含有很多活性成分， 如 - 乳球蛋白、 - 乳 白蛋白及免疫球蛋白。 因此， 利用乳清蛋白作为壁材， 将给食品微胶囊技术的发展创造一个 更新的机会。 0004 本发明针对一株从内蒙古传统功能性发酵乳酸马奶中分离， 并经过体外耐酸 性试验、 耐胆酸盐试验、 降胆固醇试验等一系列试验筛选得到的具有潜在益生作用的。
12、干酪 乳杆菌 (Lactobacillus casei)Zhang， 通过优化 WPI 浓度及其热变性条件， 菌胶之间比例 等方法实现菌体的微囊化。同时， 将该方法应用于商业化嗜酸乳杆菌 (L.acidophilus) 中， 实现其微胶囊化。这些益生菌微胶囊可以应用于益生菌发酵剂和益生菌制剂中， 改善益生 菌发酵剂和益生菌制剂品质， 扩大应用范围。 【发明内容】 0005 要解决的技术问题 0006 本发明的目的在于提供干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)Zhang 的微胶囊制备 说 明 书 CN 101724623 B2/8 页 5 方法。 0007 本发明的另一目的在于提。
13、供干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊。 0008 本发明的另一目的在于提供所述干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊在益生菌发酵剂和益 生菌制剂中的用途。 0009 技术方案 0010 所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)CGMCC 1697是从酸马奶中分离 得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌 ； 该菌菌株已于 2006 年 4 月 21 日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏(地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国 科学院微生物研究所)， 保藏号为CGMCC 1697。 干酪乳杆菌Zhang作为一种益生菌具有优良 的益生特性， 经大量研究表明，。
14、 该菌株具有良好的耐酸性、 人工胃肠液耐受性及胆盐耐受性 ( 张和平等， 中国乳品工业， 2006， 34(4) ： 6-11)， 对免疫系统具有显著的调节功能 ( 张和平 等， 中国乳品工业， 2006， 34(10) ： 4-8 ； 托娅， 张和平等， 食品科学， 2006， 27(11) ： 488-491)， 喂饲该菌体能显著降低高脂饲料大鼠血清胆固醇和低密度脂蛋白含量 ( 云月英， 张和平 等， 微生物学通报， 2006， 33(3) ： 60-64)。 0011 本发明的目的是通过如下技术方案实现的 ： 0012 本发明涉及一种干酪乳杆菌 Zhang 的微胶囊制作方法， 其特征在于。
15、该方法步骤如 下 ： 0013 a、 菌种活化 ： 0014 将冷冻保存的干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei Zhang)CGMCC 1697 接种于 MRS 液体培养基中， 在温度37下培养18-24小时， 如此传代培养1-2次得到所述的活化干酪乳 杆菌 Zhang 菌种 ； 0015 b、 培养基的配制 ： 0016 首先， 分别称取下述原料 ： 60-90 重量份一水合葡萄糖、 8-12 重量份酵母粉、 8-12 重量份大豆蛋白胨、 3.0-3.5 重量份磷酸氢二钾、 13-15 重量份乙酸钠、 2.0-2.5 重量份柠檬 酸钠、 0.8-1.0重量份MgSO4.7H2。
16、O、 0.04-0.08重量份MnSO4.5H2O与0.8-1.0重量份吐温80 ； 0017 然后， 将上述原料溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用中和剂将其 pH 值调节 到 6.4-6.6， 再在温度 120-122下灭菌 15 分钟， 这样得到所述的培养基 ； 0018 c、 菌种发酵液的制备 ： 0019 以使用所述的培养基重量计， 按照 1-3 重量将步骤 a) 得到的活化干酪乳杆菌 Zhang 菌种接种于在步骤 b) 得到的所述培养基中， 在温度 37下培养 8-10 小时得到干酪 乳杆菌 Zhang 菌种发酵液 ； 0020 d、 微胶囊壁材溶液的制备 ： 0021。
17、 称取 8-12 重量份壁材粉， 并将所述粉溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用中 和剂将其 pH 值调节到 6.9-7.1， 这样得到 8-12 重量所述的微胶囊壁材溶液。 0022 所述的微胶囊壁材选自乳清蛋白、 海藻酸钠或脱脂乳粉。 0023 e、 微胶囊包埋液的制备 ： 0024 步骤 d) 得到的所述微胶囊壁材溶液， 或者在温度 80-90的条件下持续搅拌 15-45min， 然后使用冰水冷却到室温 ； 或者直接使用冰水冷却到室温 ； 这样得到的微胶囊 包埋液于温度 4条件下贮存过夜。 说 明 书 CN 101724623 B3/8 页 6 0025 f、 微胶囊的制备 。
18、0026 将步骤c)得到的菌种发酵液以4500-5500rpm进行离心4-6min， 分离培养液， 收集 菌体， 再用PBS缓冲液清洗2-3次， 洗去残留培养液 ； 以该菌体体积计， 往收集的菌体中加入 2-4 倍体积的 PBS 缓冲液， 用振荡器振匀， 使之再悬浮 ； 而后往菌株重悬液中加入在步骤 e) 得到的微胶囊包埋液 ； 同时还加入 5-25mM 的选自 CaCl2、 NaCl 或 GDL 的微胶囊形成诱导物 溶液， 以重量计， 所述微胶囊壁材与菌体的重量比为 3 7 至 7 3 ； 所述微胶囊形成诱导 物与菌体的重量比为 0.29-4.45 1000 ； 然后将上述混合液放入 37摇。
19、床中于 180rpm 培 养 4 小时， 再将该混合液冷却到 4， 并用液氮进行冷冻， 使用真空冷冻干燥机进行冻干处 理 48-72h， 得到所述的干酪乳杆菌 Zhang 的微胶囊。 0027 根据本发明的一种优选实施方式， 所述的中和剂选自氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠 或碳酸钾， 所述中和剂的浓度是 30-40 重量。 0028 根据本发明的另一种优选实施方式， 所述的微胶囊壁材选自乳清蛋白或脱脂乳 粉。 0029 优选地， 所述的微胶囊壁材乳清蛋白溶液在温度 85的条件下保持搅拌 15min。 0030 根据本发明的另一种优选实施方式， 所述微胶囊形成诱导物选自 CaCl2或 GDL。 。
20、0031 优选地， 所述微胶囊形成诱导物的浓度是 10mM-20mM。 0032 根据本发明的另一种优选实施方式， 以重量计， 所述微胶囊壁材与菌体的重量比 为 4 6 至 6 4 ； 所述微胶囊形成诱导物与菌体的重量比为 1.11-2.22 1000。 0033 根据本发明所述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特征在于所述微胶囊的 包埋率为 88-90， 所述微胶囊的平均直径为 12-14m。 0034 本发明还涉及采用本发明所述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊在益生菌发 酵剂及益生菌制剂中的用途。 0035 根据本发明的另一种优选实施方式， 所述干酪乳杆菌 Zhang 。
21、微胶囊在益生菌发酵 剂与益生菌制剂中的量是以益生菌发酵剂或益生菌制剂总重量计为 1-30 重量。 0036 下面将更详细地说明本发明。 0037 本发明涉及一种干酪乳杆菌 Zhang 的乳清蛋白微胶囊制作方法。 0038 所述干酪乳杆菌 Zhang 的乳清蛋白微胶囊制作方法步骤如下 ： 0039 a、 菌种活化 ： 0040 将冷冻保存的干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei Zhang)CGMCC 1697 接种于 MRS 液体培养基中， 在温度37下培养18-24小时， 如此传代培养1-2次得到所述的活化干酪乳 杆菌 Zhang 菌种。 0041 其中， 所述的 MRS 液体。
22、培养基组成如下 ： 10g 蛋白胨、 10g 牛肉膏、 5g 酵母浸粉、 20g 葡萄糖、 2g磷酸氢二钾、 5g乙酸钠、 2g柠檬酸三钠、 1g吐温80、 200mg硫酸镁、 54mg硫酸锰与 1000mL 蒸馏水。上述这些原料用 1000mL 蒸馏水溶解后， 再使用无机碱将其 pH 调节到 6.5， 然后在温度 121下进行灭菌 15min， 这样得到 MRS 液体培养基。 0042 所述的蛋白胨是由蛋白质经酶、 酸、 碱水解而获得的一种由胨、 胨肽氨基酸组成的 水溶性混合物。它是微生物培养基的最主要基础成分， 主要作用是为微生物生长提供氮源 和维生素。 本发明使用的蛋白胨例如是厦门鑫隆达。
23、化学试剂公司以商品名蛋白胨销售的产 品， 或北京奥博星生物技术责任有限公司以商品名蛋白胨销售的产品。 说 明 书 CN 101724623 B4/8 页 7 0043 所述的牛肉膏是用新鲜牛肉经过剔除脂肪、 消化、 过滤、 浓缩而得到的一种棕黄色 至棕褐色的膏状物。 牛肉膏含有肌酸、 肌酸酐、 多肽类、 氨基酸类、 核苷酸类、 有机酸类、 矿物 质类及维生素类水溶性物质。它的主要作用是为微生物提供碳源、 能源、 磷酸盐和维生素。 本发明使用的牛肉膏例如是北京双旋生物培养基制品厂以商品名牛肉浸膏销售的产品， 或 北京奥博星生物技术责任有限公司以商品名牛肉膏粉销售的产品。 0044 所述的酵母浸粉。
24、是以酵母为原料， 采用自溶法或加酶水解法， 经分离、 脱色、 喷雾 干燥而得到的含氨基酸、 肽、 多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。 本发明使用的酵母浸粉例 如是北京奥博星生物技术责任有限公司以商品名酵母浸份销售的产品， 或厦门鑫隆达化学 试剂公司以商品名酵母粉销售的产品。 0045 上述其它原料都是本技术领域的技术熟知的、 可从市场上获得的产品。 0046 这里菌种活化培养使用的装置是本技术领域的技术人员熟知的带有控温与定时 器件的培养装置， 例如上海一恒科学仪器有限公司以商品名生化培养箱销售的培养装置或 上海实验仪器厂有限公司以商品名恒温培养箱销售的培养装置。 0047 b、 培养基的配制 。
25、： 0048 首先， 分别称取下述原料 ： 60-90 重量份一水合葡萄糖、 8-12 重量份酵母粉、 8-12 重量份大豆蛋白胨、 3.0-3.5 重量份磷酸氢二钾、 13-15 重量份乙酸钠、 2.0-2.5 重量份柠 檬酸钠、 0.8-1.0 重量份 MgSO4.7H2O、 0.04-0.08 重量份 MnSO4.5H2O 与 0.8-1.0 重量份吐 温 -80 ； 0049 其中所述的酵母粉是如前面所描述的酵母浸粉。 0050 所述的大豆蛋白胨是如前面所描述的用大豆蛋白质获得的蛋白胨。 0051 然后， 将上述原料溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用中和剂将其 pH 值调。
26、节 到 6.4-6.6， 再在温度 120-122下灭菌 15-17 分钟， 这样得到所述的培养基。 0052 所述的中和剂是氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠或碳酸钾。 0053 优选地， 所述的中和剂是氢氧化钠、 氢氧化钾或碳酸钠。 0054 更优选地， 所述的中和剂是氢氧化钠或氢氧化钾。 0055 所述中和剂的浓度是 30-40 重量， 优选地是 32-38 重量， 更优选地是 34-36 重 量。 0056 c、 菌种发酵液的制备 ： 0057 以使用所述的培养基重量计， 按照 1-3 重量将步骤 a) 得到的活化干酪乳杆菌 Zhang 菌种接种于在步骤 b) 得到的所述培养基中， 在温度。
27、 37下培养 8-10 小时得到干酪 乳杆菌 Zhang 菌种发酵液。采用测定 600nm 吸光值的方法 ( 参见高鹏飞等人，微生物学通 报 ， 2008年， 35(4) ： 第623-628页)， 在室温条件下测量该干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液的 活菌数可以达到 108cfu/mL 以上。 0058 优选地， 所述的接种量是以使用所述的培养基重量计 2 重量。 0059 该步骤使用的培养装置是本技术领域的技术人员熟知的带有控温与定时器件的 培养装置， 例如上海一恒科学仪器有限公司以商品名生化培养箱销售的培养装置， 或上海 实验仪器厂有限公司以商品名恒温培养箱销售的培养装置。 0060 d、。
28、 微胶囊壁材溶液的制备 ： 0061 称取 8-12 重量份乳清粉。并将上述原料溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用 说 明 书 CN 101724623 B5/8 页 8 中和剂将其 pH 值调节到 6.9-7.1， 这样得到所述的 10蛋白乳清溶液。 0062 所述的壁材选自乳清蛋白、 海藻酸钠或脱脂乳粉。优选地， 乳清蛋白或脱脂乳粉。 更优选地乳清蛋白。 0063 e、 微胶囊包埋液的制备 ： 0064 将步骤 d) 得到的所述微胶囊壁材溶液， 或者在温度 80-90的条件下保持搅拌 15-45min， 然后使用冰水冷却到室温， 或者直接使用冰水冷却到室温， 这样得到的微胶囊。
29、包 埋液于 4条件下过夜贮存。 0065 所述的乳清蛋白溶液变性条件可以优选地是在 80-90的条件下 15-30min。更优 选地是 85、 15min。 0066 f. 微胶囊的制备 ： 0067 将步骤c)得到的菌种发酵液以4500-5500rpm进行离心4-6min， 分离培养液， 收集 菌体， 再用PBS缓冲液清洗2-3次， 洗去残留培养液 ； 以该菌体体积计， 往收集的菌体中加入 2-4 倍体积的 PBS 缓冲液， 用振荡器振匀， 使之再悬浮 ； 而后往菌株重悬液中加入在步骤 e) 得到的微胶囊包埋液 ； 同时还加入 5-25mM 的选自 CaCl2、 NaCl 或 GDL 的微胶。
30、囊形成诱导物 溶液， 以重量计， 所述微胶囊壁材与菌体的重量比为 3 7 至 7 3 ； 所述微胶囊形成诱导 物与菌体的重量比为 0.29-4.45 1000 ； 然后将上述混合液放入 37摇床中于 180rpm 培 养 4 小时， 再将该混合液冷却到 4， 并用液氮进行冷冻， 使用真空冷冻干燥机进行冻干处 理 48-72h， 得到所述的干酪乳杆菌 Zhang 的微胶囊。 0068 在本发明中， 所述微胶囊壁材与菌体的重量比为 3 7 至 7 3。 0069 优选地， 所述的微胶囊壁材与菌体的重量比是 4 6 至 6 4。 0070 在本发明中， 微胶囊形成诱导物应该理解是可加速微胶囊形成的催。
31、化性物质。因 此， 具有加速微胶囊形成催化性的物质一般都可以用于本发明。 0071 所述微胶囊形成诱导物选自 CaCl2、 NaCl 或 GDL(D- 葡萄糖酸 - 内脂 )。优选 地， CaCl2或 GDL。更优选地， CaCl2。 0072 在 本 发 明 中， 以 重 量 计， 所 述 微 胶 囊 形 成 诱 导 物 与 菌 体 的 重 量 比 为 0.29-4.45 1000。 0073 优选地， 所述微胶囊形成诱导物与菌体的重量比为 1.11-2.22 1000， 更优选地 为 1.66 1000。 0074 所述的真空冷冻干燥是本技术领域的技术人员已知的。一般而言， 所述的冷冻干 。
32、燥是在温度 -10-50与真空 1.3-13 帕下进行的， 在所述的冷冻干燥后应该达到冻干菌粉 的水分含量不高于 8。 0075 所述干酪乳杆菌 Zhang 菌体悬液冷冻干燥使用设备是美国 Labconco 公司销售的 4.5Liter Freeze Dry System7751020。 这种设备的特征在于控制在低温真空 条件下， 使水份以升华实现干燥， 能很好地保护菌体的活力少受破坏。 0076 本发明还涉及采用上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特征在于其包埋 率为 88-90。 0077 所述干酪乳杆菌 Zhang 总活菌数是采用本技术领域的技术人员熟知的平板倾注 的测定方。
33、法， 例如用 MRS 培养基倾注平板计数。 0078 本发明还涉及采用上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特征在于其平均 说 明 书 CN 101724623 B6/8 页 9 直径为 12-14m。 0079 所述干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊的直径是采用本技术领域的技术人员熟知的电子 显微镜测定方法。 0080 本发明还涉及采用上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特征在于该微胶 囊极易溶解于 pH8.0 的人工肠液， 而不易溶解于 pH2.0、 pH2.5 或 pH3.0 的人工胃液。所述 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊在人工胃肠液中的溶解是采用本技术领域的技术。
34、人员熟知的紫 外分光光度计测定吸光值的方法确定的， 例如是根据在 600nm 处的光密度 OD600nm确定的。 0081 本发明还涉及采用上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特征在于该微胶 囊经过 pH2.0 或 pH2.5 人工消化液处理后与未被包埋的菌体相比可保持较高的存活率。例 如采用本方法包埋的干酪乳杆菌 Zhang 与未被包埋的干酪乳杆菌 Zhang 在 pH2.0 或 pH2.5 人工消化液中的存活率分别是 57.97、 66.89和 34.90、 52.31。所述干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊存活率测定是采用本技术领域的技术人员熟知的平板倾注的测定方法， 例如 用。
35、 MRS 培养基倾注平板计数。 0082 本发明还涉及采用上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 其特征在于该微胶 囊经过 37贮藏 30 天后与未被包埋的菌体相比可保持较高的存活率。例如采用本方法包 埋的干酪乳杆菌 Zhang 与未被包埋的干酪乳杆菌 Zhang 在 37贮藏 30 天后的存活率分别 是 61.76和 44.61。所述干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊存活率测定是采用本技术领域的技 术人员熟知的平板倾注的测定方法， 例如用 MRS 培养基倾注平板计数。 0083 本发明还涉及所述的酪乳杆菌 Zhang 冻干菌粉在益生菌发酵剂或益生菌制剂中 的用途。 0084 所述的益生菌。
36、发酵剂或益生菌制剂例如可以是一种或多种选自嗜酸乳杆菌、 保加 利亚乳杆菌、 嗜热链球菌或双歧杆菌的益生菌发酵剂。一般地， 可以按照本发明的微胶囊 制作方法对益生菌发酵剂进行包埋， 从而提高益生菌在加工、 贮藏、 运输过程中的存活率， 保持其充分的活性， 并可更好的发挥其降胆固醇、 增强免疫等诸多益生功效。同时， 可以按 照以益生菌发酵剂或益生菌制剂总重量计 1-30 重量的量直接地把本发明的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊均匀地加到所述的益生菌发酵剂或制剂中， 或者采用其它方式加到所述的益 生菌发酵剂或制剂制剂中。 0085 有益效果 0086 本发明的干酪乳杆菌 Zhang 对酸和胆盐耐受能力。
37、强， 并且具有降胆固醇、 抑制肿 瘤、 提高免疫力等多种益生功能， 采用本发明方法制备的乳清蛋白微胶囊经过 pH2.0 或 pH2.5人工消化液处理后存活的活菌数， 比未被包埋的可以提高1个数量级以上。 采用本发 明方法制备的乳清蛋白微胶囊在37贮存30天后存活的活菌数， 比未被包埋的可以提高1 个数量级以上。 另外， 本发明的微胶囊制作方法对于商业化嗜酸乳杆菌同样适用， 并可以提 高商业化嗜酸乳杆菌在经过人工胃肠液后的存活率， 以及 37贮存 30 天后的贮存存活率。 此方法大大提高了益生菌在加工、 贮藏、 运输过程中的功效。 【附图说明】 0087 图 1L.casei Zhang 乳清蛋。
38、白微胶囊电镜结构 0088 图 2 微胶囊在 pH 2.0 的人工胃液中的溶解性 说 明 书 CN 101724623 B7/8 页 10 0089 LC ： 干酪乳杆菌 Zhang 冻干粉 0090 LCW ： 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊 0091 图 3 微胶囊在 pH 2.5 的人工胃液中的溶解性 0092 LC ： 干酪乳杆菌 Zhang 冻干粉 0093 LCW ： 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊 0094 图 4 微胶囊在 pH 3.0 的人工胃液中的溶解性 0095 LC ： 干酪乳杆菌 Zhang 冻干粉 0096 LCW ： 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊 0097 图 。
39、5 微胶囊在 pH 8.0 的人工肠液中的溶解性 0098 LC ： 干酪乳杆菌 Zhang 冻干粉 0099 LCW ： 干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊 【具体实施方式】 0100 下面实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。 0101 下述实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0102 实施例 1 ： 干酪乳杆菌 Zhang 的微胶囊的制作方法 0103 这个实施例按照下述步骤进行 ： 0104 a、 菌种活化 ： 0105 将冷冻保存的干酪乳杆菌 (Lactobacillus caseiZhang)CGMCC 1697 接种于 MRS 液体培养基中， 在温度3。
40、7下培养18-24小时， 如此传代培养2次得到所述的活化干酪乳杆 菌 Zhang 菌种 ； 0106 b、 培养基的配制 ： 0107 首先， 分别称取下述原料 ： 80 重量份一水合葡萄糖、 10 重量份酵母粉、 10 重量份 大豆蛋白胨、 3.2 重量份磷酸氢二钾、 14 重量份乙酸钠、 2.2 重量份柠檬酸钠、 0.9 重量份 MgSO4.7H2O、 0.06 重量份 MnSO4.5H2O 与 0.9 重量份吐温 80 ； 0108 然后， 将上述原料溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用 35 重量氢氧化钠将 其 pH 值调节到 6.5， 再在温度 121下灭菌 15 分钟，。
41、 这样得到所述的培养基 ； 0109 c、 菌种发酵液的制备 ： 0110 以使用所述的培养基重量计， 按照 2 重量将步骤 a) 得到的活化干酪乳杆菌 Zhang 菌种接种于在步骤 b) 得到的所述培养基中， 在温度 37下培养 10 小时得到干酪乳 杆菌 Zhang 菌种发酵液 ； 0111 d、 微胶囊壁材溶液的制备 ： 0112 称取 10 重量份乳清粉。并将所述乳清粉溶于 1000 重量份水中， 搅拌均匀， 再使用 35 重量氢氧化钠中和剂将其 pH 值调节到 7.0， 这样得到所述的 10蛋白乳清溶液。 0113 e、 微胶囊包埋液的制备 ： 0114 将步骤 d) 得到的所述乳清。
42、蛋白溶液， 在温度 85的条件下保持搅拌 15min， 然后 使用冰水冷却到室温。将上述得到的乳清蛋白变性液于 4条件下贮存过夜。 0115 f、 微胶囊的制备 0116 将步骤 c) 得到的菌种发酵液以 5000rpm 进行离心 5min， 分离培养液， 收集菌体， 说 明 书 CN 101724623 B8/8 页 11 再用 PBS 缓冲液清洗 3 次， 洗去残留培养液 ； 以该菌体体积计， 往收集的菌体中加入 3 倍体 积的 PBS 缓冲液， 用振荡器振匀， 使之再悬浮 ； 而后往菌株重悬液中加入在步骤 e) 得到的 微胶囊包埋液， 同时还加入浓度为 15mM 过滤去菌的 CaCl2微。
43、胶囊形成诱导物溶液， 以重量 计， 所述微胶囊壁材与菌体的重量比为 7 3 ； 所述微胶囊形成诱导物与菌体的重量比为 1.66 1000 ； 然后将上述混合液放入 37摇床中于 180rpm 培养 4 小时， 再将该混合液冷 却到 4， 并用液氮进行冷冻， 使用真空冷冻干燥机进行冻干处理 48-72h， 得到所述的干酪 乳杆菌 Zhang 的微胶囊。 0117 采用本说明书中描述的方法测定了所得到干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊的包埋率为 88.810.19， 其平均直径为 13.37m。 0118 实施例 2 ： 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei Zhang) 微胶囊应用于。
44、益生菌发酵 剂。 0119 将干酪乳杆菌冻干菌粉按 10 重量加入到由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合 直投型发酵剂中， 混合均匀即可得到含干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei Zhang) 的益生 菌发酵剂。此发酵剂可用于发酵酸奶或发酵乳饮料的生产加工。 0120 在所述的发酵剂中添加实施例 1 得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 可增加该益生 菌发酵剂的益生效果。采用上述方法包埋的 L.casei Zhang 经过 pH2.0 或 pH2.5 人工消化 液处理后与未被包埋的菌体相比可保持较高的存活率。采用本说明书描述的方法进行测 定， 结果表明所述包埋与未包埋干酪乳杆菌 。
45、Zhang 在 pH2.0 与 pH2.5 人工消化液中的存活 率分别是 57.97、 66.89和 34.90、 52.31。 0121 此外， 在发酵剂中添加上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶囊， 可增加其在贮 存、 运输中的效果。研究证明， 该微胶囊经过 37贮藏 30 天后与未被包埋的菌体相比可保 持较高的存活率， 分别是 61.76和 44.61。 0122 实施例 3 ： 干酪乳杆菌微胶囊应用于益生菌制剂。 0123 将干酪乳杆菌微胶囊按 10 重量加入到双歧杆菌医用益生菌制剂基质中， 混合 均匀后制成胶囊或压片， 即可得到含干酪乳杆菌的益生菌胶囊或益生菌片剂。 0124 。
46、在所述的益生菌胶囊或益生菌片剂中添加实施例1得到的干酪乳杆菌Zhang微胶 囊， 可增加该益生菌发酵剂的益生效果。采用上述方法包埋的 L.casei Zhang 经过 pH2.0 或 pH2.5 人工消化液处理后与未被包埋的菌体相比可保持较高的存活率。采用本说明书描 述的方法进行测定， 结果表明所述包埋与未包埋干酪乳杆菌 Zhang 在 pH2.0 与 pH2.5 人工 消化液中的存活率分别是 58.10、 66.95和 34.70、 52.01。 0125 此外， 在益生菌胶囊或益生菌片剂中添加上述方法得到的干酪乳杆菌 Zhang 微胶 囊， 可增加其在贮存、 运输中的效果。 研究证明， 其特征在于该微胶囊经过37贮藏30天后 与未被包埋的菌体相比可保持较高的存活率， 分别是 61.80和 44.32。 说 明 书 CN 101724623 B1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101724623 B2/2 页 13 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 。