技术领域
本发明涉及一种进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3，属于蛋白质领域。
背景技术
细菌免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin(Ig)-bindingproteins，IBPs)是一类 由细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白，是细菌重要致病因 子之一。研究最多的IBPs有金黄色葡萄球菌蛋白A(StaphylococcalproteinA， SpA)、链球菌(C和G群)蛋白G(StreptococcalproteinG，SpG)和部分大消化链球 菌表面的蛋白L(PeptostreptococcusmagnusproteinL，PpL)。研究表明，细菌IBPs 均包含由多个的序列高度同源的结合结构域头尾相连重复组成的抗体结合区，每 个单结构域具有与全分子完全相同的结合特性，形成Ig结合功能的基本单位。
SpA含有五个高度同源的重复结构域，自N端起分别为E、D、A、B、C， 单个结构域约58个氨基酸残基大小，形成3股反向平行排列α-螺旋的空间结构， 每个单结构域具有独立的与哺乳动物IgG抗体重链中的第二及第三恒定区 (CH2γ,CH3γ)间的分界面结合活性，该结合以螺旋1和螺旋2与Fc的疏水作用为 主并通过两个分子之间的四对氢键得到进一步稳定。ProteinA还可以结合由人 VHⅢ基因家族编码的Fab片段，因此还能结合其它类型抗体。SpG分子量为 65KD，包含3个高度同源的Ig结合结构域B1、B2和B3(为区别于SpA中的 B，以下统称G1、G2、G3)，与SpA不同，其单结构域由四个串联的β折叠和一 个α螺旋组成，也结合于IgGFc的CH2γ和CH3γ间的分界面上，与SpA的结合部 位部分重叠。因其折叠结构含量很高，SpG结合Fc位点位于其螺旋和连结螺旋 至β－折叠3的环区中。此外，SpG可以结合IgG的Fab段，其识别部位定位于γ 链的第一个恒定区(CH1γ)，所以它仅结合IgG,并具有更高的亲和力。已有研究表 明，IBPs被广泛用作免疫化学试剂用来鉴定与纯化抗体、在免疫测定与酶联免 疫吸附测定系统中可作为加强反应物、作为融合附加物方便重组蛋白质的固定与 纯化，并且IBPs还被用于临床上体外免疫吸附，已成为非常有价值的诊断、治 疗及制备的工具。但是现有的IBPs的广谱性和结合力仍然不高，并且生产成本 也居高不下。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3，其特征 在于：具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种编码如权利要求1的进化免疫球蛋白结合 分子D-C-G3的cDNA序列，其特征在于：cDNA序列如SEQIDNO:2所示。
本发明的第三方面，提供了一种制备如权利要求1的进化免疫球蛋白结合 分子D-C-G3的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将新型进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3的编码基因克隆入表达载 体中，并利用所述表达载体构建表达菌种；
步骤二：对所述表达菌种进行大规模培养，诱导生产进化免疫球蛋白结合分 子D-C-G3，
步骤三：从培养物中分离出具有免疫球蛋白结合活性的多肽溶液，然后进行 纯化，得到纯化的新型进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3。
另外，制备进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3的方法，还可以具有这样的特 征：其中，表达载体为原核载体。
另外，制备进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3的方法，还可以具有这样的特 征：其中，原核载体为PET-32a(+)。
进一步，制备进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3的方法，还可以具有这样的 特征：其中，表达菌种为大肠杆菌。
进一步，制备进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3的方法，还可以具有这样的 特征：其中，表达菌种为大肠杆菌BL21-TRXB。
本发明的第四方面，提供了进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3在抗体的体外 免疫学检测中的应用。
本发明的第五方面，进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3在纯化抗体中的应用。
进一步的，进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3在纯化抗体中的应用，其中， 应用为在基因工程抗体药物纯化中的应用。
发明作用与效果
根据本发明公开的进化免疫球蛋白结合分子，其可以广谱结合包括人及多种 动物总IgG及不同亚类的IgG，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结 合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。另一方面，本发明公开了上述进化免疫 球蛋白结合分子的基因工程制备方法，使得低成本、大规模生产成为可能。再一 方面，本发明公开了将上述进化免疫球蛋白结合分子用于抗体的体外免疫学检测 及抗体的纯化，与现有技术相比，使用了本发明的进化免疫球蛋白结合分子可以 提高检测的灵敏度及准确性，纯化的效果也更好。
附图说明
图1是七个SpA、SpGIg结合单结构域DNA片段的XbaⅠ酶消化电泳图；
图2是原代文库片段插入情况的PCR鉴定；
图3是本发明的D-C-G3的原核表达、纯化流程图；
图4是本发明的D-C-G3表达并纯化后的SDS-PAGE结果；
图5是ELISA检测融合蛋白D-C-G3、SpA和SpG与小鼠IgG四亚类的结合活 性结果；
图6是ELISA检测融合蛋白D-C-G3、SpA和SpG与人、兔、牛和山羊四物种 IgG结合活性；
图7是使用融合蛋白D-C-G3纯化基因工程抗体的电泳图；
图8是使用融合蛋白D-C-G3纯化天然抗体电泳图；
图9是使用融合蛋白D-C-G3纯化单克隆抗体电泳图；以及
图10是使用融合蛋白D-C-G3进行抗HCV免疫层析测试条检测结果图。
具体实施方式
以SpA、SpG和PpL的各单结构域构建噬菌体展示随机组合文库，用不同 物种、不同亚类Ig分子对该文库进行体外进化筛选，获得多种与不同物种、不 同亚类IgG具有优势结合特性组合分子，这些应用基于噬菌体展示技术的分子进 化方法获得的分子系非天然存在的分子，并具有新的结合特性，被定义为新型免 疫球蛋白结合分子(NovelEvolvedImmunoglobulinBindingMolecules,NEIBM)。 该专利所涉及的是我们以SpA的A、B、C、D、E和SpG的G2、G3共7个单 结构域构建噬菌体展示随机组合文库，用多物种、不同亚类IgG分子对该文库进 行体外进化筛选，所获得一种新的与多物种、不同亚类IgG具有优势结合新型 NEIBM，称为NEIBMD-C-G3或者进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3，后文简称 D-C-G3。
该分子显示出与IgG抗体，与人、兔、牛、羊等多种动物IgG和鼠IgG1,2a, 2b,3不同亚类IgG增强的结合能力，可用于抗体的体外免疫学检测及抗体的纯 化。
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式
实施例1使用分子进化方法获得D-C-G3分子
即构建噬菌体展示SpA的A、B、C、D、E以及SpG的B2、B3共7个单 结合结构域随机组合文库。应用小鼠IgG1、2a、2b、3以及人IgG、兔IgG、牛 IgG、山羊IgG等8种IgG为诱导分子，通过“吸附”-“洗脱”-“扩增”的重 复过程，对该文库进行3-4轮筛选，并对筛选中各轮出现的阳性克隆进行测序， 获得具有优势结合特性的新型组合序列。
1.SpA和SpG七个单结构域随机组合噬菌体展示文库的构建
以pCANTAB5S-SpA噬菌粒为模板，分别以uA和dAD、uB和dB、uC和dC、 uD和dAD、uE和dE为上下游引物，PCR扩增SpA的A、B、C、D、E五结构域片 段；以uG2和dG2为上下游引物，分别以pMD-18T-G2、pMD-18T-G3质粒为模板， PCR扩增SpG的G2、G3结构域片段；为延长保护碱基以提高酶切效率，我们再 以Sec为上下游引物，分别以上述7个单结构域片段的PCR产物为模板，PCR扩 增得到在两端分别引入约50bp个保护碱基的7个单结构域片段。将7个片段的 PCR产物纯化后用XbaⅠ酶消化，与同样酶切并用CIP酶去磷酸化处理的 pCANTAB5S连接后转化E.coliTG1感受态细菌。分别取0.1μL、1μL、10μ L转化后的细菌涂布LB(含Amp100mg/L)平皿，并计算库容。随机挑取23个 转化子对文库中片段插入情况进行PCR鉴定，将插入多个结构域片段的转化子委 托上海杰李生物技术有限公司(以下简称上海杰李)进行序列测定。剩余菌液继 续加入10mL2×YT(Amp)培养基，37℃，250r/min振荡培养过夜。加500μ L1.3×1012TU/mL的M13K07辅助噬菌体，37℃，250r/min，振荡培养1h， 加入Kana后，37℃，250r/min振荡培养8h。1000g离心10min，上清经0.22 μm滤膜过滤，即为展示SpA和SpG单结构域随机组合噬菌体文库，见图1和图 2。取100μL噬菌体文库作10倍系列稀释，各取100μL感染对数生长期的 E.coliTG1900μL，37℃，250r/min，振荡培养1h后，取100μL涂布LB (Amp)平板，37℃培养过夜。计数不同稀释度的平皿上生长的菌落数，菌落数 乘以稀释度再乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformationunit, TU)，即滴度。
表1扩增SpA、SpG各单结构域片段的引物序列
注：斜体部分为XbaI酶切位点；下划线部分为随机连接肽碱基序列(N＝ A/T/C/G,S＝G/C)。
uA的序列见SEQIDNo.3；uD的序列见SEQIDNo.4；dAD的序列见SEQID No.5；uB的序列见SEQIDNo.6；dB的序列见SEQIDNo.7；uC的序列见SEQIDNo.8； dC的序列见SEQIDNo.9；uE的序列见SEQIDNo.10；dE的序列见SEQIDNo.11； uG2的序列见SEQIDNo.12；dG2的序列见SEQIDNo.13；Sec的序列见SEQID No.14；pCANTAB5S-1的序列见SEQIDNo.15；pCANTAB5S-6的序列见SEQIDNo.16。
2、用多物种和小鼠IgG四亚类对噬菌体组合文库的体外进化筛选
应用小鼠IgG1、2a、2b、3以及人IgG、兔IgG、牛IgG、山羊IgG等8种 IgG为诱导分子，通过“吸附”-“洗脱”-“扩增”的重复过程，对该文库进行 3-4轮筛选，并对筛选中各轮出现的阳性克隆进行测序。具体为：将各IgG抗体 分子用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释成10μg/ml包被于酶标排条板上，37℃结合3 小时，用封闭液封闭1小时后，4℃保存备用。取抗体包板三条，排条板上先加 封闭液100μl/孔，再加噬菌体展示文库100μl/孔共两条，空白对照一条(不 加phage)，37℃反应3小时。洗液洗涤15遍后，每孔加入100ul生长至对数生 长期的E.coliTG1，37℃培养1h，收集菌液，取10ul测定滴度，其余菌液扩增 至50ml2×YT(含苄青霉素100mg/L)培养基，37℃培养1h后加入1010TU的辅助 噬菌体M13KO7，再培养1h后加入卡那霉素至15mg/L，37℃培养过夜，1000g 离心10min，上清经0.22μm滤膜过滤，即为第一轮筛选后文库。该文库即可 用于第二轮筛选，筛选过程同上。文库经过4轮筛选后，从筛选后测定滴度的平 板上随机挑选10个单克隆委托上海杰李进行序列测定。序列分析结果显示人 IgG、兔IgG、牛IgG、山羊IgG和小鼠IgG1、2a、2b筛选所获得的序列均为D-C-G3。 小鼠IgG3筛选所获得后序列80％为D-C-G3。D-C-G3的cDNA序列如SEQIDNo.2 所示,氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
图1是七个SpA、SpGIg结合单结构域DNA片段的XbaⅠ酶消化电泳图，在 图1中，M:DL2000DNAMarker(2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp, 100bp)；1,2,3,4,5,6,7:分别为A,B,C,D,E,G2,G3的DNA片段；1’, 2’,3’,4’,5’,6’,7’:分别为XbaⅠ酶切后的A,B,C,D,E,G2,G3 片段。
图2是原代文库片段插入情况的PCR鉴定，在图2中M:DL2000DNAMarker (2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；1-23:23个单 克隆的数目；B:PCR空白对照；C:阳性对照，即未插入片段的噬菌粒pCANTAB5S 组。
实施例2
原核表达载体pET32a(+)－D-C-G3的构建流程见图3。
2.1引物合成
用于PCR扩增进化免疫球蛋白结合分子D-C-G3的cDNA序列的引物为：上 游5SNco-u：5’-GCGCCCATGGGGTCTAGAGCTGATGCGCAAC-3’，下游5SSac-d：5’- GCGCCTCGAGTTATCTAGACTGCTGGTGTTCGG-3’。引物DNA序列由上海生工生物工程科 技服务有限公司合成。
2.2D-C-G3表达序列的PCR扩增
以pCANTAB5S-D-C-G3为模板，用合成的上、下游引物进行扩增，PCR的反 应体积为50μl，加质粒模板5ng，上、下游引物各1μmol，dNTP100μmol， Mg2+3mmol，Taq酶1U，加ddH2O至50μl。反应条件：94℃30s-60℃30s-72 ℃45s；35个循环，反应结束前72℃延伸5min，产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检 测，割胶回收试剂盒回收纯化。
2.3重组表达质粒的构建及DNA序列测定
上述PCR纯化产物用NcoI和SalI双酶切，试剂盒回收后取400ng与400ng PET-32a(+)载体NcoI和SacI酶切产物连接。转化后挑选重组子酶切鉴定，获重 组质粒pET-32a－D-C-G3。
2.4D-C-G3融合蛋白的表达
2.4.1重组表达载体pET-32a(+)－D-C-G3的转化
氯化钙法制备大肠杆菌BL21感受态细胞，取pET-32a(+)－D-C-G3200ng 加入感受态BL21-TRXB100μl，冰水浴30min，42℃90s，冰水浴1-2min后加 900μl的SOC培养基37℃150rpm培养1h后涂LB平板(含Amp100ng/ml和Kana35 ng/ml)37℃培养过夜。
2.4.2D-C-G3的诱导表达和SDS-PAGE样品的制备
从pET-32a(+)－D-C-G3/BL21转化平板上挑取4个单克隆菌落接种至 0.5mlLB(含Amp100ng/ml)中摇床培养3.5h后，取出100μl接至700μlLB (Amp)离心管中培养4h后加200μl甘油制备甘油菌种；余菌液加IPTG至终浓 度1mM诱导培养3.5h后取300μl菌液10000rpm离心1分钟，弃上清，加2× SDS点样液25μl及0.01PBS25μl，混匀，制成SDS样品。收集空菌BL21培养 液同样比例制成SDS样品。
2.4.3SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达
制备12％SDS聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品及低分子量标准蛋白沸水浴5分 钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝进入分离胶后提高至12V/cm，直至溴酚 蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰 醋酸溶液中脱色3-4小时。
2.5融合蛋白D-C-G3的大量表达及纯化
2.5.1表达
将pET-32a(+)－D-C-G3/BL21甘油菌种500μl接至50mlLB(含Amp)培养 过夜，再转至500mlLB中3.5h37℃摇床培养3.5h后加1mol/l的IPTG500μl诱 导培养3.5h，取出分装250ml离心管中6000rpm4℃离心10分钟，去上清，加入 20ml的0.1mol/l的PBS重悬于50ml离心管中，11000rpm4℃离心20分钟，去 上清，沉淀加入20ml的8mol/l的尿素重悬，4℃过夜。
2.5.2纯化
过夜尿素裂解液11000rpm4℃离心20分钟，取上清过Ni－NTA柱(金属螯 合亲和层析介质(Ni-NTA)购自德国QIAGEN公司)，Ni-NTA柱以8M尿素(pH8.0) 平衡，尿素裂解液上清上柱，8M尿素(pH7.0)洗柱，以8M尿素(pH4.5)洗脱， 收集洗脱峰，0.1MTris中和，以PBS透析，SDS-PAGE分析纯化效果，如图4 所示，可见在40kd有D-C-G3的条带，无明显杂蛋白带。
图4是D-C-G3表达并纯化后的SDS-PAGE结果M：蛋白Marker，分别表示 116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa； 1：D-C融合蛋白；2：D-C-G3融合蛋白；3：PET-32a。
实施例3新型免疫球蛋白进化分子D-C-G3与小鼠IgG四亚类、人IgG、兔IgG、 牛IgG和山羊IgG的结合特性分析
1.与小鼠IgG四亚类的结合：
1.1小鼠IgG四亚类购自Sigma公司，SpA和SpG购自Sigma公司。
1.21mg/ml人多克隆IgG以PBS(pH7.2)透析。取50μL3mg/ml长 臂活化生物素(购自PIERCE公司)加入1mLIgG(1mg/mL)，在室温中 轻微振荡4h后加入透析袋在PBS中4℃透析过夜，透析完后加等量甘 油于-20℃中保存。
1.3D-C-G3、SpA和SpG均调整浓度至1mg/ml后以碳酸盐缓冲液 (pH9.6)1：200稀释包被96孔板，每种蛋白均包被3排复孔，4℃24h 后PBST洗4-5次，封闭液(2％BSA0.05％TWEEN-20)封闭37℃1h后 洗板，生物素标记的IgG以一定浓度开始倍比稀释，最后一孔不加， 37℃45min后洗板，加入亲和素-HRP复合物(购自PIERCE公司)，37 ℃15min，洗板后TMB显色5-10min，2M硫酸终止，酶标仪读取 OD450nm；计算均值和标准差，Excel绘制结合曲线。结果可见D-C-G3 与小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b的结合能力活性远强于天然SpA、SpG 分子，其余小鼠IgG3、人IgG和兔IgG的结合能力与SpA、SpG分 子相似，实验结果见图5。
图5是ELISA检测融合蛋白D-C-G3、SpA和SpG与小鼠IgG四 亚类的结合活性，图5中的标记含义如下：
“－■－”：D-C-G3融合蛋白；“－◆－”：D-C融合蛋白；
“－▲－”：SpA融合蛋白；“－×－”：SpG；
“－-－”：PET-32a融合蛋白。
PET-32a融合蛋白作为对照组，在各图中均是位于最低处的一条接近 与X轴平行的曲线。
2.与人、兔、牛和山羊多克隆IgG的结合：
2.1人、兔、牛和山羊多克隆IgM购自Sigma公司，生物素标记同1.2。
2.2以D-C-G、SpA和SpG分别包板，与生物素标记的IgM结合，方 法同1.3。结果可见D-C-G3和SpG与牛IgG和山羊IgG的结合活性在 各蛋白中占明显优势，远强于SpA、D-C和D-B，尤其是山羊IgG，实 验结果见图6。
图6是ELISA检测融合蛋白D-C-G3、SpA和SpG与人、兔、牛和山羊 四物种IgG结合活性的结果，图6中各曲线标记所代表的物质如下：
“－■－”：D-C-G3融合蛋白；“－◆－”：D-C融合蛋白；
“－▲－”：SpA融合蛋白；“－×－”：SpG；
“－-－”：PET-32a融合蛋白。
PET-32a融合蛋白作为对照组，在图6的各图中均是位于最最低处的 一条接近与X轴平行的曲线。
实施例4应用D-C-G3大规模纯化基因工程抗体、天然抗体和单克隆抗体
1.琼脂糖活化
⑴称4gCNBr-Sepharose4B(购自Pharmacia公司)，用4mMHCl,pH2.5 溶液浸泡15min，再用该溶液反复洗涤5次。
⑵将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以 250ml冷的0.1Mol/LpH9.0NaHCO3抽洗。
2.偶联蛋白
⑴事先将D-C-G3蛋白120mg置于0.1Mol/LpH9.0NaHCO3液中透析数小 时(一般偶联量为10～30mg/g载体)。
⑵将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min内，从抽洗到偶联)，4 ℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。
3.装柱
将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分 钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。以0.2Mol/LpH9.0NaHCO3 (含0.1Mol/LNaCl)洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。用0.01Mol/LpH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，加入0.02％NaN3于4℃保存备用
4.大规模纯化基因工程抗体药物
(1)使用复旦张江生物医药有限公司重组的表达抗Her2的基因工程抗体的 CHO-K1工程细胞株生产基因工程抗体药物。在工程细胞株的构建中，将目 的基因和谷氨酰胺合成酶基因(GS)基因共转染空宿主细胞，利用GS基因 扩增系统，使用(硫氨甲硫氨酸(MSX))作为筛选药物筛选高表达细胞株。 最后进行高表达细胞株的单克隆化、适应无血清悬浮培养，扩增、建库和 用于GMP生产。生物反应器采用NewBrunswickScientificCo.,CELLIGEN PLUS型。工作体积为1.4L；发酵温度为37℃；搅拌转速为150rpm；通过 添加CO2和8％NaHCO3控制pH在7.20；通过环形供气装置(ringsparger) 进行气体供应，控制通气流量在0.1-0.2vvm；通过空气、氧气、氮气控制 溶氧在50％空气饱和度。工程细胞株经悬浮扩增培养后接种至2.2L生物反 应器，经连续灌注培养25天，收获培养上清进行纯化和评价。
(2)基因工程抗体细胞培养液按100倍床体积直接缓慢加入纯化柱，用 0.01Mol/LpH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。
(3)加0.1Mol/LpH3.0甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来 的成分，立即以1Mol/LNaHCO3中和，以免蛋白变性。
(4)以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/LpH7.4PB液或生理盐 水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02％NaN3于4℃保存。防止 冷冻和干裂。纯化的蛋白对PBS透析，－40℃保存。纯化蛋白行SDSPAGE 凝胶电泳分析，可见纯度达90％以上，SDSPAGE凝胶电泳结果见图7。
5.大规模纯化天然抗体
(1)人血清按床体积1/10加样，血清用PBS稀释至浓度为20％，缓慢加入纯 化柱，用0.01Mol/LpH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280 ＜0.02为止。
(2)加0.1Mol/LpH3.0甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下 来的成分，立即以1mol/LNaHCO3中和，以免蛋白变性。
(3)以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/LpH7.4PB液或生理盐 水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02％NaN3于4℃保存。防止 冷冻和干裂。纯化的蛋白对PBS透析，－40℃保存。纯化蛋白进行SDSPAGE 凝胶电泳分析，可见纯度达90％以上，实验结果见图8。
6.大规模纯化单克隆抗体
(1)将抗重组人干扰素－γ单克隆抗体杂交瘤细胞株复苏，该细胞株来源的 详细资料见《重组人γ干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞建株研究》，上海免疫 学杂志，1986年第6卷第6期第35～43，RPMI—1640培养液(购自GIBCO 公司)培养。于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷(购自SIAMA公司)，注射后 第3周内接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml，杂交瘤细胞含量为1.0×107个细胞/ml，种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水， 每隔1～3天取1次，可取10次，所取腹水－40℃保存备用。
(2)单克隆抗体腹水按床体积1/10加样，腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00 ×105转离心30min，去沉淀，将上清缓慢加入纯化柱，用0.01Mol/LpH7.4 PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280小于0.02为止。加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即 以1Mol/LNaHCO3中和至pH7.4。
(3)以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/LpH7.4PB液或生理盐 水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02％NaN3于4℃保存。防止 冷冻和干裂。纯化的蛋白对PBS透析，－40℃保存。纯化蛋白行SDS-PAGE 凝胶电泳分析，可见纯度达90％以上，SDS-PAGE凝胶电泳结果见图9。
实施例5应用D-C-G3ELISA法检测特异抗体
1、D-C-G3分子标记辣根过氧化物酶(HRP)
取10mgHRP(购自SIAMA公司)加1ml0.1mol/L醋酸钠或水溶解，充 分混匀，约5分钟后加0.08mol/LNaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内 20分钟，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21％NaCL 溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇(AR)沉淀醛化酶，离心去上清， 沉淀酶再用6ml80％冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇，沉淀 用pH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2mlD-C-G3，内 含蛋白量20mg左右，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mgNaBH4混 匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％ 饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01mol/LPBS3ml溶解， 置透析袋中用冰冷的生理盐水透析除盐，需换液5次，如有沉淀藉离心除去， 上清呈淡棕色即为酶结合物。加50％甘油，分装保存备用。
2、用HRP标记的D-C-G3分子ELISA检测抗－HCV抗体
购买商用抗－HCVELISA抗体检测试剂盒(上海科华生物技术有限公司)， 按照试剂盒的说明书对280份血液透析患者的血清进行抗－HCV抗体的ELISA检 测，所不同的是将试剂盒中的酶标稀释液重新配置，将原来的酶复合物改换成 HRP标记的D-C-G3分子。具体为：加100μL稀释液于包被抗原的检测板孔内， 再加10μL的检测血清，盖好板盖，置37℃水浴中，保温45min。甩掉板孔内的 血清，用洗液洗五次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。将HRP标记的D-C-G3 分子(1mg/ml)按1：1000加入酶标记抗体稀释液(0.02mol/LpH7.2PBS-0.05 ％吐温-20-0.1％白明胶-5％牛血清白蛋白)中，混匀后，每空加入100μL，置 37℃水浴中，保温45min。甩掉板孔内的酶复合物液，用洗液洗五次，甩净孔内 残液，再在滤纸上拍打吸干。用100μL微量吸液器，每孔加新配制的TMBA 液和B液各100μL，在室温下避光反应大约5～10min，用2mol/L硫酸终止反应。 用酶标测试仪，在波长450nm下，测定各孔OD值。所有标本用抗-HCVELISA 抗体检测试剂盒(上海科华生物技术有限公司)按照试剂盒的说明书进行测定， 与酶复合物改换成HRP标记的D-C-G3分子的测定结果进行比较。结果见表2， 表2中商用抗-HCVELISA抗体检测试剂盒的检测结果记于表中的最后一横行 中，表示在使用商用试剂盒的实验中，一共检测出142例阳性和138例阴性，而 采用本发明的D-C-G3制备的试剂盒检测的结果记于表2的最后一纵列中，有144 例阳性和136例阴性。在商用试剂盒检测为阳性的142例结果中有一例被本发明 的D-C-G3检测为阴性，在商用试剂盒检测为阴性的138例结果中有3例被本发 明的D-C-G3检测为阴性。其余的病例的阳性或阴性的检测结果与商用试剂盒一 致。
经计算，应用HRP标记的D-C-G3分子ELISA检测抗-HCV抗体的检测结果 与商用试剂盒的检测结果相比敏感度达到99.3％，特异性达97.8％，总符合率达 到98.9％，说明HRP标记的D-C-G3分子完全达到了商用化的检测要求。
表2HRP标记的D-C-G3分子ELISA检测抗-HCV抗体与商用试剂盒检测结果比较
阳性(科华) 阴性(科华) 阳性(D-C-G3) 141 3 144 阴性(D-C-G3) 1 135 136 142 138 280
实施例6应用D-C-G3免疫层析法检测特异抗体
1、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶
取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸 三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮 沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积。
2、D-C-G3标记胶体金
①用0.1mol/LK2C03或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH6.0。
②于100ml金溶胶中加入2～3mlD-C-G3蛋白(10mg/ml)，搅拌2～3分 钟。
③加入5ml1％PEG20000溶液。
④于10000～100000g离心30～60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件)， 小心吸去上清液。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mlPEG20000的缓冲液中，离心沉 淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1cm/540nm＝1.5左右为宜，以 0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。
3、免疫层析测试条的制备
测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分 附着有胶体金免疫复合物；在硝酸纤维素膜上用HCV抗原，HCV抗原有5种，分 别是CoreAg+NS4Ag；NS5Ag；NS4Ag；NS3Ag以及CoreAg，浓度均为1.5mg/L， 以及chickenanti-ProteinA，浓度为1mg/L，划线，线宽1mm，以5种HCV抗 原作为检测线，以chickenanti-ProteinA作为对照线，晾干，用50g/LBSA 封闭2h，以0.01mol/L的PBS洗涤3次，干燥后依次粘于作为支持物的白色塑 料片上，切成0.5cm×10cm的试条，加干燥剂密封保存。制备的抗－HCV免疫层 析测试条见图10。
图10中各标号的含义如下：
A：HCVAb阴性血样检测结果；B：空白对照；C、D：HCVAb阳性血样检测 结果；1：chickenanti-Protein；A2：CoreAg+NS4；Ag3：NS5；Ag4：NS4； Ag5：NS3；Ag6：CoreAg。其中，CoreAg表示丙肝病毒的核心抗原；NS指丙 肝病毒的非结构蛋白,nonstructureprotein；Ag表示抗原(antigen的缩写)。 12是点样孔。
4、抗HCV检测
将0.1～0.2mL血清点加在测试条含有金标记物的一端的点样孔12即可。结 果判定：以测试条硝酸纤维素膜上出现两条以上红色条带为抗Hp-CagAIgG阳性； 仅在靠近吸水滤纸端的对照线处出现一条红色条带为阴性。如果无红色条带出现 则视为试剂失效。结果确定时间：强阳性标本在5min内即可在检测线处见到红 色胶体金颗粒聚集；弱阳性标本约需要10min确定。用该抗－HCV免疫层析测试 条对380份血液透析患者的血清进行抗－HCV抗体检测，并用商用抗－HCVELISA 抗体检测试剂(上海科华生物技术有限公司)作对照，结果见表2，表2中商用 抗-HCVELISA抗体检测试剂盒的检测结果记于表中的最后一横行中，表示在使 用商用试剂盒的实验中，一共检测出144例阳性和136例阴性，而采用本发明的 D-C-G3制备的胶体金试纸检测的结果记于表中最后一列，其中有141例阳性和 139例阴性。在商用试剂盒检测为阳性的144例结果中有5例被本发明的D-C-G3 检测为阴性，在商用试剂盒检测为阴性的136例结果中有2例被本发明的D-C-G3 检测为阳性。其余的病例的阳性或阴性的检测结果与商用试剂盒一致。
经计算，免疫层析测试条检测抗-HCV抗体的检测结果与商用试剂盒的检测 结果相比，敏感度达到96.5％，特异性达98.5％，总符合率达到98.2％，说明 D-C-G3制备的抗-HCV免疫层析测试条完全达到了实用化的检测要求。
表3D-C-G3制备的抗-HCV免疫层析测试条与商用试剂盒检测结果的比较
阳性(科华) 阴性(科华) 阳性(D-C-G3层析条) 139 2 141 阴性(D-C-G3层析条) 5 134 139 144 136 280