漂白酶和含有它们的洗涤剂组合物 【技术领域】
本发明一般涉及漂白酶。本发明特别涉及能生成漂白化学物质并且对存在于织物污点中的无色化合物有高结合亲合力的漂白酶。本发明还涉及含有所述酶的洗涤剂组合物，和漂白织物上的污点的方法。
发明背景和现有技术
含有漂白酶的洗涤剂组合物在现有技术中已有记载。例如，GB-A-2 101 167(Unilever)公开了呈过氧化氢生成系统形式的酶漂白组合物，其中包含C1-C4链烷醇氧化酶和C1-C4链烷醇。这样的酶漂白组合物可用在洗涤织物的洗涤剂组合物中，在洗涤剂组合物中，酶漂白组合物可提供低温酶漂白系统。在洗涤液体中，链烷醇氧化酶催化溶解的分子氧与链烷醇之间的反应以形成醛和过氧化氢。为了在低温例如在15-55℃获得显著的漂白效果，必须利用漂白活化剂将过氧化氢激活。现在最常用的漂白活化剂是四乙酰基乙二胺(TAED)，TAED通过与过氧化氢反应而生成过乙酸，过乙酸是实际起作用的漂白剂。
虽然现有技术中已经提出了这种以及其它几种酶漂白系统，但是仍然需要可供选择的或改进的酶漂白系统。特别是，酶漂白系统应当能够漂白否则难以除去的污点—所谓的“难处理污点”例如番茄、茶叶、黑莓汁、或红酒。这种污点需要大量漂白剂来除去它们，这可能会给衣服的颜色带来不利影响。
在常规洗衣漂白系统中，不论“难处理污点”存在与否，织物都是均匀地暴露于相同浓度的漂白剂下。此外，用可能包含相当高浓度漂白剂的常规漂白系统反复洗涤有可能损害衣服例如使衣服褪色。
因此本发明的目的是，提供可供选择地或改进的酶漂白系统，所述酶漂白系统应当特别能够漂白否则难以除去的污点，并且优选在其漂白作用方面有更强的选择性。本发明的另一目的是提供漂白织物污点的可供选择或改进的酶促方法。
我们已经惊奇地发现，通过使用本发明漂白酶可以控制酶促漂白过程中的漂白反应，本发明漂白酶能生成漂白化学物质，并且对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力，所述无色化合物具有至少为100、优选至少为1000的分子量。甚至更优选的是，所述无色化合物具有至少为5000的分子量，无色化合物特别优选具有至少为10000的分子量。本发明漂白酶优选包含偶联到对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力的试剂上的、能够生成漂白化学物质的酶部分。
本发明新的漂白酶可特别用于处理仅偶而存在的“难处理污点”例如水果和蔬菜汁。这些污点在大多数衣服上未存在，并且当其存在时，它们可能存在于和平常污点例如在衣领和袖口存在的污点不同的部位上。依据本发明，可将新的漂白酶的使用浓度最佳化，以使得仅在存在污点时才达到漂白剂的阈值浓度，并且新的漂白酶结合并积聚到所述污点上。当这样时，高的局部酶浓度在接近污点处产生高的局部漂白剂浓度，由此在需要漂白的部位施加选择性的漂白作用。因此，衣服的未沾污部分(通常是大部分)没有暴露于高水平的漂白剂下，从而保护了织物不受与漂白剂有关的破坏。此外，当同一件衣服又一次被沾污例如具有水果或蔬菜污点时，其可能在该衣服的不同部位。因此，这样是将衣服的不同部位暴露于高水平漂白剂下。这样可减轻或完全消除与常规漂白系统中数次洗涤有关的问题例如褪色。这与其中在每次洗涤中，不论难处理污点存在与否都将所有衣服均匀地暴露于高浓度漂白剂下的常规洗涤系统形成了鲜明对照。
本发明的定义
依据本发明第一个方面，本发明提供了能生成漂白化学物质并对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力的漂白酶，所述无色化合物具有至少为100、优选至少为1000的分子量。本发明漂白酶优选包含偶联到对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力的试剂上的、能够生成漂白化学物质的酶部分。
依据第二个方面，本发明提供了含有一种或多种表面活性剂和本发明漂白酶的酶漂白组合物。
依据第三个方面，本发明提供了漂白织物上存在的污点的方法，其中将沾污的织物与包含本发明漂白酶的溶液接触。
本发明的描述1.漂白酶
在第一个方面，本发明涉及能生成漂白化学物质并对织物上存在的污点有高亲和力的漂白酶。本发明漂白酶优选包含偶联到对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力的试剂上的、能够生成漂白化学物质的酶部分。所述无色化合物具有至少为100、优选至少为1000、更优选至少为5000的分子量。所述无色化合物特别优选具有至少为10000的分子量。1.1能生成漂白化学物质的酶部分。
漂白化学物质可以是由酶生成的过氧化氢。用于生成漂白化学物质的酶或者酶促过氧化氢生成系统可大体上选自在现有技术中公开的多种酶促过氧化氢生成系统。例如，可使用胺氧化酶和胺；氨基酸氧化酶和氨基酸；胆固醇氧化酶和胆固醇；尿酸氧化酶和尿酸；或者黄嘌呤氧化酶与黄嘌呤。或者，可使用C1-C4链烷醇氧化酶和C1-C4链烷醇的组合，甲醇氧化酶与乙醇的组合是特别优选的。甲醇氧化酶优选从过氧化氢酶阴性多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)菌株分离得到(参见例如EP-A-244 920(Unilever))。优选的氧化酶是葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和醇氧化酶。
过氧化氢生成酶可以与生成过乙酸的活化剂联合使用。这样的活化剂是本领域众所周知的。其实例包括四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰氧基苯磺酸钠(SNOBS)。Grime和Clauss在Chemistry＆Industry(1990，10，15)647-653中更详细地描述了这些和其它相关化合物。或者，可以将过渡金属催化剂与过氧化氢生成酶联合使用以提高漂白效力。Hage等人(1994)Nature 369，637-639中描述了锰催化剂的实例。
或者，漂白化学物质是次卤酸盐，酶部分相应地为卤素过氧化物酶。优选的卤素过氧化物酶是氯过氧化物酶。相应的漂白化学物质是次氯酸盐。尤其优选的氯过氧化物酶是钒氯过氧化物酶，例如得自不等弯孢(Curvularia inaequalis)的钒氯过氧化物酶。
或者，可使用过氧化物酶或漆酶。当使用这样的酶时，漂白分子得自与该酶反应的增强剂分子。WO-A-95/01426中公开了漆酶/增强剂系统的实例。WO-A97/11217中描述了过氧化物酶/增强剂系统的实例。1.2具有高结合亲和力的部分。
本发明新的漂白酶对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力，所述无色化合物具有至少为100、优选至少为1000、更优选至少为5000道尔顿的分子量。应当理解，所述无色化合物还可具有至少为10000、100000或甚至1000000道尔顿或更多的更高分子量。可能是漂白酶的一部分多肽链使得其具有结合亲和力，也可能漂白酶包含偶联到对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力的试剂上的、能够生成漂白化学物质的酶部分。对于第一种情形，漂白酶可以是包含可通过连接头偶联的两个结构域的融合蛋白。对于第二种情形，具有高结合亲和力的试剂可通过二价偶联剂例如戊二醛共价偶联到生成漂白化学物质的酶部分上。Greg T.Hermanson在″Bioconjugate techniques″，Academic Press Inc(1986)中描述了关于适用于偶联两个生物分子的化学的全面综述。或者，如果具有高结合亲和力的试剂是肽或蛋白，其也可以通过构建融合蛋白来偶联到酶上。在这样的构建物中，在结合试剂与酶之间一般有肽接头。Ducancel等人在Bio/technology 11，601-605中描述了酶与结合试剂融合的实例。
在进一步的实施方案中，具有高结合亲和力的试剂是双特异性试剂，其中包含一个对织物污点中存在的无色化合物的特异性，所示无色化合物具有至少为1000、优选至少为5000、更优选为至少10000的分子量。这样的试剂可通过下述方式满足酶在污点上积聚的需要：将所述试剂与酶一起作为预形成的非共价复合物来提供，或者单独提供二者，并使它们在洗涤液体中或者在污点上自我装配。
本发明新的漂白酶的基础是存在对织物污点中存在的无色化合物有高结合亲和力的部分，所述无色化合物具有至少为100、优选至少为1000、更优选至少为5000的分子量。
分子A与另一分子B结合的程度一般可通过得自下述反应的化学平衡常数Kd表示：[A]+[B]⇔[A≡B]]]>
化学平衡常数Kd如下得出：Kd=[A]×[B][A≡B]]]>
通过比较分子与沾污材料(即处理材料以结合到污点组分上)的结合(Kd值)相对于分子与未沾污(即未处理)材料的结合之间的差异，可判断该分子与织物污点中存在的无色化合物的结合是特异性的还是非特异性的。对于在洗衣中的应用，所述材料是织物例如棉花或聚酯。然而，在其它材料例如聚苯乙烯微量滴定板或分析生物传感器中的特化表面上测定Kd值和Kd值差异通常更方便。这两个结合常数之间的差异应当最小为10，优选大于100，更优选大于1000。化合物一般应当以低于10-4M、优选低于10-6M的Kd结合污点或沾污的材料，并且该Kd可以为10-10M或甚至更低。较高的结合亲和力(Kd低于10-5M)和/或较大的无色物质与本底物质结合之间的差异可提高漂白过程的选择性。而且可提高整个洗涤剂组合物中的分子量效率，并需要较少量的分子。
可想到能特异性结合欲漂白污点中存在的无色化合物的几类分子。在下文中我们给出具有这种能力的分子的多个实例，但这并非穷举。1.2.1.抗体。
抗体是能特异性结合它们所抗的化合物的分子的众所周知的实例。抗体可源自几个来源。从小鼠中可获得具有非常高的结合亲和力的单克隆抗体。由这些抗体可制得保持其结合特性的Fab、Fv或scFv片段。这样的抗体或片段可经由重组DNA技术通过微生物发酵而制得。用于制备抗体及其片段的众所周知的宿主是酵母、霉菌或细菌。
一类值得特别关注的抗体是通过如在骆驼科动物例如骆驼或美洲驼中发现的重链抗体形成的。这些抗体的结合域由一个多肽片段，即重链多肽的可变区(HC-V)构成。与之相反，在典型抗体(鼠、人等)中，结合域由两条多肽链(重链(Vh)和轻链(Vl)的可变区)组成。WO-A-94/04678(Casterman和Hamers)和WO-A94/25591(Unilever和Free University of Brussels)中描述了从骆驼科动物获得重链免疫球蛋白或其(功能化)片段的方法。
或者，结合域可通过称为″camelization″的方法从典型抗体的Vh片断获得。据此通过替代多个氨基酸将标准Vh片断转化成HC-V样片断，从而保持了其结合特性。Riechmann等人在多个出版物(J.Mol.Biol.(1996)259，957-969；Protein.Eng.(1996)9，531-537，Bio/Technology(1995)13，475-479)中描述了该方法。如WO-A-94/29457(Unilever)所述，HC-V片断可通过重组DNA技术在多种微生物宿主(细菌、酵母、霉菌)中制得。
制备包含酶和抗体或者包含酶和抗体片断的融合蛋白的方法是本领域内已知的。Neuberger和Rabbits(EP-A-194 276)描述了一种方法。WO-A-94/25591中描述了制备包含酶和得自骆驼科动物抗体的抗体片断的融合蛋白的方法。Holliger等人在(1993)PNAS90，6444-6448中描述了制备双特异性抗体片断的方法。
抗体结合行为特别有吸引力的特征是据报道其结合一″类″在结构上相关的分子的能力。例如，Gani等人(J.Steroid Biochem.Molec.Biol.48，277-282)描述了之所以产生是为了抗孕酮、但是也结合在结构上相关的甾体化合物、孕二酮、孕烷醇酮和6-羟基孕酮的抗体。因此，使用同一方法，可分离到能结合所有的一″类″污点发色团(例如如下所述的多元酚、卟啉或类胡萝卜素)的抗体。可使用广谱作用抗体例如上述这种抗体以与漂白酶偶联来处理几种不同污点。1.2.2.肽。
肽对目的物质的结合亲和力通常比抗体低。虽然如此，仔细选择或设计的肽结合能力可足以在氧化过程中提供所需的选择性。能选择性地结合欲氧化物质的肽可例如由已知能结合特定物质的蛋白制得。这样的肽的实例可以是从抗这种物质的抗体萃取获得的结合区。其它实例是已知能结合葡萄酒中的多元酚的富含脯氨酸的肽。
或者，结合这种物质的肽可通过使用肽组合文库来获得。这样的文库可包含最高达1010个肽，从中可分离到具有所需结合特性的肽(R.A.Houghten，Trends in Genetics，Vol 9，no&，235-239)。现有技术中已描述了该方法的几个实施方案(J.Scott等人，Science(1990)249，386-390；Fodor等人，Science(1991)251，767-773；K.Lam等人，Nature(1991)354，82-84；R.A.Houghten等人，Nature(1991)354，84-86)。
合适的肽可通过有机合成，使用例如Merrifield方法(Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)制得。或者，肽可通过重组DNA技术在微生物宿主(酵母、霉菌、细菌)中制得(K.N.Faber等人。(1996)Appl.Microbiol.Biotechnol.45，72-79)。1.2.3.肽模拟物。
为了改善肽的稳定性和/或结合性质，可通过掺入非天然氨基酸和/或氨基酸之间的非天然化学连接将肽分子修饰。这样的分子称为肽模拟物(H.U.Saragovi等人。(1991)Bio/Technology 10，773-778；S.Chen等人。(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5872-5876)。这种化合物的制备受化学合成的限制。1.2.4.其它有机分子。
可很容易想到，可以找到具有所需结合特性、能选择性地结合欲氧化物质、无需与肽、蛋白或其衍生物相关的其它分子结构。例如，据表明一些聚合RNA分子能结合小的合成染料分子(A.Ellington等人.(1990)Nature 346，818-822)。这样的结合化合物可通过组合方法，例如关于肽的组合方法(L.B.McGown等人。(1995)，Analytical Chemistry，663A-668A)获得。
该方法还可应用于纯的非聚合有机化合物。现有技术中描述过关于这样的化合物的组合合成方法和对所需结合性质的选择(Weber等人。(1995)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34，2280-2282；G.Lowe(1995)，Chemical Society Reviews 24，309-317；L.A.Thompson等人。(1996)Chem.Rev.96，550-600)。一旦确定了合适的结合化合物，即可通过有机合成以较大规模制备它们。1.3织物污点中存在的无色化合物
对于洗衣应用，可想得出准备将其漂白的几类有色物质，特别是在织物上作为污点存在的有色物质可作为漂白对象。人们发现，漂白酶不直接以这样的有色污点为目标，而是以自身无色、但是参与污点形成的大分子化合物为目标是有利的。这样的大分子化合物的优点是它们可具有更强的致免疫性质，即更易于产生抗它们的抗体。此外，它们比分子量通常很小的有色物质更接近污点的表面。需要着重强调的是，虽然许多污点是由不同成分形成的，但是在各种各样的污点中通常都存在一些无色化合物。
在本发明上下文中，无色化合物定义为在下述条件下光密度(或吸附)低于0.2、优选低于0.05的化合物：以纯化形式在溶液中，并且在校正效应例如光散射后，对于可见光谱中的所有波长(即325nm-900nm)，并且对于1cm的光程，以1mg/ml的浓度在溶液中。
本发明重要的实施方案是使用能结合一类″污点物质″中的几种不同的但是在结构上相关的无色分子的结合分子(如上所述)。这样做的优点是能使一种酶结合(并漂白)几种不同的污点。参与污点形成的无色化合物的几类实例如下：1.3.1.果胶。
果胶是一组富含D-半乳糖醛酸的不同种类的多糖。果胶是植物细胞的细胞壁基质中最重要的成分。关于果胶的综述参见A.Jauneau等人.(1998)Int.J.Plant Sci.159(1)1-13。1.3.2.β-乳球蛋白
β-乳球蛋白(BLG)是各种动物包括牛、绵羊、山羊、马、和猪的奶中的主要乳清蛋白。关于β-乳球蛋白的综述参见J.Godovac-Zimmermann和G.Braunitzer(1987)Milchwissenschaft 42(5)294-297。2.洗涤剂组合物。
本发明漂白酶可用于特别适于污点漂白的衣服洗涤组合物中，这构成了本发明的第二个方面。为此，组合物包含一种或多种表面活性剂并任选包含其它常用洗涤组分。在第二个方面，本发明提供了酶洗涤剂组合物，其中包含占洗涤剂组合物总重量0.1-50％的一种或多种表面活性剂。该表面活性剂体系可包含0-95％重量的一种或多种阴离子表面活性剂和5-100％重量的一种或多种非离子表面活性剂。该表面活性剂体系还可包含两性或两性离子洗涤化合物，但是由于其较高的成本这不是正常需要。人们发现，在这种组合物中还加入阳离子表面活性剂是有利的。WO-A-97/03160和WO-A-98/17767(Procter＆Gamble)中给出了合适的阳离子表面活性剂的实例。
一般，该表面活性剂体系的非离子和阴离子表面活性剂可选自在″Surface Active Agents″Vol.1，Schwartz&Perry；Interscience1949，Vol.2 Schwartz，Perry＆Berch；Interscience 1958，Manufacturing Confectioners Company出版的当前版本的″McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents″，或″Tenside-Taschenbuch″，H.Stache，2nd Edn.，Carl Hauser Verlag，1981中描述的表面活性剂。
可使用的合适的非离子洗涤化合物特别包括具有疏水基团和反应性氢原子的化合物例如脂族醇、酸、酰胺或烷基苯酚与烯化氧尤其是单独的氧化乙烯或者氧化乙烯和氧化丙烯的反应产物。特定的非离子洗涤化合物是C6-C22烷基苯酚-氧化乙烯缩合物，通常每个分子有5-25个E0，即5-25个氧化乙烯单元，和脂族C8-C18伯或仲直链或支链醇与氧化乙烯的缩合产物，通常每个分子有5-40个EO。
可使用的合适的阴离子洗涤化合物通常是具有包含约8-约22个碳原子的烷基的有机硫酸酯和磺酸酯的水溶性碱金属盐，所用术语烷基包括高级酰基的烷基部分。合适的合成阴离子洗涤化合物的实例有烷基硫酸钠和钾，尤其是通过将由例如牛脂或椰子油制得的高级C8-C18醇硫酸化而获得的这样的洗涤化合物，烷基C9-C20苯磺酸钠和钾，特别是直链仲烷基C10-C15苯磺酸钠；和烷基甘油基醚硫酸钠，尤其是得自牛脂或椰子油的高级醇和得自石油的合成醇的这样的醚。优选的阴离子洗涤化合物是C11-C15烷基苯磺酸钠和C12-C18烷基硫酸钠。还适用的有例如在EP-A328 177(Unilever)中描述的表现出抗盐析作用的表面活性剂，在EP-A-070 074中描述的烷基多糖苷表面活性剂，和烷基单糖苷。
优选的表面活性剂体系是阴离子与非离子洗涤活性物质的混合物，特别是在EP-A-346 995(Unilever)中指出的阴离子和非离子表面活性剂的组和实例。C16-C18伯醇硫酸酯的碱金属盐与C12-C15伯醇3-7 EO乙氧基化物的混合物是特别优选的表面活性剂体系。
非离子洗涤剂优选以占表面活性剂体系重量的10％以上、例如25-90％的量存在。阴离子表面活性剂可以以例如占表面活性剂体系重量的约5％-约40％的量存在。
本发明洗涤剂组合物可呈任意合适的物理形式，例如粉末、片、含水或非水液体、糊或凝胶。本发明酶漂白洗涤组合物一般是在水中稀释至约0.05-2％后再使用。
在本发明中使用的漂白酶可以以任意合适的形式，即颗粒组合物的形式、酶的液体或浆液的形式，或者与载体材料(例如EP-A-258 068中描述的载体，和Novo Nordisk的Savinase(TM)以及Lipolase(TM)产品)一起有用地加到洗涤剂组合物中。将漂白酶加到液体洗涤剂产品中的良好途径是以在乙氧基化醇非离子表面活性剂例如在EP-A-450 702(Unilever)中描述的非离子表面活性剂中含有0.5-50％重量漂白酶的浆液的形式加入。
本发明酶漂白组合物含有约0.001-10毫克活性漂白酶/升。洗涤剂组合物含有约0.001％-1％活性酶(w/w)。
酶活性可以以单位表示。例如，对于葡萄糖氧化酶，1个单位将在pH 6.5和30℃把1μmol β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸内酯和H2O2/分钟。加到酶漂白组合物中的酶活性为约2.0-4000个单位/升(洗涤液体)。
在下述非限制性实施例中进一步举例说明本发明。在这些实施例中，描述了两类分析实验。第一类实验(如在实施例1、2和5中描述的)包括使用专门设计用来研究抗体结合的表面：微量滴定板。这些实验研究在污点的其它成分存在下，污点的无色成分例如水果和蔬菜中的果胶或奶饮料中的β-乳球蛋白是否被抗体特异性地结合。在这些实验中，有时将沾污物质稀释许多倍以使抗体结合特异性最佳化。当采用微量滴定板分析进行时这是标准操作，因为该技术的灵敏度非常高，并且当使用少量样本时其运行得非常好。此外，由于微量滴定板的表面已被专门设计用来吸附生物活性物质并具有非常低的非特异性结合作用，这些实验能特别好地检查抗体特异性。
在第二类分析实验(如实施例4和6所述)中，用沾污材料例如蕃茄酱或奶茶在很象“真正的”沾污、即未稀释沾污材料的条件下将棉花布片样本沾污。这些实验研究当结合到棉花多孔结构上时无色成分是否易于被抗体结合，以及将棉花浸泡在表面活性剂中后无色成分是否仍然保持与棉花的结合。与有色成分相反，仅通过视觉观察不能断定无色分子是否结合到棉花上。因此，需要特定的结合探针(例如抗体)来确定无色分子是否存在。不象微量滴定板，棉花没有专门设计用来免疫测定，因此预计背景信号可能会更高。虽然如此，但是对于在洗衣产品中的应用，分析置于棉花上的沾污标记分子仍然极其重要。
将这两类实验的结果结合在一起，我们发现(在我们看来令人惊奇)常见沾污的一些无色成分易于吸附到表面上，并且可被抗体特异性地结合，即使在充分洗涤和浸泡在表面活性剂中之后亦是如此。此外，本文描述的这两个实验方法由于a)易于被抗体结合，和b)在表面活性剂存在下仍能保持附着在表面上而可用于定义其他可用于本发明的污点中的无色标记分子。
最后，由于已经确定了在表面活性剂存在下特定的标记分子易于并保持附着在棉花上，因此可以评价使用对所述标记分子有特并结合亲和力的抗体/氧化酶偶联物处理污点的效果。实施例8中描述了这样的实验。
实施例1果胶特异性抗体结合到用番茄产品致敏的微量滴定板上。
使用对果胶有特异性、并称为“JIM5”的大鼠单克隆抗体(K.A.VandenBosch等人。EMBO Journal vol.8 no.2 pp.335-342，1989；J.P.Knox等人。Planta(1990)181：512-521)。然而，也可以使用能结合果胶的其它抗体。如果通过接种产生抗体的方法是已知的。参见例如上述K.A.VandenBosch等人的文献，和F.Liners等人。Plant Physiol.(1989)91，1419-1424。在该实施例中使用的抗体制备物是培养物上清液，该上清液是John Innes Centre，Norwich，U.K.赠送的。
将蕃茄酱(H.J.Heinz Co Ltd.Hayes，U.K.)和过筛的番茄(Valfrutta)在磷酸盐缓冲盐水—pBS[0.01M Na2HPO4/NaH2PO4，0.15M NaCl(pH7)]中稀释大约1000倍。把稀释的番茄样本加到微量滴定板(高容量，平底ELISA板；Greiner Labortechnik)的孔中，用气密塑料封条密封，在37℃培养48小时。仅用PBS处理一些孔以用作阴性对照。
使用自动微量滴定板洗涤器用PBST[PBS＋0.15％吐温20(Sigma)]洗涤这些致敏的平板。然后将一系列稀释的JIM5制备物(在PBST中稀释)加到孔中，并在室温培养1小时。用阴性培养物上清液(不含JIM5)或者仅用PBST处理对照孔。
如上所述洗涤平板，然后将绵羊抗-大鼠IgG/碱性磷酸酶偶联物(Serotec Product No AARO2A)加到孔中。将偶联物在PBST中稀释1000倍，并在孔中于室温培养1小时。
如上所述洗涤平板，然后加入底物缓冲液[1mg/ml对硝基苯基磷酸盐(pNPP)，在1M二乙胺(pH 9.8)中；1mM MgCl2]。5分钟后，在自动平板计数器中于405nm读取信号。
所得结果如下表1所示，结果是在405nm记录的光密度或“信号”—信号越强，结合到表面上的抗体就越多。
表1
施加的抗体试剂致敏 JIM5/10 JIM5/100 JIM5/1000 无 NC/10过筛的番茄 1.2 0.89 0.16 0.01 0.01蕃茄酱 0.98 0.71 0.15 0.00 0.00无 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01JIM5/10＝在PBST中稀释10倍的JIM5培养物JIM5/100＝在PBST中稀释100倍的JIM5培养物JIM5/1000＝在PBST中稀释1000倍的JIM5培养物NC/10＝在PBST中稀释10倍的阴性培养物
这些结果表明，JIM5可特异性地结合吸附在微量滴定板上的这两种番茄产品。因此，从中可推知，即使用含有表面活性剂的液体(PBST)洗涤表面后，果胶也以易于被结合的形式保持结合在表面上。
实施例2果胶特异性抗体结合到用橙汁致敏的微量滴定板上.
将纯的未加糖橙汁(Safeway)在磷酸盐缓冲盐水—PBS[0.01MNa2HPO4/NaH2PO4，0.15M NaCl(pH7)]中稀释大约1000倍。把稀释的橙汁样本加到微量滴定板(Greiner，高容量)的孔中，用气密塑料封条密封，在37℃培养。仅用PBS处理一些孔以用作阴性对照。
使用自动微量滴定板洗涤器用PBST[PBS＋0.15％吐温20(Sigma)]洗涤这些致敏的平板。然后将一系列稀释的JIM5制备物(在PBST中稀释)加到孔中，并在室温培养1.5小时。用阴性培养物上清液(不含JIM5)、在PBS中稀释至最高达4μg/ml的非特异性大鼠单克隆抗体(Serotec产品PRPO4)或者仅用PBST处理对照孔。
如上所述洗涤平板，然后将绵羊抗-大鼠IgG/碱性磷酸酶偶联物(Serotec Product No AARO2A)加到孔中。将偶联物在PBST中稀释1000倍，并在孔中于室温培养1小时。如上所述洗涤平板，然后加入底物缓冲液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2]。40分钟后，在自动平板计数器中于405nm读取信号。
所得结果如下表2和3所示，结果是在405nm记录的光密度或“信号”—信号越强，结合到表面上的抗体就越多。
表2
施加的抗体试剂致敏 JIM5/10 JIM5/40 JIM5/160 JIM5/640橙汁 1.37 0.63 0.17 0.05无 0.06 0.06 0.07 0.07JIM5/10＝在PBST中稀释10倍的JIM5培养物JIM5/40＝在PBST中稀释40倍的JIM5培养物JIM5/160＝在PBST中稀释160倍的JIM5培养物JIM5/640＝在PBST中稀释640倍的JIM5培养物
表3
施加的阴性对照致敏 无 NC/10 NAb橙汁 0.02 0.02 0.03无 0.07 0.07 0.08无＝仅PBSTNC/10＝在PBST中稀释10倍的阴性培养物NAb＝在PBST中浓度为4μg/ml的非特异性大鼠单克隆抗体
实施例3从培养物上清液中纯化JIM5.
用装配有超滤膜(Amicon PM30)的搅拌池(Amicon)将500ml澄清的培养物浓缩至大约12ml。将该浓缩物加到G蛋白″Hi-Trap″柱(Pharmacia)上。然后用PBS洗涤该柱以除去非特异性结合的物质。然后通过用0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.5)洗涤该柱来特异性地洗脱JIM5抗体。立即用1/20体积的3M tris(pH8.8)将解吸的级分中和。把中和的级分在PBS中透析。通过在280nm测定吸收度来确定收集的抗体，假定对于1mg/ml蛋白的浓度，消光系数为1.4。
实施例4纯化的果胶特异性抗体结合到用番茄沾污的棉花布片样本上。
从白色脱浆(desized)棉花织物上剪下18块1cm×1cm棉花布片样本，并用″B″型铅笔作上标志以使其可以区分。通过把6片布片样本浸在蕃茄酱(Heinz)中并在密封的Petri皿中于37℃培养过夜来将其沾污。通过把6片布片样本浸在过筛的番茄(Valfrutta)中并在密封管中于37℃培养过夜来将其沾污。6片布片样本未沾污。
将沾污的布片样本预洗涤，以使得污点变成典型的“残留污点”，即模糊但是持久的污点。根据污点类型，将布片样本分6批预洗涤，以将不同批之间的沾污材料的交叉沾污降到最低限度。用蒸馏水清洗布片样本以除去过剩的番茄，然后将其在3×100ml洗涤缓冲液(PBS+0.2％Co-Co 6.5EO)中剧烈洗涤。用茶叶过滤器从各洗涤液中回收它们。洗涤3次后，将其在纸巾上吸干。
然后将布片样本置于含有2ml其中的抗体浓度为5μg/ml的洗涤缓冲液的塑料管中。抗体是纯化的JIM5(如实施例3中所述的)或同一亚类的非特异性大鼠单克隆抗体(Serotec产品号PRPO4)。根据污点类型，将每一类型布片样本保持分隔以把交叉沾污降到最低限度。由此总共有6个管，每个管中包含3片布片样本，如下表4所述，在各个管中的每片布片样本接受相同处理。
表4管 抗体 污点1 JIM5 蕃茄酱2 JIM5 过筛的番茄3 JIM5 无4 非特异性 蕃茄酱5 非特异性 过筛的番茄6 非特异性 无
将管在室温培养2小时。用3×100ml洗涤缓冲液洗涤它们，吸干，然后置于偶联物中。偶联物是在洗涤缓冲液中稀释了1000倍的绵羊抗大鼠IgG/碱性磷酸酶偶联物(Serotec产品号AARO2A)。将管在室温再培养2小时。同样将沾污与未沾污的布片样本保持分隔以把沾污材料的交叉沾污降到最低限度。
如上所述将布片样本洗涤并干燥，然后独立地置于1ml底物缓冲液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2)]。将底物加到24-孔培养板(Costar，Cambridge USA)的孔中，把布片样本在室温培养30分钟，然后取出200μl来在微量滴定板读数器中读数。
所得结果如下表5所示，结果是在405 nm记录的光密度或“信号”—信号越强，结合到棉花上的抗体就越多。给出的结果是平行测定的布片样本的结果，因此计算平均数值。
表5抗体污点信号(A405)平均信号JIM5蕃茄酱1.185， 0.942， 1.2141.1JIM5过筛的番茄1.048， 1.052， 0.9471.0JIM5无0.494， 0.581， 0.5390.54非特异性蕃茄酱0.427， 0.394， 0.3480.39非特异性过筛的番茄0.425， 0.429， 0.3540.40非特异性无0.527， 0.463， 0.4420.47
所得结果表明，果胶特异性抗体结合被番茄沾污的布片样本的能力远大于结合未沾污布片样本的能力。因此可以推断，在沾污过程中果胶结合到棉花上，甚至在含有表面活性剂的缓冲液中洗涤数次后仍然有很大的量保持着结合。此外，当结合或者进入棉花的多孔结构中时，果胶肯定易于被抗体结合。
实施例5乳球蛋白特异性抗体结合到用奶茶致敏的微量滴定板上
使用兔子多克隆试剂。这种试剂是如下所述制得的：用β-乳球蛋白B或者″BLG″(Signa产品号L8005)给兔子接种，采集免疫血清，通过抗原亲合色谱法纯化乳球蛋白特异性抗体。S.C.Williams等人[J.Immunological Methods 213(1998)1-17]出版了如何进行该操作的方法。
通过把沸水倒入茶叶袋(Typhoo)上，然后加入奶(Co-op半脂奶)来制备奶茶。将奶茶冷却，然后加到微量滴定板(Greiner，高容量)的孔中，用气密封条密封，在37℃培养48小时。
使用自动微量滴定板洗涤器，用PBST(PBS＋0.15％吐温20)洗涤致敏的平板。然后将一系列稀释的乳球蛋白特异性抗体(在PBST稀释)加到孔中，并在室温培养2小时。用非特异性兔子抗体，即生成来抗不同抗原的抗体(Dako兔子抗小鼠产品号Z259，Dako A/S，Glostrup，Denmark)处理对照孔。其它对照孔仅用PBST处理。
如上所述洗涤平板，然后将山羊抗-兔子IgG/碱性磷酸酶偶联物(Zymed Laboratories Inc，San Fransisco，Product No 62-6122)加到孔中。将该偶联物在PBST中稀释1000倍，然后在室温培养1小时。如上所述洗涤平板，然后加入底物缓冲液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2]。30分钟后，在自动平板计数器中于405nm读取信号。所得结果如下表6所示，结果是在405nm记录的光密度或“信号”—信号越强，结合到表面上的抗体就越多。
表6
施加的抗体试剂致敏 4μg/ml 的抗-BLG 1μg/ml的 抗-BLG 250ng/ml 的抗-BLG 62ng/ml 的抗-BLG 无 4μg/ml 的NAb奶茶 2.12 1.09 0.28 0.07 0.01 0.06抗BLG＝兔子抗-乳球蛋白NAb＝非特异性兔子抗体无＝仅PBST
所得结果表明，当在茶存在下吸附到表面上时，抗-乳球蛋白抗体可结合乳球蛋白(都是特异性结合，并且以剂量依赖方式结合)。
实施例6乳球蛋白特异性抗体结合到用奶茶沾污的棉花布片样本上
从白色脱浆(desized)棉花织物上剪下18块1cm×1cm棉花布片样本，并用″B″型铅笔作上标志以使其可以区分。通过把9片布片样本浸在奶茶(用Typhoo茶叶袋和Co-op半脂奶制得的)中并在密封管中于37℃培养过夜来将其沾污。9片布片样本未沾污。
将沾污的布片样本预洗涤，以使得污点变成典型的“残留污点”，即模糊但是持久的污点。将其在3×100ml洗涤缓冲液(PBS+0.2％Co-Co 6.5EO)中剧烈洗涤。用茶叶过滤器从各洗涤液中回收它们。洗涤3次后，将其在纸巾上吸干。
然后将布片样本置于含有2ml其中的抗体浓度为5μg/ml的洗涤缓冲液的塑料管或仅含洗涤缓冲液的阴性对照管中。抗体是兔子抗乳球蛋白(如实施例5中所述的″抗-BLG″)或非特异性兔子抗体(Dako兔子抗-小鼠，产品号Z259)。根据处理类型，将每一类型布片样本保持分隔以把试剂的交叉沾污降到最低限度。由此总共有6个管，每个管中包含3片布片样本，如下表7所述，在各个管中的每片布片样本接受相同处理。
表7 管 污点 抗体 1 奶茶 BLG-特异性 2 奶茶 非特异性 3 奶茶 无 4 无 BLG-特异性 5 无 非特异性 6 无 无
将管在室温培养1.5小时。用3×100ml洗涤缓冲液洗涤它们，吸干，然后置于偶联物中。偶联物是在洗涤缓冲液中稀释了1000倍的山羊抗大鼠IgG/碱性磷酸酶偶联物(Zymed产品号62-6122)。将管在室温再培养1.5小时。同样将沾污与未沾污的布片样本保持分隔以把沾污材料的交叉沾污降到最低限度。
如上所述将布片样本洗涤并干燥，然后独立地置于1ml底物缓冲液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2)]。将底物加到24-孔细胞培养板(Costar)的孔中，把布片样本在室温培养20分钟，然后取出200μl来在微量滴定板读数器中读数。
所得结果如下表8所示，结果是在405nm记录的光密度或“信号”—信号越强，结合到棉花上的抗体就越多。给出的结果是平行测定的布片样本的结果，因此计算平均数值。
表8污点 抗体 信号(A405) 平均信号奶茶 BLG-特异性0.702， 0.560， 0.586 0.61奶茶 非特异性0.380， 0.288， 0.322 0.33奶茶 无 0.195， 0.165 0.18无 BLG-特异性0.412， 0.298， 0.245 0.32无 非特异性0.375， 0.412， 0.295 0.36无 无0.377， 0.257， 0.329 0.32
所得结果表明，乳球蛋白特异性抗体结合被奶茶沾污的棉花布片样本的能力远大于结合未沾污布片样本的能力。因此可以推断，在沾污过程中乳球蛋白结合到棉花上，甚至在含有表面活性剂的缓冲液中洗涤数次后仍然有很大的量保持着结合。此外，当结合或者进入棉花的多孔结构中时，乳球蛋白肯定易于被抗体结合。
实施例7果胶特异性抗体与葡萄糖氧化酶的偶联
使用大体按照在Carlsson等人.(1978)Biochem.J.173，723-737和″生物偶联技术″Greg T Hermanson，Academic Press(1996)，第70-71页中描述的方法的方案将抗体化学偶联到酶上。还有几种用于偶联两种活性蛋白的本领域内众所周知的其它方法。所用精确方案的详述在下面的实施例中给出。用″SAMSA″衍化抗体
将纯化的JIM5抗体(如实施例3中所述的)浓缩至6.4mg/ml，并用″Centricon 30″超滤管(Millipore)在0.1 M NaH2PO4，pH6.5中进行缓冲交换。将40μl该抗体制备物置于玻璃反应瓶中。配制″SAMSA″[S-乙酰基巯基琥珀酸酐(Sigma产品号A1251)]溶液。该SAMSA溶液是在DMF[二甲基甲酰胺]中的10mg/ml溶液。将2μl该SAMSA溶液加到抗体中，把该混合物在室温21℃±1剧烈搅拌30分钟。30分钟后，以5分钟的间隔加入下述溶液：(i)20μl EDTA以稳定衍化的抗体。(ii)100μl 0.1M Tris pH 7.0以调节pH。(iii)100μl 1M NH2OH pH 7.0以把SAMSA脱保护并暴露出硫氢基。
45分钟后，将该混合物补足至2.5ml(用0.1 M NaH2PO4，pH6.5)，并用在0.1 M NaH2PO4＋5mM EDTA pH 6.5中预平衡的PD10柱(Pharamacia)脱盐。通过用3.2ml缓冲液(在0.1 M NaH2PO4＋5mMEDTA pH 6.5中)洗脱该柱来收集衍化的抗体。用＂SPDP＂衍化葡萄糖氧化酶
在0.1 M NaH2PO4(pH 7.5)中配制葡萄糖氧化酶(或″Gox″)XS[Genencor OxyGo HPL 5000(商品级)]，使其浓度为12.8mg/ml。在搅拌下将62.5μl该酶制备物(0.8mg)置于反应瓶中，加入0.5ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.5。配制″SPDP″[3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma产品号P-3415)]的溶液。SPDP在DMSO[二甲基亚砜]中的溶液的浓度为13.15mg/ml。将30.4μl该SPDP溶液加到反应瓶中，将该混合物在室温搅拌30分钟。然后将该混合物补足至2.5ml(用0.1 MNaH2PO4，pH7.5)，并用在0.1 M NaH2PO4pH 6.5中预平衡的PD10柱(Pharamacia)脱盐。通过用3.2ml缓冲液(0.1 M NaH2PO4 pH 6.5)洗脱该柱来收集衍化的酶。衍化的抗体与衍化的葡萄糖氧化酶的反应
将抗体和Gox制备物吸移到单独的centricon 30管(Millipore)内，并以4000 RPM的转速离心直至制备物浓缩至约400μl的体积为止(起始体积为3.2ml)。将135μl Gox制备物与抗体制备物(400μl)在玻璃瓶中混合。将玻璃瓶在4℃放置过夜以进行偶联。
实施例8用果胶特异性抗体/GOx偶联物漂白番茄污点
将脱浆白色棉布浸泡在过筛的番茄(Valfrutta)中并煮沸1小时来将沾污。用冷水洗涤棉布，并在37℃干燥过夜。把干燥的棉布剪成2×2cm的正方形布片样本，并用″洗涤缓冲液II″[PBS+0.0375％Coco 6.5EO，0.0375％Las(pH8.0)]预洗涤以留下残余污点。
向4个玻璃瓶中每瓶加入6片相同的布片样本。然后用1ml不同溶液处理各个玻璃瓶：瓶1仅用洗涤缓冲液II处理；瓶2用在洗涤缓冲液II中稀释的葡萄糖氧化酶″Gox″XS[Genencor OxyGo HPL5000(商品级)]处理；瓶3用在洗涤缓冲液II中稀释的果胶特异性抗体/Gox偶联物(在实施例7中制得的)处理；瓶4用在洗涤缓冲液II中稀释的非特异性抗体/Gox偶联物(包含不结合果胶的抗体)处理。这些酶制备物和偶联物都已经稀释过，因此它们均含有大约等于2.8μg未偶联Gox的酶活性。将玻璃瓶在室温培养2分钟。然后向各瓶中加入8ml洗涤缓冲液II，之后加入90μl 1M葡萄糖。将玻璃瓶反转以把其中的内容物混合，并在37℃放置35分钟(这时瓶2-4含有大约等于300ng/ml未偶联Gox的酶活性)。
取出布片样本并用蒸馏水冲洗。将各组布片样本在保温箱中于37℃干燥3小时。通过分光光度分析法(使用″Color Eye 7000″分光光度计，Macbeth)分析干燥的棉布。污点消除以ΔR440和ΔE表示，其是对比着沾污的未处理的对照读取的。所得结果如下。表9-用果胶特异性抗体/GOx偶联物去除番茄污点瓶 R440 AR440 平均 ΔR440 AE 平均ΔE1.仅缓冲液 63.9 63.4 63.9 64.8 65.1 64.5 8.2 7.8 8.3 9.2 9.4 8.8 8.6 6.1 5.7 6.2 6.2 6.7 6.4 6.22.在缓冲液中的Gox 62.1 62.2 62.1 64.6 66.1 63.1 6.4 6.5 6.4 8.9 10.4 7.6 7.7 4.9 5.6 4.8 6.2 7.2 5.6 5.63.果胶特异性抗体/GOx偶联物(在缓冲液中) 69.1 67.8 66.5 65.5 66.8 68.8 13.5 12.2 10.9 9.8 11.2 13.2 11.8 8.7 8.2 7.4 7.4 7.8 8.6 8.04.非特异性抗体/GOx 61.3 65.5 5.7 9.8 7.8 4.9 6.7 5.7偶联物(在缓冲液中) 62.2 64.0 64.1 63.3 6.6 8.4 8.5 7.7 4.7 6.1 6.1 5.5
这些结果表明，果胶特异性偶联物去除的污点比非特异性偶联物或未偶联的酶多。