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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710050475.5 (22)申请日 2017.01.23 (71)申请人 河南中医药大学 地址 450008 河南省郑州市金水区金水路1 号 (72)发明人 杨怀霞李晓飞刘艳菊程迪 李曼曼简守珺叶圣陶 (74)专利代理机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 代理人 林新园 (51)Int.Cl. C08G 83/00(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种咪唑二羧酸钴配合物、 制备方法及其应 用 (57)摘要 本发明。
2、公开了一种咪唑二羧酸钴配合物、 制 备方法及其应用， 所述的咪唑二羧酸钴配合物的 分子式为C12H20CoN4O15。 本发明以2-羟甲基-1H- 4,5-咪唑二羧酸作为桥连配体， 采用水热法， 将 CoSO47H2O与2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸进 行反应， 使配体与相应的金属离子发生配位， 从 而得到一种新的咪唑二羧酸钴配合物。 该合成方 法简单、 方便、 安全， 反应条件温和， 纯度高， 有利 于后续的活性研究。 本发明采用荧光光谱法研究 配合物与BSA、 HSA的相互作用。 结果表明， 该配合 物与BSA、 HSA均具有较强的结合能力。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 C。
3、N 106750359 A 2017.05.31 CN 106750359 A 1.一种咪唑二羧酸钴配合物， 其特征在于， 所述的咪唑二羧酸钴配合物的分子式为 C12H20CoN4O15。 2.根据权利要求1所述的咪唑二羧酸钴配合物， 其特征在于， 对所述的咪唑二羧酸钴配 合物进行晶体结构测试后， 其测试结果如下： 所述咪唑二羧酸钴配合物为三斜晶系， P-1空 间群； 晶胞参数 80.891(5) ， 87.715 (5) ， 69.027(5) ； V977.5(5)A3； Z2； Dc1.764Mg/m3； R10.0332， R20.0932。 3.根据权利要求1所述的咪唑二羧酸钴配合物。
4、， 其特征在于， 对所述的咪唑二羧酸钴配 合物使用红外光谱仪进行测试， 得到所述咪唑二羧酸钴配合物的红外光谱； 其中， 红外光谱 中的特征吸收峰(cm-1)： 3749， 3230， 1556， 1456， 1388， 1268， 1215， 1075， 865， 777， 663， 546。 4.一种如权利要求1-3任一项所述的咪唑二羧酸钴配合物的制备方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)将2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸分散于溶剂中， 配制成2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二 羧酸浓度为0.05mol/L的配体溶液； 将CoSO47H2O溶解于溶剂中， 配制成CoSO47H2O浓。
5、度为0.05mol/L的钴盐溶液； (2)将钴盐溶液和配体溶液按照2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸和CoSO47H2O物质的量 比1:1的比例混合； (3)在步骤(2)的混合液中加入N,N-二甲基甲酰胺， 并调节pH为3.2-3.8， 然后置于反应 容器中， 在110-140条件下反应72h， 再以5/h的速率降温至室温， 自然干燥， 即得。 5.根据权利要求4所述的咪唑二羧酸钴配合物的制备方法， 其特征在于， 所述的溶剂为 去离子水。 6.根据权利要求4所述的咪唑二羧酸钴配合物的制备方法， 其特征在于， 所述的N,N-二 甲基甲酰胺的用量为每1mmol 2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧。
6、酸用5mL N,N-二甲基甲酰胺。 7.根据权利要求4所述的咪唑二羧酸钴配合物的制备方法， 其特征在于， 所述的反应容 器为聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜。 8.根据权利要求4-7任一项所述的咪唑二羧酸钴配合物的制备方法， 其特征在于， 所述 的反应温度为120。 9.一种如权利要求1-3任一项所述的咪唑二羧酸钴配合物与牛血清白蛋白(B SA)、 人 血清白蛋白(HSA)的相互作用。 10.一种如权利要求1-3任一项所述的咪唑二羧酸钴配合物在作为研究生物活性试剂 方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106750359 A 2 一种咪唑二羧酸钴配合物、 制备方法及其应用 技术领域 000。
7、1 本发明涉及一种咪唑二羧酸钴配合物、 制备方法及其应用， 属于配位化学领域。 背景技术 0002 配合物因其在生物、 医药、 磁性材料、 光储存材料、 手性催化剂、 不对称合成、 电致 发光材料等方面的巨大应用前景， 而成为无机化学最热门的研究领域之一。 咪唑二羧酸作 为一种多齿螯合配体， 同时含有杂环咪唑环和羧基， 具有不同功能的配位原子N与O， 可与多 种金属配位形成配合物。 含咪唑环的天然产物在高性能的复合材料、 感光材料、 生物、 医药 等方面都显示出了非常独特的性能。 以咪唑环构筑的咪唑类衍生物在抗菌、 抗病毒、 调节血 糖及治疗生理紊乱等多种疾病有广泛应用。 钴作为机体的必需微量。
8、元素， 具有重要的生理 作用， 钴是维生素B12组成部分， 钴元素能刺激人体骨髓的造血系统， 促使血红蛋白的合成 及红细胞数目的增加； 钴对甲状腺的功能可能有作用， 动物实验结果显示， 甲状腺素的合成 可能需要钴， 钴能拮抗碘缺乏产生的影响； 胰腺也含有大量钴， 用以合成胰岛素及一些对 糖、 脂肪代谢所必需的酶； 钴与锌、 铜、 锰有协同作用， 能促进锌的吸收并改善锌的生物活 性。 因此对咪唑二羧酸钴配合物的生物活性的研究具有重要的意义。 0003 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白， 它能与许多内源及外源性化合 物结合， 是药物发挥药效的重要载体和靶点。 另外， 药物与白蛋白作用后，。
9、 可使药物暂留在 血浆中以减弱药物的最大作用强度， 防止其大幅波动从而延长药物的作用时间。 因此， 研究 血清白蛋白与药物的相互作用不仅可以在获得蛋白质与药物结合反应机理， 分析蛋白质结 构与功能的关系， 而且有助于研究药物的药理和毒理的微观机理， 为药物的设计、 筛选及新 药的开发提供依据。 0004 将具有生物活性的咪唑二羧酸配体与钴离子配位， 获得配合物， 研究配合物与白 蛋白相互作用的机制尚未见报道。 发明内容 0005 为了解决上述问题， 本发明的目的是提供一种咪唑二羧酸类钴配合物、 制备方法 及其应用， 所述的合成方法简单， 反应条件温和， 纯度高。 利用荧光光谱法研究咪唑二羧酸 。
10、钴配合物与血清白蛋白的相互作用， 结果表明配合物与白蛋白(牛血清白蛋白BSA、 人血清 白蛋白HSA)具有较强的相互作用， 尤其与HSA的结合能力更强。 0006 为了实现上述目的， 本发明所采用的技术方案是： 0007 一种咪唑二羧酸钴配合物， 所述的咪唑二羧酸钴配合物的分子式为C12H20CoN4O15。 0008 一种咪唑二羧酸钴配合物的制备方法， 包括以下步骤： 0009 (1)将2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸分散于溶剂中， 配制成2-羟甲基-1H-4,5-咪 唑二羧酸浓度为0.05mol/L的配体溶液； 0010 将CoSO47H2O溶解于溶剂中， 配制成CoSO47H2O浓度。
11、为0.05mol/L的钴盐溶液； 0011 (2)将钴盐溶液和配体溶液按照2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸和CoSO47H2O物质 说明书 1/7 页 3 CN 106750359 A 3 的量比1:1的比例混合； 0012 (3)在步骤(2)的混合液中加入N,N-二甲基甲酰胺， 并调节pH为3.2-3.8， 然后置于 反应容器中， 在110-140条件下反应72h， 再以5/h的速率降温至室温， 自然干燥， 即得。 0013 所述的溶剂为去离子水。 0014 所述的N,N-二甲基甲酰胺的用量为每1mmol 2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸用5mL N,N-二甲基甲酰胺。 0015 所。
12、述的反应容器为聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜。 0016 优选的， 所述的反应温度为120。 0017 一种所述的咪唑二羧酸钴配合物与牛血清白蛋白(BSA)、 人血清白蛋白(HSA)的相 互作用。 0018 一种所述的咪唑二羧酸钴配合物在作为研究生物活性试剂方面的应用。 0019 本发明的有益效果： 0020 1、 本发明以2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸作为桥连配体， 与金属离子钴构建配位 聚合物， 得到一种全新的咪唑二羧酸钴配合物， 该配合物为三斜晶系， P-1空间群； 晶胞参数 80.891(5) ， 87.715(5) ， 69.027 (5) ； V977.5(5)A3； Z2； D。
13、c1.764Mg/m3； R10.0332， R20.0932。 0021 2、 本发明采用水热法， 将CoSO47H2O与2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸进行反应， 使配体与相应的金属离子发生配位， 从而得到一种新的咪唑二羧酸钴配合物。 该合成方法 简单、 方便、 安全， 反应条件温和， 纯度高， 有利于后续的活性研究。 0022 3、 本发明采用荧光光谱法研究配合物与BSA、 HSA的相互作用。 结果表明， 该配合物 与BSA、 HSA均具有较强的结合能力。 附图说明 0023 图1为咪唑二羧酸钴配合物的配位环境图。 0024 图2为咪唑二羧酸钴配合物的一维超分子链状结构图。 0025。
14、 图3为咪唑二羧酸钴配合物的三维超分子网状结构图。 0026 图4为咪唑二羧酸钴配合物的模拟与实测的PXRD图谱对比图。 0027 图5为不同温度下， BSA/HSA溶液随着咪唑二羧酸钴配合物浓度的增加荧光光谱的 变化(箭头所指方向表示咪唑二羧酸钴配合物浓度增加的方向)。 a为298K时BSA的荧光光谱 变化图， b为308K时BSA的荧光光谱变化图， c为298K时HSA的荧光光谱变化图， d为308K时HSA 的荧光光谱变化图； 插图为340nm处荧光强度随咪唑二羧酸钴配合物浓度的增加的变化图。 0028 图6为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的Stern-volmer曲。
15、线图。 a为配 合物对BSA的Stern-volmer曲线图， b为配合物对HSA的Stern-volmer曲线图。 0029 图7为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的双对数图。 a为配合物对BSA 的双对数图， b为配合物对HSA的双对数图。 0030 图8为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的同步荧光光谱图(箭头所指 方向表示咪唑二羧酸钴配合物浓度增加的方向)。 a、 b、 c、 d为不同温度时， BSA的同步荧光光 谱图； e、 f、 g、 h为不同温度时， HSA的同步荧光光谱图。 0031 图9为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的3。
16、D荧光光谱图。 a、 c、 e、 g分别 说明书 2/7 页 4 CN 106750359 A 4 为不同温度时， BSA、 HSA的3D荧光光谱图； b、 d、 f、 h为不同温度时， 配合物与白蛋白的物质的 量比为20： 1时的3D荧光光谱图。 具体实施方式 0032 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0033 本发明的配体2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸的合成方法参照论文Sheng-Run Zheng,Song-Liang Cai,Mei Pan,Jun Fan,Tian-Tian Xiao,Wei-Guang Zhang,The construction of。
17、 coordination networks based on imidazole-based dicarboxylate ligand containing hydroxymethyl group,CrystEngComm,2011,13,883888。 0034 实施例1咪唑二羧酸钴配合物的合成 0035 (1)将2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸分散于去离子水中， 配制成2-羟甲基-1H-4, 5-咪唑二羧酸浓度为0.05mol/L的配体溶液； 0036 将CoSO47H2O溶解于去离子水中， 配制成CoSO47H2O浓度为0.05mol/L的钴盐溶 液； 0037 (2)将钴盐溶液和。
18、配体溶液按照2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸和CoSO47H2O物质 的量比1:1的比例混合； 0038 (3)在步骤(2)的混合液中加入N,N-二甲基甲酰胺， 并调节pH为3.5， 然后置于聚四 氟乙烯内衬不锈钢反应釜中， 在120条件下反应72h， 再以5/h的速率降温至室温， 自然 干燥， 得到红色块状晶体， 即为咪唑二羧酸钴配合物。 0039 N,N-二甲基甲酰胺的用量为每1mmol配体2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸用5mL N, N-二甲基甲酰胺。 0040 实施例2咪唑二羧酸钴配合物的结构表征 0041 1、 单晶结构解析 0042 采用Bruker APEX-II CC。
19、D型单晶衍射仪对实施例1得到的咪唑二羧酸钴配合物进 行晶体结构测试， 测试结果为： 0043该配合物为三斜晶系， P-1空间群； 晶胞参数 80.891(5) ， 87.715(5) ， 69.027(5) ； V977.5(5)A3； Z2； Dc1.764Mg/ m3； R10.0332， R20.0932。 0044采用经石墨单色器单色化的MoK射线收集衍射数据。 晶体结构采 用直接法解出， 并且用傅立叶技术扩展， 按各向异性进行修正。 最后采用全矩阵最小二乘 法， 依据可观察的衍射数据和可变参数进行校正， 所有数据经Lp因子校正。 用直接法得到全 部非氢原子坐标， 氢原子坐标由差值Fo。
20、urier合成法得到， 除氢原子采用各向同性热参数 外， 其它原子均采用各向异性热参数法， 所有的计算均使用程序SHELX-97。 得到如图1所示 咪唑二羧酸钴配合物的配位环境图， 如图2所示的咪唑二羧酸钴配合物的一维超分子链状 结构图， 如图3所示的咪唑二羧酸钴配合物的三维超分子结构图。 0045 由图1可知， 所述咪唑二羧酸钴配合物的组成为Co(H3hmIDC)2(H2O)23H2On(n 为大于等于1的整数， 大括号内为最小不对称单元的组成)， 分子式为C12H20CoN4O15。 配合物 的单元结构包含一个Co(II)离子、 两个脱质子的H3hmIDC-阴离子、 两个配位水分子和三个游。
21、 离水分子。 在配合物中Co(II)为六配位， 与来自两个H3hmIDC-配体上的两个氧原子(O1、 O6) 说明书 3/7 页 5 CN 106750359 A 5 和两个氮原子(N1、 N3)， 两个配位水分子上的两个氧原子(O11、 O12)配位。 Co(II)处于稍扭 曲的八面体CoN2O4配位构型中。 八面体的赤道面由O1、 O6、 N1、 N3和Co(II)组成， O11、 O12占据 八面体的顶点位置， 键角O(11)-Co(1)-O(12)为175.10(6) 。 Co(II)周围的Co-O配位键长为 Co(1)-O(11)：Co(1)-O(6)：Co(1)-O(1)：Co-N。
22、配位 键长为Co(1)-N(1)：Co(1)-N(3)： 0046 如图2所示， 在b方向上， 超分子链通过羧基与羟基之间的分子内的O-HO和 羧基与配位水分子之间的分子间O-HO延伸。 相邻链通过羧基、 羟基、 配位水分子、 晶 格水分子间的氢键相连。 如图3所示， 超分子链通过氢键堆积形成超分子网状结构。 0047 2、 红外光谱分析 0048 采用美国赛默飞公司(Thermo SCIENTIFIC)公司生产的NICOLET iS50傅里叶变换 红外光谱仪对实施例1得到的咪唑二羧酸钴配合物进行红外光谱测试(采用KBr压片法， 室 温下扫描， 测试范围为400-4000cm-1)。 红外光谱。
23、中的特征吸收峰(cm-1)： 3749， 3230， 1556， 1456， 1388， 1268， 1215， 1075， 865， 777， 663， 546。 0049 3、 X射线粉末衍射分析 0050 采用PANalytical公司生产的X Pert PRO型粉末衍射仪， 通过使用Cu-K 1射线采 集实施例1得到的咪唑二羧酸钴配合物的衍射数据(见图4)。 0051 从图4分析可知， 测得的咪唑二羧酸钴配合物的PXRD的图谱与模拟图谱基本吻合， 这说明所述咪唑二羧酸钴配合物的纯度很高， 可用于性能研究。 0052 实施例3咪唑二羧酸钴配合物与血清白蛋白的相互作用 0053 试验仪器：。
24、 荧光分光光度计型号为F7000， 日本日立公司生产。 0054 试剂的配制及测试条件设置： 0055 1、 样品液的配制 0056 2-羟甲基-1H-4,5-咪唑二羧酸钴配合物溶液： 称取0.0052g 2-羟甲基-1H-4,5-咪 唑二羧酸钴配合物， 配制成浓度为110-3mol/L的DMSO溶液。 0057 Tris-HCl缓冲溶液： 取Tris(三羟甲基氨基甲烷)3.0285g， 氯化钠7.3124g， 用蒸馏 水定容至250mL， 摇匀。 然后用盐酸调节pH至7.40。 0058 牛血清白蛋白(BSA)溶液： 称取牛血清白蛋白0.0333g， 用Tris-HCl溶液溶解， 配制 成浓。
25、度为510-5mol/L的牛血清白蛋白溶液。 0059 人血清白蛋白(HSA)溶液： 称取人血清白蛋白0.0331g， 用Tris-HCl溶液定容， 配制 成浓度为510-5mol/L的人血清白蛋白溶液。 0060 2、 荧光光谱测试条件的设置 0061 设定激发波长为280nm， 激发和发射狭峰均为5nm， 分别在298K、 308K条件下， 扫描 285450nm范围的荧光光谱； 在发射波长250550nm， 激发波长200400nm范围内扫描其 3D荧光光谱。 并分别在波长差 15nm和 60nm时， 扫描其同步荧光光谱。 0062 3、 荧光光谱的测定 0063 移取0.3mL牛血清白。
26、蛋白溶液(0.6mL人血清白蛋白溶液)， 14.7mL(14.4mL)Tris- HCl缓冲溶液于50mL圆底烧瓶中， 配制成浓度为110-6mol/L的牛血清白蛋白溶液(浓度为2 10-6mol/L的人血清白蛋白溶液)。 加入不同体积的配合物溶液， 测定荧光光谱的变化(与 BSA相互作用时， 配合物浓度范围： 04.3110-4mol/L； 与HSA相互作用时， 配合物浓度范 说明书 4/7 页 6 CN 106750359 A 6 围： 03.8310-4mol/L)。 0064 荧光光谱法测定配合物与血清白蛋白的相互作用： 0065 1、 荧光猝灭 0066 对实施例1所合成的配合物， 。
27、用荧光光谱法研究其与BSA、 HSA的相互作用， 如图5。 BSA的浓度为110-6mol/L， 随着配合物浓度的增加， BSA的内源性荧光逐渐减弱， 当配合物 浓度为4.3110-4mol/L时， 配合物与BSA的相互作用基本达到平衡； HSA的浓度为210- 6mol/L， 随着配合物浓度的增加， HSA的内源性荧光逐渐减弱， 当配合物浓度为3.8310- 4mol/L时， 配合物对HSA内源性荧光的猝灭基本达到平衡。 说明在这298K、 308K两个温度下， BSA、 HSA的内源性荧光能有效的被配合物猝灭， 而发射峰的形状和位置并没有发生变化， 表 明配合物与BSA、 HSA之间形成了。
28、荧光较弱或者无荧光的复合物而造成BSA、 HSA内源性荧光 被猝灭。 0067 2、 猝灭机制 0068 引起BSA、 HSA荧光猝灭的机制有静态猝灭和动态猝灭。 动态猝灭是一种能量转移 或电子转移的过程， 不影响蛋白质的结构和生理活性。 静态猝灭是由于发生了配合反应， 通 常是产生了不发荧光的配合物， 对蛋白质的二级结构可产生影响， 并可能影响其生理活性。 动态猝灭遵循Stern-volmer方程： 0069 F0/F1+KsvQ1+Kq0Q 公式(1) 0070 F0和F分别为未加入和加入猝灭剂时BSA、 HSA的荧光强度； Kq为双分子猝灭过程速 率常数； Ksv为Stern-volme。
29、r方程的猝灭常数； 0为没有猝灭剂存在下生物大分子平均寿命， 约为10-8s； Q为配合物的浓度。 0071 由公式(1)可求得BSA、 HSA猝灭过程的速率常数Kq(见表1)。 0072 表1钴配合物与BSA、 HSA相互作用的速率常数、 结合常数、 结合位点数 0073 0074 表1表明， 两个温度下猝灭过程的速率常数的数量级都大于1011， 而各类猝灭剂对 生物大分子的最大动态猝灭速率常数约为2.01010Lmol-1s-1， 说明2-羟甲基-1H-4,5- 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的荧光猝灭速率均大于最大扩散碰撞猝灭速率， 且随着温 度的升高， 猝灭速率常数降低， 由此判。
30、断2-羟甲基-4,5-咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的 相互作用是因形成复合物而引起BSA、 HSA内源性荧光猝灭， 属于静态猝灭。 0075 图6为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的Stern-volmer方程的线性拟 合图。 0076 3、 结合常数和结合位点数 0077 配合物与BSA、 HSA相互作用的结合常数和结合位点数可利用双对数方程计算： 0078 log(F0-F)/FlogKb+nlogQ 公式(2) 说明书 5/7 页 7 CN 106750359 A 7 0079 图7为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的双对数图。 Kb为结合常数。
31、， n 为结合位点数， 计算结果(表1)表明钴配合物与BSA的结合常数Kb分别为6.48102Lmol -1、 6.31102Lmol-1， 结合位点数n分别为0.84、 0.78； 与HSA的结合常数Kb分别为4.52 104Lmol-1、 1.99103Lmol-1， 结合位点数n分别为1.24、 1.00。 以上数据表明， 配合物与 HSA、 BSA均具有较强的相互作用， 且配合物与HSA的结合能力强于BSA。 0080 4、 作用力类型 0081 配合物与血清白蛋白相互作用的作用力类型包括范德华力、 氢键、 静电引力、 疏水 作用力等。 药物与血清白蛋白之间的作用力类型的确定可根据两者。
32、作用前后焓变H和熵 变S来判断， 当温度变化不大时， 反应的焓变H可认为是常数。 配合物与BSA、 HSA相互作 用的作用力类型由Van t Hoff方程判断： 0082 ln(K2/K1)1/T1-1/T2H/R 公式(3) 0083 GH-TS-RTlnK 公式(4) 0084 R为气体常数(8.314472J K-1mol-1)， K1、 K2为温度为T1、 T2时的结合常数， 钴配合物 与BSA、 HSA相互作用的热力学参数见表2。 0085 表2不同温度下钴配合物与BSA、 HSA相互作用的热力学参数 0086 0087 一定条件下， 药物与白蛋白的结合反应是否能自发进行与体系的吉布。
33、斯自由能变 有关， 吉布斯自由能小于零时， 反应能够自发进行。 这种自发过程可以分为熵驱动和焓驱 动。 熵、 焓的大小与作用力类型之间的关系如表3： 0088 表3熵焓的大小与作用力类型之间的关系 0089 0090 0091 由表2、 表3可知， 配合物与BSA作用的热力学常数H0， S0， 说明配合物与 BSA之间存在较强静电作用力； 配合物与HSA相互作用的热力学常数H0， S0， 说明配 合物与HSA之间存在氢键或范德华力。 配合物与BSA、 HSA相互作用的G0， 表明配合物与 BSA、 HSA的相互作用是自发进行的。 说明书 6/7 页 8 CN 106750359 A 8 009。
34、2 5、 同步荧光光谱 0093 同步荧光光谱可用来判断发射团周围环境的极性是否发生变化。 而激发和发射波 长差 是一个重要的参数。 血清白蛋白分子中因含有色氨酸、 酪氨酸及苯丙氨酸等残基而 发射较强的内源性荧光,其中色氨酸和酪氨酸的荧光强度比较大， 并且两者的激发光谱比 较相似， 发射光谱会严重重叠， 利用同步荧光光谱选择合适的 可以达到简化光谱、 减少 光谱重叠和窄化谱带的目的， 而通常情况下， 60nm的同步荧光光谱只显示色氨酸的特 征光谱， 15nm的同步光谱只显示酪氨酸的特征光谱。 根据同步荧光光谱发射波长的变 化可以推测配合物的加入对BSA、 HSA色氨酸和酪氨酸微环境产生的影响，。
35、 进而可以判断蛋 白质构象的变化。 0094 图8为不同温度下， 咪唑二羧酸钴配合物对BSA、 HSA的同步荧光光谱图， 最大发射 波长的位移结果列于表4。 从图8可以看出随着配合物浓度的增加， 60nm时BSA、 HSA的 最大荧光强度比 15nm时降低更多， 从表4可知， 60nm时 max的红移更明显， 这表 明色氨酸残基的构象发生变化， 色氨酸残基周围的微环境极性增加， 内部疏水结构有所破 坏。 而配合物的加入使得BSA、 HSA发生如此变化， 由此推测是配合物嵌入BSA、 HSA内部引起 的。 0095 表4最大发射波长的位移 0096 0097 6、 3D光谱 0098 三维荧光光。
36、谱能够提供蛋白质构象变化的详细信息， 氨基酸残基的最大发射波长 与蛋白质微环境的极性有密切关系。 以激发波长、 发射波长和荧光强度为坐标的三维空间 图谱如图9， peak a的特征是 ex em( 0)， 为瑞利散射峰； peak 1、 peak 2是两种典型 的光谱峰， 峰1(peak 1)主要显示了色氨酸和酪氨酸残基的光谱特性； 峰2(peak 2)主要显 示多肽链主链结构的荧光特征， 并且该峰的荧光强度与蛋白质的二级结构密切相关。 0099 图9为不同温度下， 随咪唑二羧酸钴配合物浓度增大时BSA、 HSA的3D荧光光谱图。 由图9可以看出加入配合物后， BSA、 HSA的瑞利散射峰起始。
37、位置及荧光峰位置均无显著变 化， BSA荧光峰的Stokes位移不变， HSA荧光峰峰2的Stokes位移有所减小， Stokes位移发生 少许的变化， 说明分子内部微环境发生变化， 蛋白质的构象发生了变化。 随着配合物的加 入， BSA、 HSA的两个特征峰均被不同程度地猝灭， 表明配合物与BSA、 HSA发生了结合， 从而导 致蛋白肽链的伸展， 分子内部的荧光发色基团所处的微环境发生变化。 0100 以上所述仅为本发明最佳的实施例， 对于本领域的技术人员来说， 本发明可以有 各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应 包含在本发明的保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 106750359 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/6 页 10 CN 106750359 A 10 图4 说明书附图 2/6 页 11 CN 106750359 A 11 图5 图6 说明书附图 3/6 页 12 CN 106750359 A 12 图7 说明书附图 4/6 页 13 CN 106750359 A 13 图8 说明书附图 5/6 页 14 CN 106750359 A 14 图9 说明书附图 6/6 页 15 CN 106750359 A 15 。