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1、(10)授权公告号 CN 101715488 B (45)授权公告日 2012.07.18 CN 101715488 B *CN101715488B* (21)申请号 200980000315.3 (22)申请日 2009.03.31 PI20082327 2008.06.26 MY C12N 15/06(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (73)专利权人 马来西亚博特拉大学 地址 马来西亚沙登 (72)发明人 雅各布B彻曼 舒海米穆斯塔法 法里汉里亚纳卡立德 艾达阿兹里纳阿兹米 阿维斯昆尼萨兹立 拉哈阿布杜欧拉希姆 (74)专利代理机构 北京市浩天知识产权代理事 务所。
2、 11276 代理人 刘云贵 EP 1364068 A2,2003.11.26, WO 2007119066 A1,2007.10.25, CN 101196463 A,2008.06.11, (54) 发明名称 食品中猪肉成分的鉴定方法 (57) 摘要 在此研究中， 猪肉特异性实时 PCR 检验发展 用以清真食品认证。三种肉类样品被采用， 即猪 肉， 牛肉和鸡肉。这三种家畜的肉是马来西亚经 常消费的肉， 而且在市场上很容易买到。每种粗 制肉样品的 DNA 利用Blood&Tissue Kit(Qiagen， Hilden， Germany) 成 功 提 取。 在 实时 PCR 反应前， DN。
3、A 的浓度采用光度适应计 (Eppendorf AG， Hamburg， Germany) 利用 UV 吸收 分光光度测量法获得。引物的退火温度为 58。 为了检验所构架的引物的特异性， 反应测试了引 物与其他两种肉类样品的反应以监测可能的交叉 反应。 该反应仅在Ct22.83时扩增猪肉DNA。 本 发明描述的实时 PCR 检测被证实在样品测试中， 对低监测限度非常敏感。 检测通过自100ngDNA开 始制备 10 倍稀释系列， 测定反应的灵敏度。灵敏 度起始值最高为0.001ng猪肉DNA。 已有报道称利 用传统PCR检测的检出限为0.1ng猪肉DNA。 在这 种情况下， 本方法对于检测食品。
4、中的猪肉 DNA 是 有益处的。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2009.11.06 (86)PCT申请的申请数据 PCT/MY2009/000047 2009.03.31 (87)PCT申请的公布数据 WO2009/157750 EN 2009.12.30 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽玮 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种鉴定食品中猪肉成分的方法， 该方法包括 ： (a) 以猪肉 ND5 线粒体基。
5、因为基础构架一正向引物和反向引物 ； (b) 对该正向引物和反向引物进行实时荧光聚合酶链反应， 其中， 该正向引物序列为 SUS-FWD ： 5 -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3 ， 该反向引物序列为 SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3 。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其中正向引物和反向引物的浓度为 0.3-0.9M。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其中反应温度为 50-70。 4. 一种鉴定食品中猪肉成分的方法， 该方法包括 ： (a) 从猪肉样本中提取脱氧核糖核酸 ； (b) 以猪肉 ND5 线粒体基因。
6、为基础构架一正向引物和反向引物 ； (c) 对该正向引物和反向引物进行实时荧光聚合酶链反应， 其中， 该正向引物序列为 SUS-FWD ： 5 -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3 ， 该反向引物序列为 SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3 。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其中正向引物和反向引物的浓度为 0.3-0.9M。 6. 如权利要求 4 所述的方法， 其中反应温度为 50-70。 权 利 要 求 书 CN 101715488 B 2 1/3 页 3 食品中猪肉成分的鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用。
7、于食品成分鉴定的引物构架方法， 特别是肉食加工为主的食 品。 尤其地， 本方法用于鉴定清真食品认证的加工食品中是否存在猪肉(Sus scrofa)成分。 背景技术 0002 食品掺假是世界范围内广泛存在的问题， 例如， 便宜食品被当作昂贵食品使用。 更 多情况是， 在食品中猪肉被用以替代其他肉类。 因此， 对消费者来说， 食品中肉的类型， 尤其 是猪肉的检测正成为一个重要的问题。对潜在的非清真食品的存在方面， 错误标签食品的 影响会更为严重。 出于这个原因， 已研究出鉴别肉类食品和新鲜肉类来源种类的几种方法。 许多以 DNA 分析为基础的方法已经在食品行业应用以监测食品掺假问题。以动物物种形成。
8、 建立的方法主要以油脂， 蛋白质和 DNA 为基础。然而， 以 DNA 为基础的方法尤为可靠， 因为 DNA 在食品加工过程中所使用的高温， 压力和化学处理相关的条件下更为稳定。 0003 肉类食品中动物组织的物种鉴别对保护消费者远离非法和不希望的食品掺假是 个重要的课题， 这具有经济， 宗教和健康上的原因。因此， 在蛋白质和 DNA 分析基础上已发 展起许多分析方法。DNA 为基础的方法属于较为成熟的物种鉴别， 其中包括种特异性的传 统 PCR 和实时 PCR。在为猪肉种特异性发展出来的目标基因片段是取源自 12S rRNA， ND5， 线粒体移植环 (D-Loop) 和核黑色素皮质素受体 。
9、1(MCIR)。 0004 尽管利用传统PCR的方法证明是成功的， 但是该方法还需PCR后的处理， 这延长了 分析时间， 而且需要处理危险的化学品， 因此也可能造成实验室污染。另一方面， 实时 PCR 方法具有巨大的潜力以替代传统 PCR， 这主要是因为实时 PCR 方法迅速， 灵敏， 确切， 高度自 动化以及目标量化 (Heid etal， 1996)。 发明内容 0005 本发明涉及一种鉴定食品中猪肉成分的方法， 该方法包括从猪肉样本中提取脱氧 核糖核酸 (DNA)， 然后在猪肉 ND5 线粒体基因的基础上构架一正向引物和反向引物， 对该 正向引物和反向引物进行聚合酶链反应 (PCR)， 。
10、其中， 该正向引物序列为 SUS-FWD ： 5 -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3 ， 该反向引物序列为 SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3 。 0006 本发明特征为 ： 0007 一种鉴定食品中猪肉成分的方法， 该方法包括 ： 0008 (a) 从猪肉样本中提取脱氧核糖核酸 (DNA) ； 0009 (b) 以猪肉 ND5 线粒体基因为基础构架一正向引物和反向引物 ； 0010 (c) 对该正向引物和反向引物进行聚合酶链反应 (PCR)， 其中， 该正向引物序列为 SUS-FWD ： 5 -AGC TGC ACT A。
11、CA AGC AAT CC-3 ， 该反向引物序列为 SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3 。 0011 其中正向引物和反向引物的浓度为 0.3-0.9m。 说 明 书 CN 101715488 B 3 2/3 页 4 0012 其中反应温度为 50-70。 0013 以及， 0014 一种鉴定食品中猪肉成分的方法， 该方法包括 ： 0015 (a) 以猪肉 ND5 线粒体基因为基础构架一正向引物和反向引物 ； 0016 (b) 对该正向引物和反向引物进行聚合酶链反应 (PCR)， 其中， 该正向引物序列为 SUS-FWD ： 5 -AGC TGC。
12、 ACT ACA AGC AAT CC-3 ， 该反向引物序列为 SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3 。 0017 其中正向引物和反向引物的浓度为 0.3-0.9m。 0018 其中反应温度为 50-70。 附图说明 0019 图 1 示出了猪肉引物和其他肉类 ( 牛肉和鸡肉 ) 特异性实验比较 ； 0020 图 2 示出了 10 倍连续稀释的猪肉引物的灵敏度测试 ； 0021 图 3 示出了引物浓度的最优化 ； 0022 图 4 示出了引物退火温度的最优化。 具体实施方式 0023 本发明描述了用于清真食品鉴定的猪肉特异性实时 PCR 检验的发。
13、展和应用。引 物构架成扩增猪肉线粒体基因 ND5 的一个 89bp 扩增子 (89bpamplicon)， 与商业种类的鸡 肉和牛肉进行错配。该检验具有高度灵敏性， 可在水中 DNA 稀释评估时， 检测出猪肉模板 DNA(pork template DNA)的0.001ng的存在。 用于清真食品鉴定而发展出的引物以猪肉线 粒体基因 ND5 为基础， 该引物序列如下 ： 0024 正向引物 (SUS-FWD ： 5 -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3 ) 0025 反向引物 (SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3 ) 0026。
14、 检测猪肉 DNA 的 PCR 条件是利用实时荧光定量 PCR 仪 (the Mastercyclerep) ( 德国汉堡某公司产品 Eppendorf AG， Hamburg， Germany) 通过扩增完成的。每支反应 试管盛装 20l 的反应混合物， 其中包括 10l 2x Quantitect SYBRGreen PCR Master Mix(Qiagen， Hilden， Germany)， 1l正向引物， 1l反向引物， 3l dH20和5l DNA样品 (20ng/l)。三步扩增循环程序 (The3-step amplification cycle program) 如下所述 ：。
15、 在 95进行 15 分钟的最初活化， 在 94进行变性 15 秒， 在 58进行退火 30 秒， 在 72进 行延伸 30 秒。最初活化步骤用以激活 HotStarTaq DNA 聚合酶在反应混合物中出现。该循 环重复 40 次， 采用解链曲线分析 (melting curve analysis) 以核实具体物品和 DNA 扩增 的鉴定。 0027 样品 0028 猪肉， 牛肉和鸡肉三个种类用于该研究。肉样品从当地市场 (SelangorWholesale Market) 购得。在 DNA 提取前， 样品以 -20储存。 0029 DNA 提取 0030 肉样品中的 DNA 用血液及组织套件。
16、 (Blood and TissueKit) (Qiagen， Hilden， Germany)提取。 25mg的样品在1.5ml微型离心机试管中称重。 加入180l 说 明 书 CN 101715488 B 4 3/3 页 5 成人T细胞白血病/淋巴瘤缓冲剂(Buffer ATL)和20l蛋白酶K。 混合物被旋转， 在56 水浴中培养过夜以溶解。当样品被全部溶解后， 加入 4l 核糖核酸酶 A(RNase A)(100mg/ ml)， 混合并在室温下培养 2 分钟。将混合物旋转后， 加入 200l AL 缓冲剂 (Buffer AL)， 然后再次旋转使混合充分。而后， 加入 200l 乙醇 。
17、(96-100 )， 并通过旋转混合产生一均 一溶液。 混合物用洗液管导入Dneasy迷你旋转柱体套件(DNeasy Minispin column set)， 在 8000rpm 下离心 1 分钟。渗流以及收集试管丢弃。然后， Dneasy 迷你旋转柱体 (DNeasy Mini spin column) 安装一新的 2ml 收集试管。加入 500l AW2 缓冲剂 (Buffer AW2)， 在 14,000rpm 下离心 3 分钟以保证柱体干燥以及避免乙醇遗留的发生。而后， Dneasy 迷你 旋转柱体安装一新的 1.5ml 微型离心机试管， 加入 100l AF 缓冲剂 (Buffer。
18、 AF) 以洗提。 试管在室温下培养 1 分钟， 然后在 8,000rpm 下离心 1 分钟。包含被提取的 DNA 的上清液于 4储存， 以备后用。 0031 引物构架 0032 引 物 3 软 件 (The Primer3 software)(http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/ primer3/primer3_www.cgi) 被用于构架在实时 PCR 中应用的引物。获得自 NCBI GenBank 数据库 (hhtp:/www.ncbi.nlm.nih.gov) 的猪肉 (NC_000845) 牛肉 (NC_006853) 和鸡肉 (NC_001323) 中的 。
19、ND5 基因序列， 被排列并被比较。一个引物对 (SUS-FWD ： 5 -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3 和 SUS-RVS ： 5 -ATG CGT TTG AGT GGG TTAGG-3 ) 被合成以特定地扩 增猪肉中 ND5 基因的 89bp 段。 0033 实时 PCR 分析 0034 检测猪肉 DNA 是利用实时荧光定量 PCR 仪 (the Mastercycler ep)(Eppendorf AG， Hamburg， Germany) 通过扩增完成的。每支反应食管盛装 20l 的反应混合物， 其包括 10l 2x Quantitect SYBR Gre。
20、en PCR Master Mix(Qiagen， Hilden， Germany)， 1l 正向 引物， 1l 反向引物， 3l dH2O and 5lDNA 样品 (20ng/l)。三步扩增循环程序如下所 述 ： 在95进行15分钟的最初活化， 在94进行变性15秒， 在58进行退火30秒， 在72 进行延伸 30 秒。最初活化步骤用以激活 HotStarTaq DNA 聚合酶在反应混合物中出现。该 循环重复 40 次， 解链曲线分析实施用以核实物种和 DNA 扩增的鉴定。另有说明者除外， 所 有反应重复进行了三次。 说 明 书 CN 101715488 B 5 1/3 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 101715488 B 6 2/3 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 101715488 B 7 3/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101715488 B 8 。