邻取代的邻氨基苯甲酸酰胺及其作为药物的应用 【技术领域】
本发明涉及邻取代的邻氨基苯甲酸酰胺及其作为治疗由持续性血管生成引发的疾病的药物的应用。背景技术
持续性血管生成可以是各种疾病的诱因，例如牛皮癣，关节炎如类风湿关节炎，血管瘤、血管纤维瘤，眼疾病如糖尿病视网膜病、新血管性青光眼，肾病如肾小球性肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾坏死、栓塞性微血管病综合症、移植物排异反应和肾小球病，纤维变性疾病如肝硬化、肾小球膜细胞增殖性疾病和动脉硬化，或者可导致上述疾病的恶化。
直接或者间接抑制VEGF受体可用于治疗此等疾病以及其他由VEGF诱发的病理性血管生成和血管渗透性病症如肿瘤血管生成。例如，已知肿瘤的生长可用可溶性受体以及抗VEGF的抗体来抑制。
持续性血管生成是由因子VEGF通过其受体诱发的。为使VEGF可发挥该作用，VEGF必须结合至受体上，并诱发酪氨酸磷酸化。
已知苯基-邻氨基苯甲酰胺衍生物可用作血管紧张素II拮抗剂(EP564356)以及用作抗炎剂和抗溃疡化合物(US3,409,668)。发明内容
现已发现通式I的化合物及其异构体和盐能够使酪氨酸磷酸化或者持续性血管生成停止，并由此防止肿瘤的生长和繁殖：其中：R1代表以下基团，其中R5代表氯、溴或OCH3，其中R7代表CH3或氯，其中R8代表CH3、氟、氯或CF3，
R4代表氟、氯、溴、-CF3、-N＝C、CH3-、-OCF3或-CH2OH，
R6代表-CH3或氯，R2代表吡啶基或者以下基团：R3代表氢或氟。具体实施方式
有各种不同的酪氨酸激酶(网址：S.Hauk，A.M.Quinn，Meth.inEnzymol.1991，200，38-62，speziell in der katalytischen Domaene，Untergruppe PTK group XIV，网页：http：//www.sdsc.edu/Kinases/pkr/pkcatalytic/pk hanks seq align long.html；以及Mc Tigue等人，Structure 1999，7，319-330)，它们可用类似的方式抑制。例如存在于干细胞中的酪氨酸激酶有时可通过抑制VEGF(血管内皮生长因子)的化合物来抑制。因此，非常希望得到可选择性地抑制VEGF的化合物。
根据本发明的化合物的特征在于，其具有类似的选择性质，并因此是有价值的化合物，可防止肿瘤的生长和繁殖。
根据本发明的通式I化合物还可包括可能地互变异构体并包含E-或Z-异构体，或者如果存在手性中心，也可包括消旋体和对映体。
式I的化合物及其生理相容盐，由于相对于VEGF受体的磷酸化具有抑制活性，可用作药物。基于其作用模式，根据本发明的化合物适合于治疗由持续性血管生成导致的疾病。
因为已确定式I的化合物是酪氨酸激酶KDR和FLT的抑制剂，所以它们特别适合治疗那些经由VEGF受体引发的持续性血管生成或者血管渗透性增加所导致的疾病。
本发明还包括根据本发明的化合物作为酪氨酸激酶KDR和FLT之抑制剂的用途。
因此，本发明还提供用于治疗肿瘤的药物或其用途。
根据本发明的化合物可单独使用或者用于制剂中，作为治疗以下疾病的药剂：牛皮癣，关节炎如类风湿关节炎，血管瘤、血管纤维瘤，眼疾病如糖尿病视网膜病、新血管性青光眼，肾病如肾小球性肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾坏死、栓塞性微血管病综合症、移植物排异反应和肾小球病，纤维变性疾病如肝硬化、肾小球膜细胞增殖性疾病和动脉硬化，以及神经组织损伤。
根据本发明的化合物还可用于抑制充气导管治疗后、血管修复时或者插入使血管保持打开的机械装置如stent后的血管再闭合。
在治疗神经组织损伤时，用本发明的化合物可防止损伤部位上的快速疤痕形成，也就是说，在轴突重新连接之前防止疤痕形成的发生。因此有利于神经成分的重建。
用根据本发明的化合物还可抑制患者中腹水的形成。也可抑制VEGF诱发的浮肿。
此等药物、其制剂和用途也包括在本发明的范围内。
因此，本发明还涉及通式I的化合物在制备用于治疗以下疾病的药物中的应用：肿瘤，牛皮癣，关节炎如类风湿关节炎，血管瘤、血管纤维瘤，眼疾病如糖尿病视网膜病、新血管性青光眼，肾病如肾小球性肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾坏死、栓塞性微血管病综合症、移植物排异反应和肾小球病，纤维变性疾病如肝硬化、肾小球膜细胞增殖性疾病和动脉硬化，以及神经组织的损伤，以及在制备用于抑制充气导管治疗后、血管修复时或者插入使血管保持打开的机械装置如stent后的血管再闭合的药物中的应用。
在使用通式I的化合物作为药物时，可将其制成药物制剂，除活性成分外，该制剂在用于肠道或非胃肠道给药时还可包含合适的药用有机或者无机惰性材料，如水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇等。药物制剂可为固体剂型，例如片剂、包衣片剂、栓剂、胶囊剂，或者为液体剂型，例如溶液剂、混悬剂或者乳剂。它们可任选包含佐剂如防腐剂、稳定剂、湿润剂或者乳化剂、改变渗透压的盐或者缓冲剂。
在非胃肠道给药时，活性化合物在聚羟基乙氧基化蓖麻油中的注射液或者混悬液、尤其是水溶液是合适的。
作为载体系统，还可使用表面活性佐剂如胆酸的盐或者动物或植物磷脂，也包括它们的混合物以及脂质体或组分。
在口服给药时，含有滑石和/或烃载体或粘合剂如乳糖、玉米淀粉或者马铃薯淀粉的片剂、包衣片剂或者胶囊剂是合适的。给药也可用液体剂型进行，如任选添加有甜味剂的汁液。
活性成分的剂量可根据给药方法、患者的年龄和体重、待治疗疾病的类型和严重程度等类似因素来确定。每日剂量为0.5-2000mg，优选为50-1000mg，该剂量可以单个剂量一次性给药或者分成2个或者更多个日剂量给药。
上述制剂和给药剂型也在本发明的范围内。
制备本发明的化合物可根据本领域技术人员已知的方法进行。例如，式I的化合物可如下制得：(a)通式II的化合物其中R4-R7与以上定义相同，T代表H或者保护基，A是卤素或者OR13，而R13代表氢原子、C1-4烷基或C1-4酰基或者与T闭合成环，首先进行N-烷基化，将COA转化为酰胺，然后任选地脱除保护基，或者首先转化为酰胺，然后进行N-烷基化，
或者(b)通式III的化合物其中R4-R7与以上定义相同，T代表H或者保护基，使其邻位金属化，然后通过亲电试剂的捕捉转化为酰胺，接着脱除保护基，并对氨基进行烷基化，
或者(c)将通式IV的化合物转化为酰胺，然后脱除保护基，接着使氨基进行烷基化，其中R4-R7与以上定义相同，T代表H或者保护基，而B代表卤素或者O-三氟甲磺酸基(triflate)、O-甲苯磺酸基或者O-甲磺酸基。
反应步骤的顺序可相互交换。
酰胺的形成可根据文献中已知的方法进行。
对于酰胺的形成，可由相应的酯起始。根据J.Org.Chem.1995，8414的方法，使所述酯与三甲基铝和相应的胺在0℃-溶剂沸点的温度下在溶剂如甲苯中反应。该方法也可用于未经保护的邻氨基苯甲酸酯。如果分子包含两个酯基，则可将它们都转化为相同的酰胺。
在使用腈替代酯时，在类似的条件下得到脒。
但是，对于酰胺的形成，也可使用肽化学中所有已知的方法。例如，相应的酸优选在室温下与HATU中的胺在非质子极性溶剂如二甲基甲酰胺中反应，其中经过活化酸衍生物，该衍生物可例如用羟基苯并三唑和碳化二亚胺如二异丙基碳化二亚胺得到，或者用预先形成的试剂如HATU(Chem.Comm.1994，201)或者BTU得到，反应温度为0℃-溶剂的沸点温度，优选为80℃。该方法也可用于未经保护的邻氨基苯甲酸。对于酰胺的形成，方法中也可使用混合酸酐、咪唑烷(imidazolide)或者叠氮化物。例如以酰胺的形式预先保护氨基并不是在所有情况下都是必须的，但反应可受到有益的影响。具体的起始物是靛红酸酐，通过该试剂可同时进行氨基的保护和酸官能团的活化。
如果预先将胺转化为BOC保护的化合物，则可通过与金属有机化合物如正丁基锂的反应对邻位进行金属化，然后与异氰酸酯或者异硫氰酸酯反应以形成邻氨基苯甲酸酰胺或者邻氨基苯甲酸硫代酰胺。该邻位上的溴或碘取代基可通过卤素-金属交换促进邻位的金属化反应。作为溶剂合适的是醚如二乙醚或者四氢呋喃，或者烃如己烷，或者它们的混合物。添加络合剂如四甲基乙二胺(TMEDA)是有利的。温度范围是在-78℃至室温之间。BOC-酰胺的裂开通过用酸如三氟乙酸处理来进行的，其中可不使用溶剂或者在溶剂如二氯甲烷中，温度为0℃-溶剂的沸点，或者在溶剂如乙醇或者二恶烷中用盐酸水溶液、优选1N盐酸处理，其温度为室温-溶剂的沸点温度。
酰胺基也可通过羰基化反应来引入。为此目的，可由相应的式IV化合物(o-碘、o-溴或者o-triflyloxyaniline)起始，在常压或者升高的压力下与一氧化碳反应，然后在过渡金属催化剂如氯化钯(II)或者乙酸钯(II)或者四(三苯基膦)钯存在下于溶剂如二甲基甲酰胺中与胺反应。配位体如三苯基膦的添加以及碱如三丁基胺的添加是有利的(例如参见：J.Org.Chem.1974，3327；J.Org.Chem.1996，7482；Synth.Comm.1997，367；Tetr.Lett 1998，2835)。
如果要在分子中引入不同的酰胺基，例如，必须在制备第一个酰胺基后向分子中引入第二个酯基然后酰胺化，或者分子中一个基团为酯而另一个基团为酸，然后根据各种方法顺序地使这两个基团酰胺化。
根据Bull Soc.Chim.Belg.87，229，1978，与diphosphadithianes反应，或者在诸如吡啶的溶剂中或者甚至没有溶剂的情况下，于0-200℃下与五硫化磷反应，由此可由邻氨基苯甲酸酰胺制得硫代酰胺。
产物也可作为富电子芳香化合物进行亲电芳香取代。该取代反应发生在氨基或者氨基之一的邻或对位中。然后，可在Friedel-Crafts催化剂如三氯化铝存在下，在溶剂如硝基甲烷、二硫化碳、二氯甲烷或者硝基苯中，在0℃-溶剂的沸点温度、优选室温下，用酰氯进行Friedel-Crafts酰基化。
根据文献中已知的方法，在不用溶剂的情况下，例如通过硝基化酸、各种浓度的硝酸，或者通过金属硝酸盐如硝酸铜(II)或者硝酸铁(III)，在极性溶剂如乙醇或者冰乙酸或者乙酸酐中，可引入一个或者多个硝基。
可根据文献中已知的方法引入卤素，例如在极性溶剂如四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、冰乙酸、或者二甲基甲酰胺中与溴、N-溴代或者N-碘代琥珀酰亚胺或者三溴化氢乌洛托品(urotropin hydrotribromide)反应。
硝基的还原可在极性溶剂中于室温或者高温下进行。作为还原反应的催化剂，合适的有金属如Raney镍或者贵金属催化剂如任选在载体上的钯或铂或氢氧化钯。替代氢气，例如也可按照已知的方式使用甲酸铵、环己烯或肼。也可使用还原剂如氯化亚锡(II)或者氯化钛(III)，如复合金属氢化物，任选存在重金属盐。也可使用铁作为还原剂。在酸如乙酸或者氯化铵存在下，任选添加溶剂如水、甲醇、铁/氨水等，进行反应。在反应时间延长时，可按该变化方式进行氨基的酰基化。
如果希望对氨基进行烷基化，则可根据通常使用的方法例如用烷基卤化物，或者根据Mitsonubo的方法通过在例如三苯基膦和偶氮二羧酸酯存在下与醇反应，进行烷基化。胺也可用醛或酮进行还原性烷基化，其中在还原剂如氰基硼氢化钠存在下，在合适的惰性溶剂如乙醇中，于0℃-溶剂的沸点温度下，进行所述反应。如果由伯氨基起始，则任选顺序地用两种不同的羰基化合物进行反应，由此得到混合衍生物(参考文献：Verardo等人，Synthesis(1993)，121；Synthesis(1991)，447；Kawaguchi，Synthesis(1985)，701；Mocovic等人，Synthesis(1991)，1043)。有利的是首先在溶剂中通过醛与胺的反应形成Schiff碱，其中溶剂例如是乙醇或甲醇，并任选添加辅剂如冰乙酸，然后仅添加还原剂如氰基硼氢化钠。
分子中烯基或炔基的氢化可按照通常的方法例如通过催化活化氢化来进行。对于催化剂，可使用重金属如任选在载体上的钯或铂，或者Raney镍。溶剂可为醇如乙醇。反应的温度为0℃-溶剂的沸点，压力最高至20bar，但优选在室温和常压下。通过使用催化剂例如Lindlar催化剂，可将叁键部分地氢化为双键，由此优选地制备Z-形式。
氨基的酰基化可根据Schotten-Baumann法在弱碱性pH的水溶液中，按照通常的方式用例如酰卤或者酸酐进行，其中任选存在碱如二甲基氨基吡啶，溶剂例如为二氯甲烷、四氢呋喃或吡啶，或者在冰乙酸中通过与酸酐的反应进行。
通过氨基引入卤素例如氯、溴、碘或叠氮基也可例如根据Sandmeyer法用重氮盐进行，该重氮盐是通过腈与氯化亚铜(I)或者溴化亚铜(I)的反应中间形成的，其中存在相应的酸，如盐酸或者氢溴酸，或者用碘化钾。
如果使用有机亚硝酸盐，通过例如添加二碘甲烷或者四硼甲烷，在溶剂如二甲基甲酰胺中可引入卤素。氨基的脱除可通过以下方法实现：在四氢呋喃中与有机亚硝酸盐反应，或者用例如磷酸进行重氮化并还原性蒸煮重氮盐，任选添加氧化亚铜(I)。
氟的引入可例如如下实现：通过四氟硼酸重氮盐的Balz-Schiemann反应，或者根据J.Fluor.Chem.76，1996，59-62，在HF-吡啶存在下进行重氮化，随后在任选存在氟离子源如四丁基氟化铵时进行蒸煮。
叠氮基的引入可在重氮化后通过室温下与叠氮化钠的反应来实现。
醚裂开可根据文献中已知的方法来进行。在此情况下，也可在分子中存在的几个基团中实现选择性的裂开。此时，例如在溶剂如二氯甲烷中，于-100℃至溶剂沸点、优选-78℃的温度下，用三溴化硼处理醚。但是，也可在溶剂如二甲基甲酰胺中用硫代甲醇钠进行醚裂开。反应温度可在室温-溶剂沸点的温度之间，优选在150℃。
诸如吡啶-2-酮或者2-羟基吡啶等的酰胺的N-烷基化或者O-烷基化可用文献中已知的方法实现。因此，N-烷基化可如下实现：在溶剂如二甲基甲酰胺中用碱如氢化钠或者碳酸钾，然后用烷基卤如碘甲烷进行烷基化。O-烷基化可如下实现：在溶剂如四氢呋喃或者甲苯或者优选它们的混合物中，用碱如碳酸银以及烷基卤如碘甲烷进行烷基化。O-烷基化也可在惰性溶剂如二氯甲烷中用三烷基四氟硼酸氧进行转化期间得到。在溶剂如甲醇或甲苯、优选它们的混合物中，于室温-溶剂沸点的温度、优选室温下，通过与叠氮甲烷或者三甲基甲硅烷基叠氮甲烷的反应得到由N-和O-烷基衍生物组成的混合物。该方法使得可以相对于苯甲酸酰胺选择性地对吡啶酮进行烷基化。
可根据常规使用的方法如结晶法、色谱法或者盐形成法，将异构体混合物分离为对映体或者E/Z异构体。
盐的制备可按照常规方法进行，使式I化合物的溶液与等量或者过量的碱或酸混合，这些碱或酸可任选在溶液中，然后分离沉淀物或者按照常规方法处理溶液。
以下实施例是对制备本发明化合物的解释，但本发明的范围绝不仅限于这些实施例。实施例1N-[2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-苯甲酸酰胺
1、将484mg的3-氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃引入至20ml二氯甲烷中。用冰冷却的同时，滴加0.42ml的三乙胺和0.40ml的2-硝基苯甲酰氯。在室温下搅拌4小时，蒸馏出溶剂，残留物用碳酸氢钠水溶液处理，并抽滤产物。得到0.88g的N-[2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-硝基-苯甲酸酰胺。由2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸(J.Org.Chem.，64，1033-1035(1999))根据Bonsignore and Loy，J.Heterocyclic Chem.，35，117(1998)制备3-氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃。
2、在氮气下将880mg的N-[2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-硝基-苯甲酸酰胺引入至30ml的乙醇中，然后与11ml的环己烯和176mg在炭上的氢氧化钯混合，并在110℃下搅拌2小时。过滤掉催化剂，然后蒸发浓缩滤液至几乎干燥状态。抽滤产物，得到593mg的N-[2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-氨基-苯甲酸酰胺。
3、在室温下将645mg的N-[2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-氨基-苯甲酸酰胺引入至50ml甲醇和170ml冰乙酸中，然后与0.38ml的4-吡啶甲醛混合。该混合物搅拌15小时，然后与206mg的氰基硼氢化钠混合。搅拌24小时，并抽滤结晶。将结晶与70ml的甲醇、40ml的冰乙酸和95μl的4-吡啶甲醛混合，接着搅拌48小时。添加57mg的氰基硼氢化钠，并搅拌15小时。抽滤产物，用甲醇洗涤，然后干燥。得到521mg的N-[2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-苯甲酸酰胺，其熔点为195-197℃。实施例2N-(6-氯吲唑-5-基)-2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-苯甲酸酰胺
194mg(0.85mmol)的2-(4-吡啶基甲基)氨基苯甲酸在8ml的二甲基甲酰胺中与283mg(1.69mmol)的5-氨基-6-氯吲唑混合。在氩气而且无湿气的环境中，在上述溶液中添加215mg(2.13mmol)的N-甲基吗啉和386mg(1.02mmol)的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸脲。该混合物在室温下搅拌4小时。然后用约40ml的水稀释，分别用30ml的乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相用水洗涤，干燥，过滤，然后蒸发浓缩。残留物在硅胶上进行色谱分离，其中用二氯甲烷∶乙醇＝10∶1作为洗脱剂。得到97mg(理论值的30.2％)的N-(6-氯吲唑-5-基)-2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-苯甲酸酰胺，其熔点为222.8℃。
按照类似的方法制备以下化合物：
以下的应用例用于说明根据本发明的化合物的生理作用和用途，但本发明的范围不限于这些实施例中。测试用溶液原料溶液原料溶液A：3mM ATP，在水中，pH7.0(-70℃)原料溶液B：g-33P-ATP 1mCi/100μl原料溶液C：poly-(Glu4Tyr)10mg/ml，在水中稀释用溶液底物溶剂：100mM的DTT，10mM氯化锰，100mM氯化镁酶溶液：120mM Tris/HCl，pH7.5，10μM氧化钒钠应用例1在根据本发明的化合物存在时对KDR-和FLT-1激酶活性的抑制作用
在向下变尖的微滴定板(没有蛋白结合)中，添加10μl的底物混合物(10μl体积的ATP原料溶液A+25μCi的g-33P-ATP(约2.5μl的原料溶液B)+30μl的poly-(Glu4Tyr)原料溶液C+1.21ml的底物溶剂)、10μl的抑制剂溶液(相应于稀释液的物质，3％DMSO在底物溶剂中，作为对照)、和10μl的酶溶液(11.25μg的酶原料溶液(KDR或者FLT-1激酶)于4℃下稀释在1.25ml酶溶液中)。充分混合，然后在室温下温育10分钟。接着添加终止溶液(250mM的EDTA，pH7.0)，混合，然后将10μl的溶液转移至P81磷酸纤维素过滤器上。用0.1M的磷酸洗涤多次。干燥滤纸，用Meltilex涂敷，然后在microbeta计数器中测量。
由抑制剂浓度确定IC50值，其是在除去空白读数(EDTA终止的反应)后将磷酸掺入抑制为未掺入的50％所需要的抑制剂浓度。
激酶抑制作用IC50的结果(μM)示于以下表中。应用例2C试剂盒分离的激酶抑制作用实验原料溶液10倍溶剂：400mmol的TrisHCl，pH7.5；10mM的DTT；10mM的氯
化锰；100mM的氯化镁；0.25％聚乙二醇20000抑制剂：2mM二甲基亚砜溶液底物原料液：3mg/ml的poly(Glu4Tyr)n水溶液，Sigma P275，冷冻部
分ATP原料液：37.5μM的ATP水溶液，设定在pH为7.5，冷冻部分10倍钒酸盐溶液：1mM钒酸钠水溶液停止溶液：250mM的亚乙基四胺乙酸(EDTA)，pH7.0过滤-洗涤溶液：0.5％磷酸测试溶液用于125分析的底物溶液：
10μl的ATP(37.5μM)、25μCi的γ33P-ATP(约+2.5μl的Amersham redivue溶液)和10μl的poly-(glu，tyr)与1.23ml的溶剂(1×)混合。抑制剂溶液：
在溶剂(1×)中使化合物达到所希望的浓度。酶溶液：
用溶剂(1×)使相应的酶制剂达到所希望的浓度，得到1.24ml。然后添加12.5μl的钒酸钠溶液。实验
按照以下顺序将各组分添加至圆底或者尖底微滴定板中：
10μl的抑制剂，3×最终浓度，
10μl的底物混合物，
混合上述组分，然后添加以下组分开始反应：
10μl的酶制剂。
反应液保温10分钟，然后通过添加10μl的停止溶液使反应停止。将10μl经过以上处理的反应液添加至磷酸纤维素过滤器中，在磷酸中重新洗涤，然后干燥，接着在meltilex闪烁器中熔融并测量。 实施例 KDR IC50(μmol/l) C-试剂盒 IC50(μmol/l) 1 0.003 6 2 0.2 ＞10 3 0.03 8 4 0.03 ＞10 5 0.01 ＞10 6 0.2 10 7 0.2 ＞10 9 0.04 10 10 0.01 ＞10 11 1 ＞10 13 0.05 5 14 0.001 5 15 0.002 2 17 KH ＞10 26 0.001 2 28 0.05 0.5 29 0.2 ＞10 30 0.02 10KH＝没有抑制